PLoS ONE: Апоптические Влияние HIF-1 ингибирование Combined с глюкозой плюс инсулина на лечение рака желудка в условиях гипоксии

Абстрактный
<р> Рак желудка растет под гипоксического среде. HIF-1α, как известно, играют важную роль в регулировании производства реактивных форм кислорода (ROS) в митохондриях в условиях гипоксии. Ранее мы установили нокдаун (KD) клеток HIF-1 и контроль (SC) клеток в желудочном линии раковых клеток 58As9. В этом исследовании мы показали, что KD клетки, но не SC клеток, индуцированного апоптоза в условиях гипоксии (1% O <суб> 2) из-за чрезмерного производства ROS. Количественный анализ RT-PCR показал, что выражения десяти генов, которые участвуют в механизмах управления ROS (включая эффект Варбурга, mitophagy, цепи переноса электронов [ETC] модификации и ROS продувкой), регулировались HIF-1. Кроме того, продвижение глюкозы глюкозой плюс инсулин (GI) лечения усиливается апоптический эффект, который сопровождался дальнейшим производством ROS в гипоксических KD клеток. Вестерн-блоттинга анализ показал, что перепончатый экспрессия GLUT1 в клетках KD повышали с помощью глюкозы и /или лечения инсулина, что указывает на поглощение глюкозы ГИ-индуцированной опосредована увеличением транслокации GLUT1 на клеточной мембране. И, наконец, эффект противоопухолевой HIF-1 нокдаун (KD) плюс GI оценивали с использованием модели опухоли ксенотрансплантата, где, естественно, существует гипоксическая среда. В результате лечение ГИ сильно ингибирует рост опухолей KD причем апоптоз клеток была сильно индуцируемых по сравнению с контрольным лечением. В отличие от этого, рост опухолей, экспрессирующих SC HIF-1 не зависела от лечения GI. Взятые вместе, эти результаты показывают, что HIF-1α ингибирование плюс GI может быть идеальной терапией, потому что апоптоз из-за разрушения ROS гомеостаза специфически индуцируется в рак желудка, который растет под гипоксической среде, но не в нормальной ткани под аэробные условия
<р> Цитирование:. Tanaka T, Kitajima Y, Miyake S, Yanagihara К, Хара Н, Нисидзимы-Matsunobu A, и др. (2015) Апоптические Влияние HIF-1α ингибирования В сочетании с глюкозой плюс инсулина Лечение рака желудка на условиях гипоксии. PLoS ONE 10 (9): e0137257. DOI: 10.1371 /journal.pone.0137257
<р> Редактор: Ester Hammond, Оксфордский университет, Соединенное Королевство
<р> Поступило: 30 апреля 2015 года; Принято: 13 августа, 2015 года; Опубликовано: 4 сентября 2015
<р> Copyright: © 2015 Танака и др. Это статья открытого доступа распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются
<р> Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в пределах своих подтверждающей информации, файлов бумаги и
<р> финансирование:.. авторы не имеют никакой поддержки или финансирования сообщать
<р> конкурирующие интересы:. авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов

Введение
<р> гипоксическое среда является существенным при солидных опухолях, где она ускоряет их злокачественные поведения [1-4]. Как и в других солидных опухолей, рак желудка, как известно, связаны обширные площади гипоксии внутри опухоли [5-7]. Гипоксических состояний вызывают несколько биологических событий, таких как ангиогенез, местной инвазии, метастазирования, радио- или химиорезистентности и измененном энергетического метаболизма во многих карцином, что приводит к неблагоприятным прогнозом у больных [2-4]
. <Р> транскрипционный фактор индуцированного гипоксией фактор 1 (HIF-1) является главным медиатором клеточной адаптации к гипоксии [8-10]. HIF-1 представляет собой гетеродимер белок, состоящий из экспрессирован β-субъединицы (HIF-1 β) и ​​гипоксия-индуцируемых α (HIF-1α) субъединица [8-10]. HIF-1α субъединица деградирует через убиквитин-Протеасома пути под нормоксии. В отличие от этого, при гипоксии, HIF-1α стабилизируется и димеризуется с HIF-1β, взаимодействующих с CBP /p300, который затем связывается с элементом ответа гипоксию (HRE) на промоторной области сотен генов-мишеней [11-16]. Эти предыдущие доклады привели к признанию HIF-1 в качестве центрального регулятора в патогенезе рака твердого
<р> Реактивные формы кислорода (ROS), такие как супероксид-анион (O <суб> 2 ^{. - ), перекись водорода (Н <суб> 2O <суб> 2), и гидроксильный радикал (HO •), состоят из радикальных и нерадикальными форм кислорода, образующихся в результате частичного восстановления кислорода. Внутриклеточные ROS образуются в основном в митохондриях путем окислительного фосфорилирования (OXPHOS), процесс, выполняемый цепи переноса электронов (ETC) [17]. Когда РОС сокрушить сотовую систему антиоксидантной защиты, возникает окислительный стресс. Чрезмерное окислительный стресс вызывает РОС-опосредованного повреждения нуклеиновых кислот, белков и липидов и приводит к гибели клеток [17, 18].
<Р> HIF-1α сообщалось контролировать производство ROS в условиях гипоксии посредством нескольких механизмов включая преобразование энергии метаболизма из OXPHOS гликолиза, который упоминается как эффект Варбурга [19-23], индукции митохондриальной селективного аутофагией (обозначенный как mitophagy) [24, 25], ETC модификация переключателем субъединица цитохрома с-оксидазы (COX) [26] и ROS поглотители [27]. В метаболическом пути эффекта Варбурга, HIF-1α первым активирует транскрипцию GLUT1
чтобы увеличить поглощение глюкозы в клетках. Глюкоза затем метаболизируется в пируват действиями гликолитических ферментов членов, которые известны мишени для HIF-1 [28, 29]. В аэробных условиях пируват превращается в ацетил-КоА (AcCoA) с помощью пируват-дегидрогеназы (PDH) для вхождения в трикарбоновых кислот (TCA) цикл. И наоборот, в раковых клетках, подвергнутых гипоксии, пируват шунтируется от митохондрий, в результате чего HIF-1α повышает экспрессию PDK1 ингибировать активность PDH. После этого, в качестве альтернативы LDHA преобразует пирувата в лактат и MCT4 транспортирует лактата из клетки. Эти гены также регулируются HIF-1 [16, 30, 31]. Гипоксия индуцирует mitophagy, чтобы предотвратить чрезмерное производство ROS, с помощью которых поврежденные митохондрии устраняются с помощью лизосомальных пищеварения [24, 25]. Недавние исследования показали, что HIF-1α активирует транскрипцию генов, кодирующих BNIP3 и BNIP3L, существенные факторы в mitophagy процессе [32]. Другое исследование показало, что HIF-1α регулирует переключение субъединицу COX4 путем активации транскрипции ЦЭТ связанных генов COX4-2 и LON, митохондриальный протеазы, который необходим для деградации COX4-1 при гипоксии [26]. Выключатель субъединица COX4 было сообщено как важный шаг в ROS гомеостаза, благодаря своей роли в оптимизации эффективности дыхания при гипоксии [26]. Поглотитель MnSOD РОС известно преобразование супероксидных радикалов в перекись водорода. Предыдущее исследование показало, что MnSOD усиливает свою активность в условиях гипоксии, хотя ли эта регуляция опосредована HIF-1 до сих пор не было показано [27]. В последнее время, другой отчет показал интересный вывод о том, что эмбриональные фибробласты (МЭФ) гипоксического HIF-1α-нулевых мышей умерли из-за избыточного производства ROS, в то время как MEFs были спасены с помощью обработки с антиоксидантом N ацетил-L-цистеина (NAC) [ ,,,0],33]. Взятые вместе, эти отчеты показывают, что HIF-1α играет центральную роль в организации митохондриальную производства АФК в живых клетках в условиях гипоксии.
<Р> В этом исследовании мы стремились создать терапевтическую модель, демонстрирующая, что гипоксия-индуцированный апоптоз с помощью перепроизводство ROS может быть введен в HIF-1α дефицитных клеток рака желудка. Первоначально мы определяли, индуцирует ли гипоксия гибель клеток чрезмерное производство ROS в HIF-1 нокдаун (KD) клеток. После этого мы обратились гипотезу о том, что введение высоких уровней глюкозы обработкой KD клеток с инсулином может усиливать апоптический эффект. И, наконец, с использованием модели опухоли ксенотрансплантата, мы предположили, что HIF-1α торможение в сочетании с глюкозой плюс инсулин (GI) лечение может быть потенциальной терапии рака желудка.}

Материалы и методы исследования

Клеточные культуры условия и реагенты
<р> желудочный линия клеток рака 58As9 был любезно предоставлен доктором К. Янагихара (Национальный онкологический центр больницы Востока, Чиба, Япония) в декабре 2009 года в клеточной линии 58As9 первоначально был создан из скиррозных карциномы желудка, полученных клеточная линия HSC-58 [34]. Эта клеточная линия была затем дополнительно подтверждён 24 февраля ^{й, 2015 по JCRB Cell Bank (Осака, Япония). Другой клетку рака желудка линии, MKN74 был приобретен у Cell Bank, RIKEN Bio ресурсный центр (Цукуба, Япония). В настоящем исследовании мы использовали стабильные HIF-1α нокдаун клеток KD и 74-KD, которые были созданы с помощью трансфекции плазмиды миРНК укрывает последовательности RNAi в клетки 58As9 и MKN74, как описано ранее [7, 35]. Последовательности siРНК, направленные на HIF-1 и контроль вскарабкался миРНК были составлены следующим образом: HIF-1α миРНК для КД, или 74-KD (5'-ССА CAT ТСА ВКТ ATA ТГА Т-3 ') и скремблирования миРНК для SC или 74- SC (5'-TCT ТАА TCG ВКТ АТА AGG C-3 '). Клетки культивировали в среде RPMI-1640 (Sigma-Aldrich, Inc., Сент-Луис, штат Миссури, США) с добавлением 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 100 мкг /мл канамицина (Meiji, Токио, Япония ) и инкубировали при 37 ° C в увлажненной атмосфере. Клетки культивировали в соответствии либо гипоксическим условиям (20% O <суб> 2 и 5% СО <суб> 2 в воздухе) или гипоксические условия (1% O <суб> 2, 5% СО <суб> 2 и 94% N <суб> 2) в гипоксической камере (ASTEC, Осака, Япония), а затем обрабатывали NAC (Sigma-Aldrich) и инсулин (WAKO, Осака, Япония) в конечной концентрации 5 мМ и 500 нг /мл, соответственно. Концентрация среды с высоким содержанием глюкозы, получали путем добавления 45% D - (+) - раствор глюкозы (Sigma-Aldrich) и конечная концентрация была определена в 10 г /л, что в 5 раз выше, чем в нормальной RPMI-1640.}

жизнеспособность клеток анализ
<р> жизнеспособность клеток при нормоксии или гипоксии оценивали с помощью трипанового синего красителя исключения анализов. Для оценки эффектов лечения наркотической зависимости, в том числе NAC, высокий уровень глюкозы и /или инсулина на жизнеспособность клеток, 1 × 10 ^{5 клеток высевали на 6 см чашки для культивирования. Клетки обрабатывали различными препаратами в указанных концентрациях и культивируют при нормоксии или гипоксией в течение 24 ч до 96 ч. В конце инкубации, плавающие и адгезивные клетки собирали и осаждали центрифугированием (3000 оборотов в минуту, 5 минут). Клетки ресуспендировали в 90 мкл полной среды, смешивают с 10 мкл 0,4% трипанового синего раствора и подсчитывали с помощью гемоцитометра под микроскопом. Смертность клеток определяли как отношение числа погибших клеток /от общего числа клеток. Все эксперименты проводились в трех экземплярах и независимо друг от друга повторяют по меньшей мере три раза.}

Вестерн-блот-анализ
<р> лизаты целых клеток из культивируемых клеток и ксенотрансплантата опухолей у мышей, были приготовлены с использованием лизис буфера, состоящего из 150 ммоль /л NaCl, 50 ммоль /л Трис-HCl (рН 7,6), 0,5% Тритон Х-100, и ингибитор протеазы коктейль смесь (Roche, Mannheim, Германия). Клеточные лизаты из цитозольной фракции и фракции клеточных мембран были получены с использованием цитохром с рилизинг Апоптоз набора для анализа и извлечения белка Kit плазматической мембраны (BioVision Inc., Milpitas, CA, USA) в соответствии с инструкциями изготовителя. Вестерн-блот анализ проводили, как описано ранее [7]. Порции, содержащие 30 мкг белка электрофоретически разделяли в 4-12% Bis-Tris гель (Invitrogen) и переносили на Amersham в Hybond-ECL мембрану (GE Healthcare, Бакингемшир, Великобритания) в буфере передачи. После блокирования с помощью 5% молока кожи в течение 30 мин, мембрану инкубировали с первичными антителами в течение ночи при температуре 4 ° С. Были использованы следующие первичные антитела: анти-HIF-1 (разведение 1: 1000, Abcam, Кембридж, Великобритания), анти-расщепляется каспазы 3 (1: 1000, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), анти-цитохром с (1 : 500 разбавление, BioVision), анти-GLUT1 (1: 100000 разбавление, Abcam), и анти-β-актина (1: 10000 разбавления; Sigma-Aldrich, Inc.). После инкубации с соответствующими вторичными антителами, сигналы были разработаны с использованием системы Amersham ECL Plus Вестерн-блоттинга обнаружения (GE Healthcare).

Обнаружение внутриклеточных РФК с помощью проточной цитометрии

значений внутриклеточный ROS были оценены с помощью Total ROS Detection Kit (Enzo Life Sciences, Inc., Farmingdale, Нью-Йорк, США) в соответствии с инструкциями изготовителя. Короче говоря, KD, SC, клетки культивировали в условиях либо нормоксии или гипоксии, с добавлением или без лекарственной терапии (например, NAC, высоким содержанием глюкозы и /или инсулина) в течение 24 ч, 48 ч и 72 ч. 74-КД и 74-SС также культивировали в условиях либо нормоксии или гипоксией в течение 24, 48 и 72 часов без какой-либо лекарственной терапии. Клетки промывали и повторно суспендировали в растворе для обнаружения ROS. ROS флуоресценции была обнаружена потоком FACS Calibur цитометре (Becton-Dickinson, San Jose, CA) и анализировали с помощью программы Cell Quest программного обеспечения. Все эксперименты проводились в трех экземплярах. Среднее значение флуоресценции производства ROS определялась автоматически и представлены как GEO виду.

Общее извлечение РНК и количественный RT-PCR
<р> Суммарную РНК экстрагировали из клеточных линий с использованием набора экстракционную РНК Isogen ( Nippon Gene, Осака, Япония). Один мкг РНК превращают в кДНК с использованием ReverTra Ace (Тоёбо) обратной транскрипции реакция комплект. КДНК использовали в качестве матрицы для ПЦР. В режиме реального времени количественного ОТ-ПЦР (RT-КПЦР) проводили с помощью системы приборного света Cycler (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Германия) с использованием набора световой Циклование-FastStart ДНК Мастер SYBR Green I (Roche). Десять генов, которые были проанализированы с помощью RT-КПЦР распределились следующим образом: переносчик глюкозы 1 ( GLUT1
), альдолазу C ( ALDOC
), пируватдегидрогеназа киназа 1 ( PDK1
), лактатдегидрогеназы а ( LDHA
) и монокарбоксилата транспортер 4 ( MCT4
), Bcl-2 /EIB аденовирус 19-кД взаимодействующий белок 3 ( BNIP3
), BINP3 как ( BNIP3L
), митохондриальной супероксиддисмутазы марганца ( MnSOD
), митохондриальной протеазы LON
и цитохромоксидазы субъединица 4-2 ( Cox4 - 2
). Праймеры были разработаны в соответствии с сообщенной кДНК-последовательностей (GenBank, Bethesda, MD) (таблица 1). После выполнения стадии денатурации при 95 ° С в течение 3 мин, ПЦР-амплификации проводили с 50 циклами 15 с денатурация при 95 ° С, 5 с отжига при 60 ° С и 10 с удлинение при 72 ° С. Количественные значения нормализовали к бета-актина ( ACTB
) выражение (таблица 1). Все эксперименты проводились в трех экземплярах и независимо друг от друга повторяют по меньшей мере три раза.

Захват глюкозы анализ
<р> Поглощение глюкозы в культивируемых клетках определяли с помощью 2-дезоксиглюкозы (2DG) Усвоение измерения Kit (COSMO BIO Co. Ltd., Токио, Япония). В кратком изложении, клетки культивировали под недостатком сыворотки состоянии в течение 6 ч, с последующим дальнейшим культивированием в течение 18 часов в регулярной среде, дополненной 10% FBS. Клетки инкубировали в течение 24 ч при нормоксии или гипоксии. После этого клетки были обработаны с или без 500 нг /мл инсулина в течение 18 мин. Наконец, клетки обрабатывали 2DG в течение 20 мин и подвергали измерению поглощения 2DG в соответствии с инструкциями изготовителя. Все эксперименты проводились в трех экземплярах и были рассчитаны средние значения.

Исследования на животных
<р> Протоколы животных были утверждены Институциональный животных по уходу и использованию комитетов Saga университета (протокол 24-008-0 ) и соответствовали ARRIVE руководящих принципов для использования животных в научных исследованиях. Женские 4-недельных бестимусных мышей линии BALB /Cf Jcl (Nu /Nu) были получены от Nihon Crea Co. (Осака, Япония). Животных содержали под специфические-патогена условиях. Им давали стерильную еду и автоклавного воду с 12-часовой свет-темнота цикла. Мышей приспособились к окружающей среде в течение 7 дней до начала экспериментов. KD или SC-клетки (3 × 10 6) вводили подкожно в спину мышей (п = 9 для каждой линии клеток). Через десять дней после подкожной инокуляции ксенографты обеих клеток стало ощутимым. Девять мышей с KD или SC ксенотрансплантаты были затем разделены на три группы для лечения глюкозой (8 г /кг /день, Sigma), глюкоза плюс инсулин (ГИ) (1 единица на 3 г глюкозы /сут, WAKO) или фосфатно-буферном физиологический раствор (PBS), в качестве контрольной обработки. Каждый из этих препаратов внутрибрюшинно вводили в трех мышей (шесть опухолей всего) каждые 24 ч с 1 до 11 дня, в течение этого периода, опухоли были измерены в 2-х перпендикулярных размеров штангенциркулем каждые четыре дня. Размер опухоли ( T
) была оценена как максимальная площадь среза и определяется по следующей формуле: T
= π /4 × а
× б
, где а
является короче оси (мм) и б
это длинная ось (мм). Мыши были умерщвлены через 12 дней после медикаментозного лечения и опухоли собирали для последующего эксперимента.

Рассекай каспазы 3 иммуногистохимии и оценка апоптоза В естественных условиях

замороженные опухоли были вкраплены с Tissue-Tek ОСТ Соединение. Эти блоки были разрезаны на 4-мкм срезы толщиной. Для поиска антигена, слайды нагревают в Трис-ЭДТА-буфера (рН 9,0) в микроволновом (500 Вт) в течение 5 мин. Затем срезы инкубировали с анти-расщепляется каспазы 3 (1: 200, Cell Signaling Technology) в течение 2 ч при комнатной температуре, а + Система DAKO Envision (Dako Cytomation, Glostrup, Дания) используют в качестве вторичного антитела. Сигналы были визуализированы с диаминобензидина тетрагидрохлорид (0,02%). Для оценки апоптоза, расщепляется каспазы 3-положительных клеток с коричневыми цветными ядрами подсчитывали в пяти областях при 400x увеличении и среднее рассчитывалась. Иммуногистохимическое экспрессия расщепленной каспазы 3 вслепую проанализировали и оценили сертифицированный патологоанатом (Dr. AN).

Статистический анализ
<р> Данные были проанализированы с помощью дисперсионного анализа с использованием программного пакета Prism 5 ( GraphPad Software, La Jolla, CA). Для сравнения между двумя группами, различия в средних значениях были оценены t-
критерия Стьюдента и Манна-Уитни ˙U
тест. Для сравнения между тремя или более группами, Бонферрони постфактум тесты были выполнены для одностороннего ANOVA. Значение р &ЛТ; 0,05 рассматривалось как статистически значимое. Все данные выражены как среднее значение ± SEM.

Результаты

HIF-1α нокдаун индуцированной апоптотической гибели клеток при гипоксии в 58As9 рака желудка клетки
<р> HIF-1α выражение было оценивается в стабильных HIF-1α нокдаун (KD) клеток и SC (в качестве контрольной клеточной линии) клеток. Вестерн-блот-анализ показал, что экспрессия HIF-1α был полностью сбит в клетках KD через 8 часов, при гипоксии, по сравнению с SC-клеток (Фиг.1А). Смертность клеток оценивали через 24 ч до 96 ч при нормоксии и гипоксии. Смертность была в клетках KD выше, чем в SC клеток под нормоксии в течение 24 до 96 часов, однако эти различия не были статистически значимыми (фиг.1В). В противоположность этому, смертность клеток в клетках кД сильно увеличена при гипоксии и значительно выше, чем это наблюдалось в SC клеток через 72 и 96 часов (рис 1C). Вестерн-блот анализ показал, что расщепленный каспазы 3, а также цитозольного цитохром с повышались в клетках КД, но не в SC клеток при гипоксии в течение 8 часов (рис 1D и 1E). Гипоксия смерть индуцированных клеток была также подтверждена в других HIF-1α нокдаун клеток рака желудка 74-KD (S1) Рис. Эти результаты показали, что гипоксия сильно индуцированный апоптоз в HIF-1α бросовой клеточной линии KD.

Scavenging ROS отменил апоптический фенотип, наблюдаемый в HIF-1α нокдаун клеток
<р> внутриклеточного уровня РОС оценивался и по сравнению среди ячеек KD и SC. Уровень РОС увеличена в зависимости от времени в клетках КД при гипоксии, в то время как уровень был слегка повышен в SC-клеток (рис 2А). Уровень РОС в клетках KD был значительно выше при гипоксии, в течение от 24 до 72 часов, чем в SC клетках (Фиг.2А). Уровни ROS также были оценены в 74-SC клеток и 74-KD клеток (S2) Рис. Уровни ROS не отличались между 74-SC и 74-KD клеток под нормоксии (S2A FIG). Тем не менее, в условиях гипоксии, уровни ROS были в 74-KD клетках значительно выше, чем в 74-SC клеток в 48 до 72 часов (S2B) Рис. NAC, антиоксидант, значительно снижало уровень АФК в клетках КД при гипоксии, в течение от 48 до 72 часов (фиг.2В). Для того чтобы оценить, индуцирует ли производство РОС гипоксия-индуцированной гибели клеток в клетках К.Д., смертность клеток с или без NAC оценивали в клетках КД при нормоксии и гипоксии. Лечение NAC не влияет на скорость клеточной гибели в клетках КД под нормоксии (рис 2C). В отличие от этого, лечение НСС значительно снижало гибель клеток в кД клетках при гипоксии, в течение от 48 до 96 часов (рис 2D).

HIF-1α нокдаун уменьшило гипоксической индукции различных генов, участвующих в контроле производства ROS
<р> Для исследования гипоксия-индуцированного накопления активных форм кислорода в HIF-1α нокдаун клеток, экспрессию мРНК десяти генов, которые участвуют в механизме управления РОС ( GLUT1
, ALDOC
, PDK1
, LDHA
, MCT4
, BNIP3
, BNIP3L
, LON <бр>, COX4-2
и MnSOD
) анализировали с использованием RT-КПЦР. Гипоксическое индукции экспрессии гена оценивали с помощью индукции кратному (FI). ФИ в десяти генов были значительно ниже в клетках KD, чем в SC клетках (рис 3). Кроме того, при ограничении на гипоксических условиях, уровни экспрессии всех десяти генов были значительно ниже в клетках KD, чем SC клеток. Эти результаты показали, что HIF-1α нокдаун заметно уменьшил гипоксией индуцированную экспрессию десяти генов. С другой стороны, под нормоксии, выражение PDK1 и BNIP3L была значительно ниже в клетках KD, чем в SC клетках. С другой стороны, уровни экспрессии и LON COX4-2 были значительно выше в клетках КД по сравнению с SC клеток.

глюкозы и инсулина лечения расширенных апоптическая гибель клеток в клетках KD под гипоксией
<р> Далее мы исследовали, влияет ли продвижение поглощения глюкозы гипоксия-индуцированного апоптоза в клетках KD. Жизнеспособность клеток оценивали в клетках KD и SC следующих процедур с контролем (PBS), высоким содержанием глюкозы, инсулина или высоким содержанием глюкозы плюс инсулина (GI). Гипоксия-индуцированной гибели клеток была оценена FI. Смертность клеток при гипоксии сравнивали между контрольной обработки и других видов лечения в обеих клеточных линий (рис.4). В SC клетках, не наблюдалось никаких существенных различий в FI и клеточной смертности при гипоксии у любого из обработок (рис 4а). В KD клетках, ФИ была значительно увеличена гипоксией во всех процедур. В частности, лечение GI дали самый высокий FI среди всех обработок (рис 4б). Смертность клеток при гипоксии в желудочно-кишечном обработанных клеток значительно выше, чем в контрольных клетках, обработанных (фиг.4В). Для того, чтобы исследовать методы лечения, влияет ли производство ROS, уровень ROS анализировали в клетках KD. По сравнению с гипоксическим условиям, уровень РОС был значительно повышен в клетках КД в условиях гипоксии (рис 4в). При гипоксии уровень РОС в клетках KD был значительно увеличен по высоким содержанием глюкозы, инсулина и лечения желудочно-кишечного по сравнению с контрольной обработке. Самый высокий уровень ROS положительно наблюдается в GI-обработанных клетках KD (рис 4в).

Оценка поглощения глюкозы после обработки инсулина
<р> способность поглощения глюкозы анализировали в инкорпорации исследовании 2DG , В SC и KD клеток под нормоксии, включение 2DG был значительно повышен при лечении 2DG по сравнению с необработанными клетками. Включение 2DG дополнительно увеличивается за счет дополнительной обработки инсулина в обеих клетках (Фиг.5А). По сравнению с нормоксии, гипоксия более сильно стимулировало поглощение 2DG в SC клетках, с или без инсулина (фиг.5В). Аналогичные результаты наблюдались в клетках при гипоксии, КД (рис 5б). Тем не менее, при гипоксии, менее 2DG была включена в клетки KD, чем в SC клетках, с добавлением или без дополнительной обработки инсулина (фиг.5В). Для того, чтобы оценить механизм усвоения глюкозы инсулин-зависимый, Перепончатый экспрессия GLUT1 анализировалась в клетках КД при нормоксии и гипоксии. Под нормоксии выражение мембранозной GLUT1 был повышен с высоким содержанием глюкозы и /или лечения инсулина в сравнении с активностью, без обработки (фиг.5С). По сравнению с этим наблюдается при нормоксии, в условиях гипоксии, экспрессия перепончатая GLUT1 был возведен во всех процедур. Кроме того, экспрессия была увеличена высоким содержанием глюкозы и /или лечение инсулином, по сравнению с отсутствием лечения путем (фиг.5С). В частности, выражение мембранозной GLUT1 был наиболее сильно увеличилось на высокий уровень глюкозы и инсулина в крови (GI) лечение в гипоксических клеток кД (фиг.5С). С другой стороны, выражение другого GLUT семейства, GLUT3, была слабо наблюдалась в клетках KD, и эти данные не были изменены среди этих различных обработок (данные не показаны). В этом исследовании, GLUT2 и GLUT4 не были выражены в KD клеток.

HIF-1α нокдаун плюс лечение GI сильно подавляет рост ксенотрансплантатов опухолей у голых мышей
<р> Наконец, мы определили в естественных условиях
эффект лечения GI на KD и SC ксенотрансплантатов. Фиг.6А показывает экспериментальную конструкцию ксенотрансплантата мышиной модели. Через десять дней после подкожной инокуляции СК или клеток KD, ксенографты выращивали на спинах голых мышей. В этот момент, Вестерн-блот-анализ подтвердил HIF-1α экспрессию в опухолях SC, но не в опухолях кД (фиг.6В). После этого три лекарства, состоящие из PBS, глюкоза или GI, внутрибрюшинно вводили голым мышам, несущих SC или опухоль KD (ежедневно с 1-й день до 11-й день). Представительные образы опухоли мышей, обработанных PBS (SC-PBS и KD-PBS), глюкоза (SC-глюкозы и KD-глюкозы) или GI (SC-GI и KD-GI) показаны на рис 6C , Опухоли КД-глюкоза и КД-GI оказалась меньше, чем у других опухолей. Рис 6D показал кривую роста 6 опухолей. Размеры KD-глюкозы и опухолей KD-GI были значительно меньше, чем опухоли KD-PBS на день 12. опухолевой KD-GI был самым маленьким. С другой стороны, у мышей, SC, не было значительной разницы в размерах SC-PBS, SC-глюкозы и SC-GI опухолей (рис 6d). Иммуногистохимическое анализ расщепленной каспазы 3 было проведено с целью оценки апоптоза, индуцированного глюкозой или лечения GI. Положительное выражение расщепленной caspase3 часто наблюдалась в KD-глюкозы и KD-GI опухолей (рис 6е). Тем не менее, все опухоли KD выставлены некоторую степень скола каспазы 3 (рис 6f). В отличие от этого, не было никакого существенного различия в экспрессии расщепленной каспазы 3 среди SC-PBS, SC-глюкозы и опухолей SC-GI. В опухолях К.Д., положительное выражение скола caspase3 был в опухоли КД-PBS значительно выше, чем в опухоли SC-PBS. Кроме того, экспрессия скола caspase3 была достоверно выше в опухолях КД-глюкоза или КД-GI, чем в опухоли КД-PBS. Наибольшее выражение наблюдалось в опухоли KD-GI.

Обсуждение
<р> В настоящем исследовании, HIF-1α нокдаун клетки использовали для исследования летальной ли производство ROS может быть вызвана при гипоксии. Результаты показали, что апоптотической гибели клеток индуцировали в клетках КД, но не в контрольной SC клетках при гипоксии. Одновременно РОС накапливается в нокдаун клеточной линии в зависимости от продолжительности гипоксии. Hypoxia- смерть индуцированных клеток и накопление РФК также наблюдались в различных HIF-1α нокдаун 74-KD клетках, но не в контрольных 74-SC клеток. Кроме того, лечение NAC снижает частоту гипоксия-индуцированной гибели клеток в клетках KD. Эти результаты указывают на возникновение гипоксии-индуцированного апоптоза вследствие чрезмерного накопления ROS в клетках KD и поддерживает предыдущее исследование, что HIF-1 нокаут MEFs умер из-за чрезмерного производства ROS [33].
<Р> ROS образуются в основном в митохондрии в ETC [17, 19]. Сообщалось, что митохондриальная РОС увеличиваются в условиях гипоксии [17, 19]. Если гипоксия сохраняется, индукция HIF-1 приводит к адаптивных механизмов для уменьшения ROS и восстановления окислительно-восстановительного гомеостаза через повышающую регуляцию соответствующих генов [19]. Таким образом, мы исследовали, влияет ли HIF-1α нокдаун экспрессию мРНК десяти генов, участвующих в контроле продукции АФК в условиях гипоксии ( GLUT1
, ALDOC
, PDK1
, LDHA
и MCT4
связанные с эффектом Варбурга; BNIP3
и BNIP3L
относящиеся к mitophagy; LON
и COX4-2
связанные с ETC; и MnSOD
, A ROS мусорщик). Интегрированный анализ серии RT-КПЦР показали, что гипоксия-индуцированную экспрессию всех десяти генов была значительно подавлена ​​в кД клеток, в то время как, при нормоксии, экспрессию мРНК и COX4-2 LON была значительно выше в клетках, KD, чем в SC клетках. Эти результаты показывают, что летальное накопление ROS при гипоксии в HIF-1α нокдаун клеток может быть связано с несколькими нарушениями механизма управления РОС. Таким образом, лечение рака ориентации HIF-1, могут быть эффективными в гипоксической области в желудочной ткани рака. Механизм, лежащий в основе активируемых экспрессии мРНК и LON COX4-2 в клетках KD под нормоксии не могут быть выяснены.
<Р> В соответствии с приведенными выше результатами, мы предположили, что поощрение потребления глюкозы может ускорить гипоксия-индуцированный апоптоз путем дальнейшего производства ROS в HIF-1α бросовым KD клеток. Как и следовало ожидать, лечение GI усиливается гибель клеток в гипоксических KD клеток, что сопровождалось увеличением производства ROS. В исследовании поглощение глюкозы, инсулина увеличивали поглощение 2DG как в SC, и клетки KD. По сравнению с наблюдаемым при нормоксии, гипоксия увеличилось поглощение 2DG в SC и KD клеток, обработанных или без инсулина. Поглощение был увеличен сильнее в СК, чем клетки KD, предполагая разницу из-за ослабленного индукции GLUT1 в гипоксическая KD клеток. С другой стороны, Вестерн-блот-анализ показал, что экспрессия мембранозной GLUT1 была увеличена с высоким содержанием глюкозы и /или лечения инсулина, по сравнению с контрольным лечением в нормоксических и гипоксических KD клеток. В частности, лечение GI наиболее сильно увеличили мембранную экспрессию GLUT1 в гипоксических KD клеток. Предыдущее исследование показало, что инсулин стимулирует транспорт глюкозы путем стимуляции транслокации GLUT4 из внутриклеточных везикул хранения к плазматической мембране в клетках скелетных мышц или адипоцитов [36, 37].

• PLoS ONE: число копий Прибыли в 8q24 и 20q11-q13 в рака желудка являются более распространенными в кишечно-типа, чем дифф…
• PLoS ONE: Сыворотка HER2 является потенциальным заменителем ткани HER2 статуса в рака желудка: систематический обзор…