Plos ONE: Zadeva microRNA biomarkerjev v človeške želodčne raku: sistematični pregled in potrjevanje Study

Povzetek

rak želodca (GC) ostaja glavni vzrok obolevnosti in umrljivosti po vsem svetu in zato obstaja jasna potreba za iskanje za bolj občutljive zgodnje diagnostike biomarkerjev. Izvedli smo sistematični pregled osmih objavljenih miRNA profiliranje študijah, v primerjavi GC tkiva s sosednjimi noncancerous tkiv. MiRNA sistem razvrstitev je bila uporabljena, da je pogostost primerjavah smeri diferencialne izražanja in skupno velikost vzorca v obravnavi. Ugotovili smo pet miRNAs, ki so bile najbolj dosledno poročali, da se molekul (miR-21, miR-106b, miR-17, miR-18a in miR-20a) in dva miRNAs, ki so navzdol reguliranih (miR-378 in miR-638). Šest od teh je bilo nadalje potrjena v 32 parnih sklopov GC in sosednjih vzorcev noncancerous tkiva z uporabo PCR v realnem času. MIR-21, miR-106b, miR-17, so bili potrjeni miR-18a in miR-20a biti upregulatedin GC tkiva, medtem ko se je zmanjšala izraz miR-378. Poleg tega smo ugotovili pomembno povezavo med izražanjem miR-21, miR-106b, miR-17, miR-18a in miR-20a in clinicopathological značilnosti GC. Te miRNAs lahko uporabimo za diagnostične in /ali prognostičnih biomarkerjev za GC in zato zahteva dodatno preiskavo

Navedba. Wang J-L Hu Y Kong X Wang Z-H, Chen H-Y, Xu J, et al. (2013) Zadeva microRNA biomarkerjev v človeške želodčne raku: sistematični pregled in potrjevanje študija. PLoS ONE 8 (9): e73683. doi: 10,1371 /journal.pone.0073683

Urednik: William CS. Cho, Queen Elizabeth Hospital, Hong Kong

Prejeto: 16. maj 2013; Sprejeto: 19. julij 2013; Objavljeno: 9. september, 2013

Copyright: © 2013 Wang et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. To delo je podprta s sredstvi iz državnega Natural Science Foundation Key programa (št 30830055), Ministrstvo za javno zdravje, Kitajska (št 200802094), Ministrstvo za šolstvo (št 20090073110077) do Fang JY in fundacija Zdravnik Innovation Shanghai Jiao-Tong University School of Medicine (št BXJ201219) Wang JL. Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

Kljub nedavno zmanjšanje pojavnosti raka želodca (GC) [1], je še vedno vzrok za večje obolevnosti in umrljivosti po vsem svetu, še posebej v vzhodni Aziji. Skupaj enega milijona novih primerov GC je prišlo v letu 2008, z 738,000 smrti [2]. To predstavlja 8% vseh primerov raka in 10% vseh smrtnih primerov. Čeprav lahko endoskopija odkrivanje zgodnjih fazah GC, so v večini primerov še vedno diagnosticirali na višji stopnji, kar ima za posledico slabo prognozo [3]. Stopnja preživetja 5 let za primere GC s stopnjo II giblje od 30% do 50%, ampak sodi med 10% in 25% pri bolnikih s stopnjo III bolezni [4]. Čeprav endoskopskih tehnik hitro razvija, njihova vrednost za zgodnje odkrivanje GC je omejeno zaradi pomanjkanja občutljivosti, visokih stroškov in neprijetnosti. Nove diagnostične in prognostične biomarkerjev za GC so zato nujno potrebni.

MicroRNAs (Mirna) so kratke nekodirano RNK molekule 19-25 nt. Uravnavajo izražanje genov na post-translacijskih ravni vodenje-RNA inducirano dušenje zvoka kompleks do Mirne ciljna mesta v neprevedene regije 3 'mRNA, kar vodi do degradacije mRNA ali inhibicijo prevajanja [5]. Prejšnje študije so pokazale, da so številni miRNAs odklonsko izražena v veliko različnih vrst raka, in miRNA izraz profiliranje je pokazala nekatere miRNAs biti povezane z razvojem tumorja, napredovanja in odziva na zdravljenje. Zato so dobri kandidati za uporabo kot diagnostičnih, prognostičnih in predvidevanjem biomarkerjev [6].

Številne študije so bile izvedene za iskanje biomarkerjev z opredelitvijo diferencialne ekspresije miRNAs med vzorcev GC tkiva in ustreza non-tumorja na želodcu tkivo iz istega pacienta [7] - [14]. Te študije so privedla do identifikacije sto različno izraženih miRNAs. Vendar mnoge od teh so lahko lažno pozitivnih rezultatov, in majhen del se lahko uporablja le kot diagnostični ali prognostičnih biomarkerjev. Logično pristop za razlikovanje pomembnih miRNAs iz velikega števila kandidatk miRNA seznamov je iskanje stičišču miRNAs opredeljenih v več neodvisnih študij [15]. Čeprav je ta metoda postala povečanje priljubljen [15] [16] [17], ni objavljena študija je ugotovila križišč miRNAs povezanih z GC na podlagi velikega števila miRNA izražanja profiliranje študij.

smo opravili ta sistematični pregled, da ugotovijo najpomembnejše različno izražene miRNAs, da so bile dosledno poročali v seriji neodvisen miRNA izraznih profilov študij pri bolnikih GC. Poleg tega smo še dodatno potrjen nekaj miRNAs, ki so bili najbolj navzgor ali navzdol reguliranih uporabo PCR v realnem času v 32 parov GC in izravnanih sosednjih vzorcev ne-tumorskih tkiv.

Materiali in metode

etika Izjava

študija je odobrila etični odbor Shanghai Jiaotong University School of Medicine in pisno privolitev je bila pridobljena iz vseh bolnikih, ki ob vstopu v študijo.

Iskanje strategija

Potencialni študije, objavljene v angleškem jeziku so zbrani iz Medline z naslednjimi ključnimi besedami: "Mirna" ali "microRNA" ali "Mir", "v želodcu" ALI "želodec", "profiliranje" ali "mikromrež". Seznami referenc pregled člankov in izvirnih izdelkov, so ročno iskal dodatne dokumente.

Merila vključitev literature
Za študijo je treba vključiti v to sistematično pregleduje, je imela

več meril jih je treba izpolniti : 1) študije je bilo treba miRNA profiliranje študijah pri bolnikih GC; 2) študije so morali uporabiti GC tkiv in njihovih ustreznih sosednjih non-tumorskih tkiv za primerjavo; 3) metode moral vsebovati Mirne mikromrež tehnike. Poleg tega so bili vključeni le polno besedilo objave v angleškem jeziku. niso bili vključeni profiliranje študije, ki uporabljajo GC celičnih linij ali vzorce v serumu pri bolnikih, GC, tiste, ki v primerjavi GC biopsije pri tumorjih z različnih fazah bolezni, in tiste, ki uporabljajo različne Mirna tehnologije. Pregledni članki prav tako niso bili vključeni v ta sistemski pregled.

Podatki Pridobivanje in Seznami miRNA

različno izražene so bile ugotovljene miRNAs iz vsake vključene študije profiliranje. Pomembne informacije so določena (tj kromosomska lokacija, pre-miRNA dolžina, zrel miRNA zaporedje in potencialne tarče za miRNAs), in manjkajočih informacij je bilo ugotovljeno iz baze podatkov miRBase (www. Mirbase.org/~~HEAD=pobj) in PubMed.

lestvica

Vsak vključena študija profiliranje [7] - [14] predložila seznam različno izraženih miRNAs (tabela S1). Griffith in Chan razvila metode za uvrstitev potencialne molekularnih biomarkerjev za primerjavo skupin [16], [17], ki je bil uporabljen za miRNA profiliranje študij. Na primer, Ma in sod. [15] opredelila križišč debelega povezane z rakom miRNAs temelji na velikem številu miRNA profiliranje študij. Tako so bila merila za literaturo vključene v sedanjem sistematičnega pregleda na podlagi tistih, ki v svojih poročilih [15]. MiRNAs so bili uvrščeni na merila v naslednjem vrstnem redu glede na pomembnost: (i) miRNA dosledno poročali različno izražena dosledno smeri sprememb; (Ii) pogostnost miRNA so poročali v študijah mikromrež; (Iii) skupno velikost vzorca za vsako dosledno poročal miRNAs.

Potrditev miRNAs Uporaba Real Time PCR

Za potrditev profiliranje rezultate, 32 svežih GC tkiva in njihove seznanjenih non-tumorja želodca tkiva so bili pridobljeni iz bolnišnice Renji, povezan z Shanghai Jiaotong University School of Medicine. Total RNA je bila vzeta iz 32 parov izravnanih GC vzorcev za humano uporabo (vključno z rakom in sosednjih noncancerous tkiv), ki uporabljajo TRIzola reagenta (Invitrogen). Koncentracija RNA in čistost je bila izmerjena z uporabo Nanodrop ND-2000, in je bila uporabljena metoda merjenja absorpcije ultravijolične svetlobe za ugotavljanje čistosti RNA, le tiste A260 /A280, ki se nahaja med 1.80-2.00 in A260 /A230 > 1,7, so bili uporabljeni za končni poskus, sicer RNA treba ponovno ekstrahirali. Reverzno transkripcijo od 3 ig RNA je bila opravljena usingAll-v-OneTM First-Strand cDNA zbirno Kit (Genecopoeia, Guangzhou, Kitajska), v skladu s protokolom proizvajalca. Na kratko, je pripravljena RNK reverzna transkripcijska reakcija Raztopino inkubiramo pri 37 ° C za 60 minut in konča pri 85 ° C za 5 minut, nato pa shranili pri -20 ° C nadaljnjo analizo. Kvantitativni PCR (qPCR) je bila izvedena s pomočjo sistema za ABI Prism 7900HT Sequence Detection (Applied Biosystems, ZDA) z SYBR premiks Ex Taq II (Takara). Primerji (miR-21-5p, miR-106b-5p, miR-17-5p, miR-18a-5p, miR-20a-5p in miR-378-5p), vključno z U6 so bili pridobljeni iz Genecopoeia (Guangzhou, Kitajska) . Količinska bila izračunana na osnovi 2 -ΔΔCT metodo in je predstavljen kot normalizirane vzorec.

Statistična analiza

Rezultate smo analizirali s SRS 9.2 programske opreme (SAS Institute Inc. ZDA). Podatki so prikazani kot sredstva ± SD. T-test smo uporabili za primerjavo vrednosti med dvema neodvisnih skupin.

Rezultati

Izbor literature in študija Značilnosti

skupaj 104 raziskav so iskali v PubMed uporabo našega iskanje strategija, 73, od katerih so bile izključene po presejanje naslove in povzetke. 23 Študije so bile izključene po branju celotnega besedila. Le osem študije so bile na koncu zajetih v sistematičnem pregledu. Podroben Izbira študija je prikazano na sliki 1. Podrobna značilnosti vsake študije so podane v tabeli 1.

različno izražena miRNAs

skupaj 223 različno izraženih miRNAs so poročali v osmih mikromrež študije (različno izražena miRNAs v vsaki študiji je navedeno v tabeli S1); 124 so povečana pri GC, in 99 so navzdol reguliranih. Med 223 različno izraženih miRNAs, 48 ​​so poročali v najmanj dveh študij; 39 (81,3%) je dosledno smer in devet (18,7%) je imela dosledne smer spremenjenega izražanja. Med nekdanjo 39, 20 so povečana pri GC, in 19 so navzdol reguliranih. Tri od teh miRNAs so poročali v petih študijah mikromrež (MIR-21, miR-106B in miR-378), štiri so poročali v štirih študijah (MIR-17, miR-18a, miR-20a in miR-638), in sedem so poročali v treh študijah (miR-19a, miR-20B, miR-25, miR-30D, miR-923, MIR-375, in miR-148a). Njihove kromosomske lokacije, pre-MIRNA dolžine, zrele sekvence in potencialni cilji so navedeni v tabelah 2-4.

Potrditev izbrane miRNAs v GC Bolniki

Za potrditev izražanje šestih najbolj dosledno poročali miRNAs (MIR-21, miR-106B, MIR-17, miR-18a, miR-20a in MIR-378), so izraz teh miRNAs v GC biopsije in sosednjih noncancerous tkiva v primerjavi v 32 primerih GC uporabe PCR v realnem času. Surove vrednosti Ct od šestih miRNAs so bili prikazani v rezultatih Tabela S2.The je pokazala, da je bila miR-378 navzdol reguliranih v GC tkivih, medtem ko ostalih petih miRNAs (MIR-21, miR-106B, MIR-17, miR-18a in MIR -20a) so povečana pri GC (slika 2). Naši rezultati so bili skladni s tistimi iz prvotne študije profiliranja. Poleg tega smo raziskovali odnos med izražanjem teh miRNAs s kliničnimi in patoloških značilnosti GC. Ugotovili smo, da je bil izraz pokoj-21 bistveno višja v primeru primerih GC z večjim tumorskih (≥8 cm), slabo diferenciacijo in metastaz s prizadetostjo bezgavk in kasnejši fazi bolezni. MIR-106b, miR-17 in ravni miR-18a so bile precej višje na slabo diferencirano GC, primeri s prizadetostjo bezgavk, ali poznem stadiju bolezni, medtem ko so bile ravni miR-20a bistveno višja v primeru GC s prizadetostjo bezgavk. Vendar pa ni bilo razmerje med količino izražanja miR-378 in clinicopathological značilnosti GC. Ti rezultati so podrobno opisani v tabeli 5.

Pogovor

Mirna študije mikromrež zagotavljanje količine informacij, vendar skupno pomanjkljivost je pomanjkanje doslednosti med različnimi študijami. Po poročilih Griffith et al. Chan s sod. [16] [17], logična rešitev tega problema bi bilo ugotoviti skladnost med različnimi študijami uporabljajo različne mikromrež platforme. Več sistematični pregledi [15] - [17] so uporabili to metodo za določanje različno izraženih genov ali miRNAs v različnih bolezenskih stanj. Uporaba podoben način, smo ugotovili, da je bilo skupno 48 različno izraženih miRNAs poročali pri vsaj dveh neodvisnih študij, med osmimi GC miRNA profiliranje študij [7] - [14]. Med njimi je bilo prijavljenih 39 miRNAs treba spremeniti dosledno smeri, medtem ko so bile ugotovitve za devet neskladju. Med 39 miRNAs, ki so imeli dosledne spremembe, je bilo 20 miRNAs dosledno povečana pri GC primerjavi z noncancerous želodčnega tkiva, in 19 so bile dosledno navzdol reguliranih v GC. Identificirali smo pet miRNAs, ki so bile najbolj dosledno molekul (MIR-21, miR-106a, MIR-17, miR-18a in miR-20a) in dve najbolj dosledno navzdol reguliranih (miR-378 in MIR-638) v vsaj štirih profiliranje študije. Nato smo potrjeni te ugotovitve z uporabo PCR v realnem času, kar še dodatno podpira ugotovitve tega sistematičnega pregleda. Ugotovili smo tudi, da je izražanje teh miRNAs soodvisnih z clinicopathological značilnosti GC, ki kažejo, da so lahko te miRNAs uporaben kot biomarkerjev za GC.

Ena izmed najbolj dosledno poročali molekul miRNA v našem sistematičnega pregleda je miR -21, ki je spremenil izraz in onkogenega dejavnost v različnih oblikah raka. Cui sod. [18] pokazala, da je izraz miR-21 bistveno večji GC tkivu v primerjavi s sosednjimi normalnega tkiva. Izraz miR-21 je bilo tudi ugotovljeno, da je večje pri bolnikih z GC z bezgavkah metastaze kot tisti brez, in je tudi bistveno povezana z histološki tip tumorja in stopnji pTNM [19], ki jih je potrdil naše raziskave. Poleg tega višje stopnje izraženosti Mir-21 napovedano slabo preživetje pri bolnikih z GC [19]. Druge študije so pokazale, da lahko miR-21 spodbujanje tumorskih in vdor v GC tako, da zavira izražanje PTEN ali PDCD4 [20], [21]. Poleg tega so prejšnje študije pokazale tudi onkogenega aktivnosti miR-21, kolorektalnega raka [22], raka dojke [23] in raka na požiralniku [24].

MIR-106b je tudi dosledno poročali kot molekul miRNA v GC tkivo, ki ga je ta in prejšnje študije [14], [25]. Visoka izraz pokoj-106b je bil prej povezan z bezgavkah metastaze [25], [26], in to je bila potrjena v naši raziskavi. Kim et al. [27] je pokazala, da lahko miR-106b uveljavila svoj onkogenega dejavnost z ukinitvijo p21 izraza v GC. MIR-106b lahko povzroči epitelijskih-to-mezenhimskega prehodu (EMT) in tumorja začetek celičnega fenotipa pri raku dojk z usmerjanjem Smad7 in Six1 in aktiviranje TGF-ß signalizacija [28]. To lahko spodbuja tudi proliferacijo celic v karcinomom človeški jetrnih s downregulating izražanje APC [29].

MIR-17 je znan onkogenega aktivnosti pri ljudeh, in je bilo ugotovljeno, da je povečana pri 77,2% vzorcev tkiva GC v primerjavi s sosednjimi normalno želodčnega tkiva. Spodbuja napredovanje celičnega ciklusa in zavira apoptozo v GC, ki ga ciljanje p21 in p53INP1 (tumor protein p53-inducirane jedrske protein 1) [30]. V obtoku ravni miR-17 so zvišane pri bolnikih, GC, in koncentracija pokoj-17 je značilno povezana s stopnjo TNM in razredu GC [31]. Vendar pa naša študija je pokazala, da je bil izraz pokoj-17a višja v primerih GC brez bezgavkah metastaze kot tisti z prizadetostjo bezgavk, ki bi lahko bili posledica majhnega vzorca v naši raziskavi. Visoka izraz pokoj-17 je pomembno povezana s slabimi rezultati preživetja [31]. Prejšnje študije so tudi ugotovili, da ima miR-17 onkogenega dejavnost kolorektalnega raka [32], raka dojke [33] in raka trebušne slinavke [34].

MIR-18a je bilo ugotovljeno, da je povečana pri štirih študijah, v tem sistematični pregled, ki je znano, da imajo onkogenega aktivnosti pri ljudeh. Wu et al. [35] pokazala, da je izraz miR-18a znatno povečana pri GC tkivu primerjavi z običajnim želodčnega tkiva in lahko direktno ciljno PIAS3 (proteinski inhibitor aktiviranega signala pretvornik in aktivator transkripcije 3) in je bil v pozitivni korelaciji s stopnjami survivin, Bcl-xl in c-myc. Poleg tega je bila Povecanje miR-18a poročali nazofaringealnega karcinoma [36], raka trebušne slinavke [37], karcinomom jetrnih celic [38] in raka dojke [39].

Mir-20a je drugo miRNA s onkogeni dejavnost, in je bilo ugotovljeno, da je povečana pri štirih raziskavah v tej literaturi. Dokazano je, da je v obtoku raven miR-20a znatno povišano bolnikih GC primerjavi z zdravimi kontrolami, kar je bistveno povezan s stopnjo in stopnjo tumorja [31], [40]. Naša raziskava je tudi ugotovila, da je bila miR-20a močno povišano GC tkivih in je bila značilno povezana z bezgavkah metastaze. Poleg tega je bilo že ugotovljeno, da je Povecanje miR-20a v raka materničnega vratu, raka na prostati in raka jajčnikov, in to miRNA lahko spodbudi proliferacijo celic ali vdor teh raka [41] -. [43]

najbolj dosledno navzdol reguliranih Mirna v tem sistematičnem pregledu je miR-378, ki je bilo ugotovljeno, da je navzdol reguliranih v petih študijah. MIR-378 je bilo dokazano, da so anti-onkogenega aktivnost pri ljudeh [44]. Eksogeni izraz miR-378 izrazito zavira proliferacijo GC celic z ukinitvijo CDK6 in VEGF signalizacije [44]. V naši raziskavi, čeprav smo ugotovili, da je bila ekspresija miR-378 navzdol reguliranih v GC tkivih, ni bilo razmerje med količino izražanja miR-378 in clinicopathological značilnosti GC. To bi lahko bilo zaradi majhne velikosti vzorca te študije. Je tudi poročali, da je miR-378 občutno navzdol reguliranih v kolorektalnega raka, in lahko igrajo pomembno zaviralnih vlogo pri tem raku [45]. Vendar pa so druge študije pokazale, da ima lahko miR-378 onkogenega dejavnost na drugih vrstah raka [46] - [49]. Zato je treba natančno vlogo miR-378 v rakotvornosti je treba dodatno pojasniti.

Poleg tega smo tudi ugotovili, da so bili nekateri miRNAs kandidatk, opredeljenih v naši raziskavi slso opredeljena kot serumskih biomarkerjev v različnih vrst raka. Na primer, je bil serum miR-21 znatno povišano perioperativne seruma adenomov in kolorektalnega raka (CRC), in je bil neodvisen prognostični marker za CRC [50], [51]; Plasma miR-106b, skupaj s pokoj-20a in miR-221 imajo potencial kot novih bioloških označevalcev za zgodnje odkrivanje raka želodca [40]; Obtoku miR-17 se lahko uporablja kot nova neinvazivno biomarker za nazofaringealnega karcinoma [52], rak želodca [53] in CRC [54]; Serum miR-18a se lahko uporabi kot nova biomarker pri raku dojke [55], kolorektalnega raka [56], hepatocelularni karcinom [57] in raka trebušne slinavke [58]; Obtoku MIR-378 lahko uporabimo kot biomarker pri karcinoma ledvičnih celic [59] in rak želodca [60]. Te študije je potrdil pomen razpoznavna miRNAs, in se lahko razširi obseg uporabe teh miRNAs.

Skratka, naš sistemski pregled identificirali pet molekul miRNAs (MIR-21, miR-106B, MIR-17, miR-18a in miR-20a) in eno navzdol reguliranih miRNA (miR-378), ki so potencialni novi biomarkerji za GC. Te miRNAs se je izkazalo, da ima diagnostiko in /ali napovedni možnosti za te vrste raka, in upravičujejo nadaljnje preiskave. Nadaljnje raziskave, ki se osredotočajo na teh miRNAs bo pomagalo določiti ploščo diagnostičnih in prognostičnih GC biomarkerjev z ustreznimi stopnjami občutljivosti in specifičnosti.

Podpora Informacije
Tabela S1.
različno izražena miRNAs ugotovljene v vsaki vključene študije
doi:. 10,1371 /journal.pone.0073683.s001
(XLS)
tabeli S2.
Raw Ct vrednost izbranih miRNAs
doi:. 10,1371 /journal.pone.0073683.s002
(XLS)
Tabela S3.
PRISMA Kontrolni
doi:. 10,1371 /journal.pone.0073683.s003
(DOC)

Priznanja

Zahvaljujemo se gdč Wei-Feng Qu za njeno odlično uvodniku delo.

• Plos ONE: genskega polimorfizma v TOX3 je povezana s preživetjem želodca raka v kitajski Prebivalstvo
• Plos ONE: Potencial Vloga microRNA-21 pri diagnozi želodčnega raka: metaanalizi