Plos ONE: The Apoptotsko Vpliv HIF-1 a Zaviranje V kombinaciji z glukoza plus Insulin zdravljenja na Rak želodca pod hipoksičnih razmer

Povzetek

rak želodca raste pod hipoksično okolje. HIF-1α Znano je, da ima pomembno vlogo pri nadzoru proizvodnje reaktivnih kisikovih vrst (ROS) v mitohondrijih pod hipoksičnih pogojih. Smo že ustanovljena celice HIF-1 a rasklapanje (KD) in nadzor (SC), celice v 58As9 želodčni rak celične linije. V tej študiji, smo razkrili, da so KD celice, ne pa tudi SC celic, inducirane apoptoze v pogojih hipoksije (1% O _{2) zaradi prevelike proizvodnje ROS. Kvantitativno RT-PCR analiza je pokazala, da se izrazi deset genov, ki sodelujejo pri nadzornih mehanizmih ROS (vključno z Warburg učinek, mitophagy, elektronski transportni verigi [ETC] sprememba in ROS lovljenja prostih), je urejal HIF-1 a. Poleg tega je spodbujanje glukoze privzem z glukozo plus insulina (GI) zdravljenjem izboljšala apoptotske učinek, ki je bil skupaj z nadaljnjo proizvodnjo ROS v hipoksičnih KD celicah. Western blot analiza je pokazala, da je membranska izraz GLUT1 v KD celicah zvišane z glukozo in /ali zdravljenje inzulina, kar kaže, da je privzem glukozo GI povzroča posredovano s povečano prenosom GLUT1 na celične membrane. Na koncu se je anti-tumor učinek HIF-1 a rasklapanje (KD) plus GI ovrednotili s pomočjo modela tumor ksenotransplantskih, kjer seveda o obstoju hipoksično okolje. Kot rezultat zdravljenja GI močno inhibira rast KD tumorjev pri čemer je celica apoptoza visoko induciranih v primerjavi z zdravljenjem nadzora. V nasprotju s tem pa se je rast od SC tumorjev, ki izražajo HIF-1 a ni vplivala zdravljenje GI. Vzeta skupaj, rezultati kažejo, da lahko zaviranje HIF-1α plus GI idealna terapija, saj je apoptozo zaradi uničenja ROS homeostaze raka želodca, ki raste pod hipoksične okolju posebej inducirano, vendar ne v normalnem tkivu pod aerobni pogoji}

Navedba:. Tanaka T, Kitajima Y, Miyake S, Yanagihara K, Hara H, Nishijima-Matsunobu A, et al. (2015) apoptoze Vpliv HIF-1α Zaviranje kombinaciji z glukoza plus Insulin zdravljenja na Rak želodca pod hipoksičnih pogojih. PLoS ONE 10 (9): e0137257. doi: 10,1371 /journal.pone.0137257

Urednik: Ester Hammond, University of Oxford, Velika Britanija

Prejeto: 30. april 2015; Sprejeto: 13. avgust 2015; Objavljeno: 4. september 2015

Copyright: © 2015 Tanaka et al. To je prost dostop članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Razpoložljivost podatkov: Vsi pomembni podatki so v papir in njene dodatne informacije datotek

financiranje:.. avtorji nimajo podpore ali sredstva za sporočanje

nasprotujočimi si interesi. avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

hipoksično okolje je bistven solidnih tumorjev, kjer se pospeši svoje maligne vedenja [1-4]. Kot pri drugih solidnih tumorjev, je rak želodca znano, da gre obširna območja hipoksija v tumorju [5-7]. Hipoksično pogoji povzroči več bioloških dogodkov, kot angiogenezo, lokalna invazija, metastaze, radio ali chemoresistance in spremenjeno presnovo energije v številnih karcinomov, kar je povzročilo slabo prognozo pri bolnikih, [2-4].

transkripcijski faktor hipoksija-inducibilnih faktor 1 (HIF-1) je glavni mediator mobilnega prilagajanja na hipoksijo [8-10]. HIF-1 je heterodimerni protein, ki sestoji iz konstitutivno izražen β-podenote (HIF-1β) in hipoksija-inducibilnih α (HIF-1α) podenota [8-10]. HIF-1α podenota se razgradi s ubikvitina-proteasoma poti pod normoxia. Nasprotno, v skladu s hipoksijo, je HIF-1α stabiliziran in dimerizes z HIF-1β v stiku z CBP /p300, ki nato veže na odzivnosti hipoksija element (HRE) je na promotorja regiji sto ciljnih genov [11-16]. Ta prejšnjih poročilih so privedli do priznanja HIF-1 a kot osrednji regulator v patogenezi raka trdnih

reaktivnih kisikovih spojin (ROS), kot so superoksid aniona (O _{2 ^{. - ), vodikov peroksid (H 2O 2) in hidroksi ostanek (HO •), sestavljena iz radikalnih in brez radikalne vrste kisika, narejenih z delnim zmanjšanjem kisika. Intracelularni ROS so večinoma nastaja v mitohondrijih, ki ga oksidativne fosforilacije (OXPHOS), ki ga vodi elektronov transportni verigi (ETC) izvaja [17]. Ko ROS preplavijo celični antioksidant obrambnega sistema, pride do oksidativnega stresa. Prekomerno oksidativni stres povzroča ROS posredovano škodo nukleinskih kislin, proteinov in maščob ter vodi v celično smrt [17, 18].}}

HIF-1α so poročali, da nadzor proizvodnje ROS pod hipoksičnih pogojih prek različnih mehanizmov vključno s pretvorbo presnovo energije iz OXPHOS do glikolize, ki se imenuje učinek Warburg [19-23], indukcijo mitohondrijske selektivno avtofagija (določen kot mitophagy) [24, 25], ETC spremembi, ki jo stikalom podenote v citokroma c oksidaza (COX) [26] in ROS mrhovinarji [27]. V presnovno pot učinka Warburg, HIF-1α najprej aktivira transkripcijo GLUT1
se poveča privzem glukoze v celice. Glukoza je potem presnavlja v piruvat z dejanji glikoliticna članov encimov, ki so znani cilji za HIF-1 a [28, 29]. Ob aerobnih pogojih, je piruvat pretvori v acetil-CoA (AcCoA) z piruvat dehidrogenaze (PDH) za vstop v trikarboksilne kisline (TCA) cikel. Nasprotno, v rakavih celicah izpostavljenih hipoksijo, je piruvat ranžirajo od mitohondrije, pri čemer HIF-1α upregulates izraz PDK1 da zavira aktivnost PDH. Zatem LDHA alternativno pretvarja piruvat za laktat in MCT4 transportira laktata iz celice. Ti geni so urejene tudi HIF-1 a [16, 30, 31]. Hipoksija povzroči mitophagy da se prepreči prekomerno ROS proizvodnje, s katerim so poškodovani mitohondriji izpadli preko lizosomalne prebavo [24, 25]. Nedavne študije so pokazale, da HIF-1α aktivira prepisovanje genov, ki kodirajo BNIP3 in BNIP3L, bistvenih dejavnikov v procesu mitophagy [32]. Druga študija je poročala, da HIF-1α ureja COX4 podenoto preklapljanje z aktivacijo transkripcije, povezanih z ETC genov COX4-2 in LON, mitohondrijski proteaz, ki je potrebna za razgradnjo COX4-1 pod hipoksije [26]. Podenote stikalo COX4 so poročali, da gre za pomemben korak v ROS homeostaze, zaradi svoje vloge pri optimizaciji učinkovitosti dihanja pod hipoksije [26]. ROS odstranjevalec MnSOD je znana za pretvorbo superoksid radikale vodikovega peroksida. Predhodna raziskava je poročal, da je MnSOD molekul pod hipoksije, čeprav, če je to Povecanje posreduje HIF-1 a še ni bilo dokazano, [27]. V zadnjem času, še eno poročilo, je pokazala zanimive ugotovitve, da so embrionalne fibroblaste (MEFs) hipoksične HIF-1α-null miši umrl zaradi presežne proizvodnje ROS, medtem ko so MEFs rešili z obdelavo z antioksidantom N acetil-L-cistein (NAC) [ ,,,0],33]. Če povzamemo, ti poročila kažejo, da ima HIF-1α osrednjo vlogo pri organizaciji mitohondrijske proizvodnjo ROS v žive celice pod hipoksijo.

V tej študiji smo želeli vzpostaviti terapevtski model, ki dokazuje, da je, hipoksije inducirano apoptozo preko prekomerna proizvodnja ROS je mogoče uvesti HIF-1α pomanjkanjem želodčne rakavih celic. Mi najprej ugotoviti, ali hipoksija inducira celično smrt v zvezi s čezmernim proizvodnjo ROS v HIF-1 a rasklapanje (KD) celic. Nato smo obravnavali hipotezo, da lahko uvedba visokih ravni glukoze z obdelavo KD celic z insulinom okrepitev apoptotske učinek. Končno, z uporabo modela tumor ksenotransplantskih, smo predlagali, da se lahko HIF-1α zaviranje v kombinaciji z glukozo plus insulina (GI) zdravljenje potencialno zdravilo za raka želodca.

Materiali in metode

celične kulture pogoji in reagenti

želodčni rak celično linijo 58As9 je prijazno, ki jih Dr. K. Yanagihara (National Cancer Center Hospital vzhodu, Chiba, Japan), decembra leta 2009. celične linije 58As9 je bila prvotno ustanovljena od scirrhous želodca, karcinom izvira celična linija HSC-58 [34]. Ta celična linija je bila nato še dodatno overjeni februarja 24 ^{th, 2015, ki ga JCRB Cell banke (Osaka, Japonska). Druga želodčni rak celično linijo, MKN74 je bila kupljena iz celic banke RIKEN Bio Resource Center (Tsukuba, Japonska). V tej raziskavi smo uporabili stabilne HIF-1α rasklapanje celice KD in 74-KD, ki so jih uvedli v transfekciji z siRNA plazmida zatočišča na RNAi sekvence v celicah 58As9 in MKN74 kot prej [7, 35] je opisano. Sekvence siRNA ciljanje HIF-1 a in nadzor umešana siRNA so bili zasnovani kot sledi: HIF-1α siRNA za KD ali 74-KD (5'-CCA CAT TCA CGT ATA TGA T-3) in pehanje siRNA za SC ali 74- SC (5'-TCT HA TCG CGT ATA AGG C-3 '). Celice smo kultivirali v RPMI-1640 medij (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO, ZDA), dopolnjenem z 10% toplotno deaktiviranega fetalnega govejega seruma (FBS) in 100 mg /ml kanamicin (Meiji, Tokyo, Japan ) in inkubirali pri 37 ° C v navlaženi atmosferi. Celice smo gojili pod bodisi normoxic pogojih (20% O _{2 in 5% CO 2 v zraku) ali hipoksično pogoji (1% O 2, 5% CO 2 in 94% N 2) na hipoksične komore (ASTEC, Fukuoka, Japonska), in nato obdelamo z NAC (Sigma-Aldrich) in insulinom (WAKO, Osaka, Japonska) pri končni koncentraciji 5 mM in 500 ng /ml oz. Koncentracija medija visoko glukozni bila pripravljena z dodajanjem 45% D - (+) - Glukoza raztopine (Sigma-Aldrich) in končno koncentracijo določimo, da je 10 g /L, ki je 5-krat večja kot pri normalni RPMI-1640 medij.}}

preživetja celic test

preživetja celic pod normoxia ali hipoksije je ocenil trypan blue barvanje izključitev testih. Za vrednotenje učinkov zdravljenja odvisnosti od drog, vključno z NAC, visok glukoze in /ali inzulina na sposobnost preživetja celic, 1 x 10 ^{5 celice zasejemo na posodo 6 cm kulture. Celice smo obdelali z različnimi zdravili pri navedenih koncentracijah in kultiviramo pod normoxia ali hipoksije 24 h do 96 h. Na koncu inkubacije, so plavajoče in sprijete celice zberemo in kroglic s centrifugiranjem (3000 rpm, 5 min). Celice smo ponovno suspendirali v 90 p.L v kompletnem mediju, mešanih z 10 ml 0,4% trypan modro raztopino in šteje s pomočjo hemocitometer pod mikroskopom. stopnja celične smrti smo določili kot razmerje med številom mrtvih celic /celotno število celic. Vse eksperimente smo izvedli v trojniku in neodvisno ponovi vsaj trikrat.}

Western blot analizo

Cela lizate celic iz kultiviranih celic in ksenograftov tumorjev pri miših smo pripravili ob uporabi lizni pufer sestavljen iz 150 mmol /L NaCI, 50 mmol /L Tris-HCl (pH 7,6), 0,5% Triton X-100 in inhibitor proteaze koktajl mešanice (Roche, Mannheim, Nemčija). Celični lizati od frakcij in celične membrane frakcije citosolnega smo pripravili s pomočjo citokroma c sprošča Apoptoza testu Kit in plazemske membrane protein ekstrakcijo Kit (BioVision Inc., Milpitas, CA, ZDA) v skladu z navodili proizvajalca. Blot analizo Western smo izvedli kot je opisano predhodno [7]. Alikvote, ki vsebujejo 30 ig proteina so elektroforetsko ločili v 4-12% Bis-Tris Gel (Invitrogen) in prenese na za Amersham Haybond-ECL membrano (GE Healthcare, Buckinghamshire, Združeno kraljestvo) v pufru za prenos. Po blokiranjem s 5% mleka kožo 30 minut smo membrano inkubirali s primarnimi protitelesi, preko noči pri 4 ° C. Uporabljene so bile naslednje osnovne protitelesa: anti-HIF-1 a (1: 1000 redčenje, Abcam, Cambridge, Velika Britanija), anti-razcepi kaspaze 3 (1: 1000, celična signalizacija Technology, Danvers, MA), anti-citokrom c (1 : 500 redčenje, BioVision), anti-GLUT1 (1: 100.000 redčenje, Abcam) in anti-β-aktina (1: 10.000 redčenje, Sigma-Aldrich, Inc.). Po inkubaciji z ustreznimi sekundarnimi protitelesi, so bile razvite signali z uporabo sistema za Amersham ECL Plus Western blot Detection (GE Healthcare).

bile ocenjene Odkrivanje znotrajcelične ROS s pretočno citometrijo

vrednot znotrajcelične ROS uporabo ROS Detection Kit celoto (Enzo Life Sciences, Inc., Farmingdale, NY, ZDA) v skladu z navodili proizvajalca. V kratkem, KD, SC, smo celice kultiviramo pod pogoji, bodisi normoxia ali hipoksije z ali brez zdravljenja drog (tj, NAC, visoko glukozo in /ali insulina) za 24 ur, 48 ur in 72 ur. 74-KD in 74-SC bili kultivirani tudi pod pogoji, bodisi normoxia ali hipoksije 24, 48 in 72 urah brez zdravljenja odvisnosti od drog. Celice smo sprali in ponovno suspendirali v raztopini odkrivanja ROS. ROS fluorescence je bila odkrita s tokom FACS Calibur citometrom (Becton-Dickinson, San Jose, CA) in analizira programa Cell Quest programske opreme. Vse eksperimente smo izvedli v treh izvodih. Povprečni fluorescence proizvodnje ROS smo določili samodejno in predstavljen kot GSO pomeni.

Total ekstrakcijo RNA in kvantitativno RT-PCR

Total RNA je bila vzeta iz celičnih linij z uporabo kit Isogen RNA ekstrakcijo ( Nippon Gene, Osaka, Japonska). Eden ig RNA je bila spremenjena v cDNA s pomočjo ReverTra Ace (Toyobo) reverzna transkripcija reakcija kit. CDNA smo uporabili kot predlogo za PCR. Pravi času kvantitativne RT-PCR (RT-qPCR) je bila izvedena s pomočjo sistema svetlobe ciklerja instrumenta (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Nemčija) z uporabo svetlobnega ciklerja-FastStart DNA Master SYBR Green I komplet (Roche). Deset geni, ki so bili analizirani z RT-qPCR so bile naslednje: glukoza transporter 1 ( GLUT1
), aldolase C ( ALDOC
), piruvat dehidrogenaze kinaze 1 ( PDK1
), laktat dehidrogenaza A ( LDHA
) in monocarboxylate transporter 4 ( MCT4
), Bcl-2 /adenovirus EIB 19-kDa interakcije protein 3 ( BNIP3
), BINP3 kot ( BNIP3L
), mitohondrijski mangan superoksid dismutaza ( MnSOD
), mitohondrijski proteaza LON
in citokrom oksidaza podenote 2/4 ( Cox4 - 2
). Primerji so bili oblikovani v skladu z poročali cDNA sekvenc (GenBank, Bethesda, MD) (tabela 1). Po izvedbi koraka denaturacija pri 95 ° C za 3 min smo izvedli PCR z 50 ciklov po 15 sekund z denaturacijo pri 95 ° C, 5 oziroma za žarjenje pri 60 ° C in 10 oziroma za podaljšanje pri 72 ° C. Količinske vrednosti smo normalizirali na P-aktina ( ACTB
) izražanja (tabela 1). Vse poskuse smo izvajali v treh izvodih in neodvisno ponoviti vsaj trikrat.

Glukoza privzema test

privzema glukoze v kultiviranih celicah je bila določena z uporabo 2-dezoksiglukoze (2DG) Uptake Merjenje Kit (Cosmo BIO Co Ltd, Tokio, Japonska). Na kratko smo celice kultiviramo pod pogojem, serumu izstradana za 6 ur, čemur sledi nadaljnja gojenju 18 ur v rednem mediju, dopolnjenih z 10% FBS. Celice inkubiramo 24 ur pod normoxia ali hipoksije. Zatem smo celice obdelali z ali brez 500 ng /ml insulina za 18 minut. Končno smo celice obdelali s 2DG 20 minut in izpostavimo merjenje vnosa 2DG v skladu z navodili proizvajalca. Vse poskuse smo izvajali v treh izvodih in so bile izračunane povprečne vrednosti.

Študije na živalih

Protokoli živali so dobile dovoljenje z oskrbo in uporabo odborov Institutional živali v Saga Univerze (protokol 24-008-0 ), in skladna prispejo smernice za uporabo živali pri raziskavah na. Ženska 4 tedne stare atimičnih BALB /ca JCL miši (nu /nu) so bili pridobljeni iz Nihon Crea Co (Osaka, Japonska). Živali so bile v skladu s pogoji za posebno brez patogenov. Jim je bila dana sterilno hrano in avtoklavni vodo s 12-h svetlobe in teme cikla. Miši so se uskladijo z okoljem 7 dni pred poskusi. KD ali SC celice (3 x 10 ^{6) smo podkožno injicirali v nasloni miših (n = 9 za vsako celične linije). Deset dni po subkutani inokulaciji se ksenotransplantati obeh celic postala otipljiva. Devet miši, ki nosijo KD ali SC ksenografi bile nato razdeljene v tri skupine za zdravljenje z glukozo (8 g /kg /dan, Sigma), glukoza plus insulin (GI) (1 enota na 3 g glukoze /dan, Wako) ali fosfat-pufrom s soljo (PBS), kot je zdravljenje nadzora. Vsak od teh zdravil so intraperitonealno dajali v tri miši (šest tumorji skupaj) vsak 24 h od 1. do 11. V tem obdobju so se tumorji merijo v 2 pravokotnih dimenzij, z debelino vsake štiri dni. Velikost tumorja ( T
) je bila ocenjena kot največja cut območja in določi po naslednji formuli: T
= π /4 x A
x b
, kjer A
je krajša os (mm) in b
je več osi ​​(mm). Miši so žrtvovali 12 dni po zdravljenju z drogami in tumorji so bili pridobljeni v naslednjem poskusu.}

razcepi kaspaze 3 imunohistokemija in ocena apoptoze in vivo

The zamrznjena tumorji so integrirani z tissue-Tek ČDO Spojina. Ti bloki so narežemo na 4-mikrometrov debelih odsekov. Za pridobivanje antigena, so drsi segrevamo v Tris-EDTA pufrom (pH 9,0), v mikrovalovni pečici (500 W) za 5 minut. Oddelki smo nato inkubirali z anti-razcepljen kaspaze 3 (1: 200, celična signalizacija tehnologijo) za 2 uri pri sobni temperaturi, in DAKO Predstavljajte + sistem (Dako Cytomation, Glostrup, Danska) je bila uporabljena kot sekundarnih protiteles. Signali smo vizualizirali z diaminobenzidine tetrahidroklorid (0,02%). Za oceno apoptoze, razklani kaspaze so 3-pozitivne celice z rjavimi jeder štejejo v petih poljih na 400-krat povečavi in ​​srednja je bila izračunana. Imunohistokemični izraz cepijo kaspaze 3 je slepo pregleda in oceni pooblaščenega patolog (Dr. AN).

Statistična analiza

Podatke smo analizirali z ANOVA pomočjo programskega paketa Prism 5 ( GraphPad Programska oprema, La Jolla, CA). Za primerjavo med obema skupinama so bile razlike v srednjih vrednostih ocenil Študentske t-
testa in Mann-Whitney U
test. Za primerjavo med tremi ali več skupin, so bili Bonferroni post hoc testi opravijo za enosmerno ANOVA. Vrednost p < 0,05 štelo, da je statistično značilna. Vsi podatki so izraženi kot sredstvo ± SEM.

Rezultati

HIF-1α rasklapanje povzroča apoptotske celične smrti v skladu s hipoksijo v 58As9 raka želodca celic

Izraz HIF-1α je oceni v stabilno HIF-1α rasklapanje celic in SC (kot kontrola celične linije) celic (KD). Western blot analiza je pokazala, da je HIF-1α ekspresija popolnoma podrli v KD celicah po 8 ur pod hipoksijo v primerjavi z SC celic (slika 1A). Stopnja celična smrt je bila ocenjena po 24 do 96 ur v normoxia in hipoksijo. Stopnja umrljivosti je bila v KD celicah višja kot v SC celicah pod normoxia za 24 do 96 urah, vendar razlike niso bile statistično značilne (slika 1B). V nasprotju s tem je bila stopnja celične smrti v KD celic močno povečal pod hipoksije in znatno višje kot so ga opazili v SC celic po 72 in 96 urah (slika 1C). Blot analizo Western pokazala, da so odcepljene kaspaza 3 kot tudi citosolno citokrom c povišano v KD celicah, vendar ne v SC celicah pod hipoksije 8 ur (slika 1D in 1E). Hipoksija povzročena celična smrt je bila potrjena tudi v drugih HIF-1α rasklapanje želodčnih rakavih celic 74-KD (S1 Sl). Ti rezultati so pokazali, da hipoksija močno inducira apoptozo v HIF-1α rasklapanje celične linije KD.

čistilnih ROS obrnil apoptotske fenotip prišlo v rasklapanje celicah HIF-1α

je bila ocenjena v celicah raven ROS in primerjali med celicami KD in SC. Raven ROS v odvisnosti od časa način v KD celicah pod hipoksije poveča, medtem ko je bila stopnja rahlo povišano v SC celic (slika 2A). Raven ROS v KD celicah je bila bistveno višja v skladu s hipoksijo za 24 do 72 ur, kot da je v SC celic (slika 2A). Ravni ROS ocenjevali tudi pri 74-SC celic in 74-KD celic (S2 Sl) na. Ravni ROS ni razlikovala med 74-SC in 74-KD celic pod normoxia (S2A Sl). Vendar v skladu s hipoksijo, so bile ravni ROS v 74-KD celic bistveno višja kot v 74-SC celic na 48 do 72 ur (S2 Sl). NAC, antioksidant, občutno zmanjšala raven ROS v KD celicah pod hipoksije za 48 do 72 ur (slika 2b). Da bi lahko ocenili, ali ROS proizvodnja inducira-hipoksije povzročil smrt celic v KD celicah, je bila stopnja celične smrti, z ali brez NAC ocenili v KD celic pod normoxia in hipoksijo. Zdravljenje NAC ni vplivalo na odmiranje celic v KD celic pod normoxia (slika 2C). Nasprotno pa obdelava NAC bistveno zmanjša smrt celic pri KD celicah pod hipoksije za 48 do 96 ur (slika 2D).

HIF-1α razgradljiv zmanjšala hipoksične indukcijo različnih genov, ki sodelujejo pri nadzoru proizvodnje ROS

Da bi raziskali, hipoksije povzroča ROS kopičenje v rasklapanje celicah HIF-1α, mRNA izraz deset genov, ki sodelujejo v mehanizmu za nadzor ROS ( GLUT1
, ALDOC
, PDK1
, LDHA
, MCT4
, BNIP3
, BNIP3L
, LON
, COX4-2
in MnSOD
) smo analizirali z uporabo RT-qPCR. Hipoksičnih indukcija izražanje genov je bila ocenjena z indukcijo kratnega (FI). FIS v desetih geni so v KD celicah bistveno nižji kot v SC celic (slika 3). Poleg tega, kadar omejena na hipoksične pogoje, so ekspresijski nivoji vseh desetih genov bistveno nižja v KD celicah kot v SC celic. Ti rezultati so pokazali, da HIF-1α razgradljiv občutno zmanjšala izražanje-hipoksije inducirano desetih genov. Po drugi strani pa pod normoxia, je izraz PDK1 in BNIP3L v KD celicah bistveno nižji kot v SC celicah. Nasprotno pa so bile stopnje izraženosti iz LON in COX4-2 bistveno višja v KD celic v primerjavi z SC celic.

glukoze in inzulina zdravljenja izboljšane smrt apoptotske celica v KD celicah pod hipoksija

Mi Naslednja raziskati, ali spodbujanje privzema glukoze vpliva na apoptozo-hipoksije psihomotorične KD celicah. preživetja Celica je bila ocenjena v celicah KD in SC naslednjih obdelav s kontrolo (PBS), visoka glukoze, inzulina ali visoko glukozo plus insulinu (GI). -Hipoksija povzroča celična smrt je bila ocenjena s FI. stopnja celične smrti v skladu s hipoksijo smo primerjali med zdravljenjem kontrolno in drugih oblikah zdravljenja v obeh celičnih linij (slika 4). V SC celic, so bile med katero od obdelav (slika 4A) opazili nobenih pomembnih razlik v FI in celic umrljivosti pod hipoksijo. V KD celicah, smo FI znatno povečal hipoksija v vseh zdravljenja. Zlasti zdravljenje GI dobimo največjo FI med vsemi postopki (slika 4B). Stopnja celične smrti v skladu s hipoksijo je v celicah-GO obravnavati bistveno višja kot v celicah nadzora obdelan (slika 4b). Da razišče, ali je zdravljenje vplivala na proizvodnjo ROS, je bila raven ROS analizirani v KD celicah. V primerjavi z normoxic pogoji, je bila stopnja ROS močno zvišane v KD celicah pod pogoji hipoksičnih (slika 4C). Pod hipoksije, je bila stopnja ROS v KD celicah znatno povečal visoka glukoze, inzulina in zdravljenje GI v primerjavi s kontrolno skupino. Najvišjo raven ROS je pozitivno opazili v KD celic GO obdelan (slika 4c).

Ocena privzem glukoze po zdravljenju z insulinom

sposobnost privzema glukoze je bil analiziran v študiji 2DG vgradnje . V celicah SC in KD pod normoxia je bila vključitev 2DG bistveno zvišan z obdelavo 2DG v primerjavi z nezdravljenimi celicami. Vključitev 2DG se je še povečala za dodatno zdravljenje z insulinom v obeh celicah (slika 5A). V primerjavi z normoxia, hipoksija močneje stimulira privzem 2DG v SC celic z ali brez insulinom (slika 5B). Podobne ugotovitve so bile v KD celic v skladu s hipoksijo (slika 5b) opazili. Vendar pod hipoksije, je manj 2DG vključena v KD celice kot v SC celic z ali brez dodatnega zdravljenja z insulinom (slika 5B). Oceniti mehanizem privzema glukoze odvisen od inzulina, je membranska izraz GLUT1 analizirani v KD celicah pod normoxia in hipoksijo. Pod normoxia, je membranska GLUT1 izraz povišani z visoko glukozo in /ali zdravljenje z insulinom v primerjavi s tistim brez zdravljenja (slika 5C). Glede na to opazuje pod normoxia pod hipoksije, je membranska GLUT1 izraz povišano vseh zdravljenja. Poleg tega je bila ekspresija poveča z visokim glukoze in /ali zdravljenje z insulinom, v primerjavi s tistimi, ki jih brez zdravljenja (slika 5C). Zlasti je membranska GLUT1 izraz najmočneje povečala za visoko glukoze in insulina (GI) zdravljenje v hipoksičnih KD celic (slika 5C). Po drugi strani pa izraz drugega zasičenost družine, GLUT3 je rahlo opazili v KD celicah, in te ugotovitve ni spremenila med temi različnimi zdravljenj (podatki niso prikazani). V tej študiji, GLUT2 in GLUT4 niso bili izraženi v KD celicah.

HIF-1α razgradljiv plus zdravljenje GI močno zavre rast tumorskih presadkov pri golih miših

Končno smo določi in vivo
učinek zdravljenja GI na KD in SC tumorskih presadkov. Slika 6A prikazuje eksperimentalno zasnovo ksenotransplantskih mišje modelu. Deset dni po podkožnem inokulacijo SC ali KD celic, so ksenotransplantati goji na hrbtih golih miših. Na tej točki, Western blot analizo potrdila HIF-1α ekspresijo v SC tumorjev, vendar ne v KD tumorjev (slika 6B). Nato tri zdravila, ki so sestavljeni iz PBS, glukoze ali GI, smo intraperitonealno injicirali v golih miših, ki nosijo SC ali KD tumor (dnevno od dneva 1 do 11 dni). Reprezentativne slike miši v tumor smer, ki so bili zdravljeni s PBS (SC-PBS in KD-PBS), glukoza (SC-glukoze in KD-glukoze) ali GI (SC-GI in KD-GI) so prikazani na sliki 6C . V KD-Glukoza in KD-GI tumorji se zdi, da so manjše od drugih tumorjev. Slika 6D pokazala krivuljo rasti 6 tumorjev. Velikosti KD-glukoze in KD-GO tumorji so bistveno manjši od tumorja KD-PBS na dan 12. KD-GI tumorja je bila najmanjša. Po drugi strani pa v SC miših ni bilo pomembne razlike v velikosti SC-PBS, SC-glukoze in SC-gastrointestinalnih tumorjev (Slika 6D). Imunohistokemični Analiza cepijo kaspaze 3 je bila izvedena za oceno apoptozo z glukozo ali zdravljenje GI inducirano. Pozitivna izraz cepijo caspase3 je pogosto opaziti v KD-glukoze in KD-GO tumorjev (Slika 6e). Vendar pa vsi KD tumorjev razstavljene določeno stopnjo razcepljenega kaspaze 3 (Slika 6F). V nasprotju s tem pa ni bilo značilne razlike v izražanju razcepljene kaspaze 3 med SC-PBS, SC-glukoze in SC-GO tumorjev. V tumorjih KD bil pozitiven izraz cepljen caspase3 v KD-PBS tumor bistveno višja kot v SC-PBS tumorja. Poleg tega je bil izraz cepljen caspase3 bistveno višja v tumorjih KD-glukoze ali KD-GO kot v KD-PBS tumorja. Najvišji izraz opazili v KD-GI tumorja na.

Pogovor

V tej raziskavi smo uporabili rasklapanje celice HIF-1α, da razišče, ali je smrtna proizvodnjo ROS lahko povzročena pod hipoksijo. Rezultati so pokazali, da je bila celična smrt apoptotske inducira v KD celicah, ne pa tudi v kontrolni SC celice pod hipoksijo. Hkrati ROS nabrali v celični liniji razgradljiv v skladu s trajanjem hipoksije. Opazili so tudi v različnih HIF-1α rasklapanje 74-KD celic Hypoxia- povzroča celično smrt in kopičenje ROS, vendar ne v kontrolni 74-SC celic. Poleg tega je zdravljenje NAC zniža stopnjo, hipoksijo inducirane celične smrti v KD celicah. Ti rezultati kažejo na pojav, hipoksijo inducirane apoptoze zaradi prekomernega kopičenja ROS v KD celic in podpira prejšnje študije, ki HIF-1 a izpadanje MEFs umrla zaradi prevelike proizvodnje ROS [33].

ROS so večinoma nastala v mitohondrije ETC [17, 19]. Ugotovljeno je bilo, da so mitohondrijske ROS povečali pod hipoksične pogoje [17, 19]. Če hipoksija izgine, indukcija HIF-1 a pripelje do nastavljive mehanizme za zmanjšanje ROS in ponovno vzpostavitev redoks homeostazo z uravnavanjem ustreznih genov [19]. Tako smo raziskovali, ali HIF-1α rasklapanje vplivala na mRNA izražanje deset genov, ki sodelujejo pri nadzoru proizvodnje ROS pod hipoksijo ( GLUT1
, ALDOC
, PDK1
, LDHA
in MCT4
v zvezi z učinkom Warburg; BNIP3
in BNIP3L
zvezi z mitophagy; LON
in COX4-2
zvezi z ETC in MnSOD
A ROS lovilec). Integrirane analize serije RT-qPCR je pokazala, da je bila, hipoksija povzročena izraz vseh deset genov bistveno zatreti v KD celic, medtem ko v skladu normoxia je, mRNA izraz LON in COX4-2 bistveno višja v KD celicah kot v SC celicah. Ti rezultati so pokazali, da je lahko smrtonosno kopičenje ROS pod hipoksije v razgradljiv celicah HIF-1α zaradi večkratnih motenj mehanizma kontrolnega ROS. Zato se lahko zdravljenje raka ciljanje HIF-1 a učinkovita pri hipoksične regiji znotraj želodčnega tkiva raka. ni bilo mogoče pojasniti mehanizem temelji molekul mRNA izraz LON in COX4-2 v KD celicah pod normoxia.

Glede na zgornje ugotovitve, smo predpostavili, da lahko spodbujanje privzema glukoze pospeševanja hipoksijo inducirane apoptoza z nadaljnjo proizvodnjo ROS v HIF-1α rasklapanje KD celic. Kot je bilo pričakovati, zdravljenje GI okrepljeno smrt celic v hipoksičnih KD celicah, ki so opremljeni s povečano proizvodnjo ROS. V študiji absorpcije glukoze, inzulin poveča privzem 2DG tako v SC in KD celic. V primerjavi z letom, ki opazuje pod normoxia, hipoksija poveča privzem 2DG v celicah SC in KD, zdravljenih z ali brez insulina. Sprejem je bil v odboru kot KD celic bolj močno povečala, kar kaže na razliko zaradi oslabljenega GLUT1 indukcijo v hipoksično KD celic. Po drugi strani, Western blot analiza je pokazala, da je membranska GLUT1 ekspresija poveča z visoko glukozo in /ali zdravljenje inzulina, v primerjavi z zdravljenjem kontrolno v normoxic in hipoksičnih KD celic. Še posebej, zdravljenje GI najmočneje povečala membranskih GLUT1 izraz v hipoksičnih KD celicah. Prejšnja študija je poročala, da insulin spodbuja glukoze prevoz s spodbujanjem translokacijo GLUT4 iz znotrajceličnih veziklih shranjevanje na plazemske membrane v celicah skeletnih mišic ali adipocitov [36, 37].

• Plos ONE: Kopiraj Število Dobički pri 8q24 in 20q11-Q13 želodčnega raka so pogostejše v črevesju-Type kot Diffuse-Type
• Plos ONE: Serum HER2 je potencialni nadomestek za tkiva status HER2 želodčnega raka: sistematični pregled in Meta-Analysis