PLOS ONE: Le apoptotique Effet de HIF-1α Inhibition Combiné avec du glucose ainsi que le traitement de l'insuline sur le cancer gastrique sous hypoxique Conditions

Résumé

Le cancer gastrique se développe dans un environnement hypoxique. HIF-1α est connue pour jouer un rôle important dans le contrôle de la production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) dans les mitochondries dans des conditions hypoxiques. Nous HIF-1alpha knockdown (KD) et des cellules de contrôle (SC) précédemment établie dans la lignée cellulaire de cancer gastrique 58As9. Dans cette étude, nous avons montré que les cellules KD, mais pas des cellules SC, l'apoptose induite dans des conditions d'hypoxie (1% O _{2) en raison de la production excessive de ROS. Une analyse RT-PCR quantitative a démontré que les expressions de dix gènes, qui sont impliqués dans les mécanismes de contrôle de ROS (y compris l'effet Warburg, mitophagy, chaîne de transport d'électrons [ETC] de modification et ROS balayage), ont été réglées par HIF-1α. En outre, la promotion de l'absorption du glucose par le glucose plus l'insuline (GI) un traitement amélioré l'effet apoptotique, qui a été accompagné par une nouvelle production de ROS dans les cellules hypoxiques KD. Une analyse par transfert de Western a montré que l'expression membranaire de GLUT1 dans les cellules KD a été élevée en glucose et /ou des traitements à l'insuline, indiquant que l'absorption du glucose induite par le GI-est médiée par une augmentation de la translocation GLUT1 sur la membrane cellulaire. Enfin, l'effet anti-tumoral de HIF-1α knock-down (KD) en plus GI a été évaluée en utilisant un modèle de xénogreffe de tumeur, où un environnement hypoxique existe naturellement. Par conséquent, le traitement de l'IG fortement inhibé la croissance des tumeurs KD par laquelle l'apoptose cellulaire a été fortement induite par comparaison avec le traitement témoin. En revanche, la croissance des tumeurs SC exprimant HIF-1α n'a pas été affectée par le traitement gastro-intestinal. Pris ensemble, les résultats suggèrent que l'inhibition de HIF-1α, plus IG peut être une thérapie idéale, car l'apoptose due à la destruction des ERO homéostasie est spécifiquement induite dans le cancer gastrique qui se développe dans un environnement hypoxique, mais pas dans le tissu normal sous la conditions aérobies}

Citation:. Tanaka T, Kitajima Y, Miyake S, Yanagihara K, Hara H, Nishijima-Matsunobu A, et al. (2015) Le apoptotique Effet de HIF-1α Inhibition Combiné avec du glucose ainsi que l'insuline de traitement sur le cancer gastrique dans des conditions hypoxiques. PLoS ONE 10 (9): e0137257. doi: 10.1371 /journal.pone.0137257

Editeur: Ester Hammond, Université d'Oxford, ROYAUME-UNI

Reçu: 30 Avril 2015; Accepté le 13 Août 2015; Publié: 4 Septembre 2015

Droit d'auteur: © 2015 Tanaka et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, pourvu que l'auteur et la source originelle sont crédités

Disponibilité des données: Toutes les données pertinentes sont dans le ses fichiers de renseignements à l'appui du papier et

financement:.. les auteurs ont pas de soutien ou de financement pour signaler

intérêts concurrents:. les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

introduction

L'environnement hypoxique est importante dans les tumeurs solides où il accélère leurs comportements malignes [1-4]. Comme d'autres tumeurs solides, le carcinome gastrique est connu pour impliquer de vastes zones de l'hypoxie dans la tumeur [5-7]. conditions hypoxiques induisent plusieurs événements biologiques tels que l'angiogenèse, l'invasion locale, la dissémination métastatique, radio- ou chimiorésistance et le métabolisme énergétique modifié dans de nombreux cancers, conduisant à un mauvais pronostic chez les patients [2-4]
.

Le facteur de transcription hypoxie-inducible factor 1 (HIF-1) est le médiateur principal de l'adaptation cellulaire à l'hypoxie [8-10]. HIF-1 est une protéine hétérodimère consistant en une sous-unité β-exprimé constitutivement (HIF-1β), et une hypoxia-inducible α (HIF-1α), la sous-unité [8-10]. La sous-unité HIF-1α est dégradée par la voie ubiquitine-protéasome sous normoxie. En revanche, en cas d'hypoxie, HIF-1α est stabilisé et se dimérise avec HIF-1β en interaction avec CBP /p300, qui se lie ensuite à l'élément de réponse à l'hypoxie (HRE) sur la région promotrice de centaines de gènes cibles [11-16]. Ces rapports précédents ont conduit à la reconnaissance de HIF-1α en tant que régulateur central dans la pathogenèse du cancer solide

Les espèces réactives de l'oxygène (ROS), tels que l'anion superoxyde (O _{2 ^{. - ), le peroxyde d'hydrogène (H 2 O 2), et le radical hydroxyle (HO •), sont constitués d'espèces d'oxygène radicaux et non radicaux formés par la réduction partielle de l'oxygène. ROS intracellulaire sont principalement générée dans la mitochondrie par phosphorylation oxydative (OXPHOS), un procédé mis en oeuvre par la chaîne de transport d'électrons (CTE) [17]. Lorsque ROS submerger le système de défense antioxydant cellulaire, le stress oxydatif se produit. le stress oxydatif excessif provoque des dégâts ERO induite par des acides nucléiques, des protéines et des lipides et conduit à la mort cellulaire [17, 18].}}

HIF-1α a été rapportée pour contrôler la production de ROS dans des conditions hypoxiques par de multiples mécanismes y compris la conversion du métabolisme énergétique de la phosphorylation oxydative de la glycolyse, qui est désigné sous l'effet Warburg [19-23], l'induction de autophagy mitochondriale sélective (désignée comme mitophagy) [24, 25], ETC. modification par un commutateur de sous-unité de cytochrome c oxydase (COX) [26] et des charognards ROS [27]. Dans la voie métabolique de l'effet Warburg, HIF-1α active d'abord la transcription de GLUT1 Comment faire pour augmenter l'absorption du glucose dans les cellules. Le glucose est ensuite métabolisé en pyruvate par les actions des membres de l'enzyme glycolytique, qui sont connus pour des cibles de HIF-1α [28, 29]. Dans des conditions aérobies, le pyruvate est converti en acétyl-CoA (AcCoA) par pyruvate déshydrogénase (PDH) pour l'entrée dans l'acide tricarboxylique (TCA) cycle. A l'inverse, dans les cellules cancéreuses exposées à une hypoxie, le pyruvate est shunté loin de la mitochondrie, de sorte que HIF-1α régule positivement l'expression de la PDK1 pour inhiber l'activité de PDH. Par la suite, LDHA convertit en variante pyruvate en lactate et MCT4 transporte le lactate hors de la cellule. Ces gènes sont également réglementés par HIF-1α [16, 30, 31]. L'hypoxie induit mitophagy pour empêcher la production de ROS excessive par laquelle les mitochondries endommagées sont éliminés par digestion lysosomale [24, 25]. Des études récentes ont démontré que HIF-1α active les transcriptions des gènes codant pour BNIP3 et BNIP3L, facteurs essentiels dans le processus de mitophagy [32]. Une autre étude a rapporté que HIF-1α régule la commutation de sous-unité COX4 en activant la transcription des gènes liés à l'ETC-COX4-2 et LON, une protéase mitochondriale qui est nécessaire pour la dégradation COX4-1 sous hypoxie [26]. Le commutateur de sous-unité COX4 a été signalé comme une étape importante dans le ROS homéostasie, en raison de son rôle dans l'optimisation de l'efficacité de la respiration sous hypoxie [26]. L'agent d'épuration MnSOD ERO est connu de convertir des radicaux superoxyde en peroxyde d'hydrogène. Une étude antérieure a indiqué que la MnSOD est régulée positivement sous hypoxie, bien que cette régulation positive est induite par HIF-1α n'a pas encore été démontré [27]. Récemment, un autre rapport a démontré la conclusion intéressante que les fibroblastes embryonnaires (MEF) de souris HIF-1α-null hypoxique sont morts en raison de la production de ROS en excès, tandis que les FAE ont été sauvés par le traitement avec l'antioxydant N acétyl-L-cystéine (NAC) [ ,,,0],33]. Pris ensemble, ces rapports indiquent que HIF-1α joue un rôle central dans l'organisation de la production de ROS mitochondriale dans les cellules vivantes sous hypoxie.

Dans cette étude, nous avons cherché à établir un modèle thérapeutique démontrant que l'apoptose induite par l'hypoxie via la surproduction de ROS peut être introduit dans les cellules cancéreuses gastriques déficientes HIF-1α. Nous avons d'abord déterminé si l'hypoxie induit la mort cellulaire par la production excessive des ROS dans le HIF-1α knock-down (KD) des cellules. Par la suite, nous avons abordé l'hypothèse que l'introduction de niveaux élevés de glucose par le traitement des cellules KD avec l'insuline peut augmenter l'effet apoptotique. Enfin, en utilisant un modèle de xénogreffe de tumeur, nous avons proposé que l'inhibition de HIF-1α combinée avec du glucose plus l'insuline (GI) le traitement peut être un traitement potentiel pour le cancer gastrique.

Culture cellulaire Matériaux et méthodes conditions et réactifs

la lignée cellulaire de cancer gastrique 58As9 a été aimablement fourni par le Dr K. Yanagihara (national Hospital cancer Center East, Chiba, Japon) sur Décembre en 2009. la lignée cellulaire 58As9 a été établi à l'origine de la squirrheuse lignée cellulaire de carcinome gastrique dérivé HSC-58 [34]. Cette lignée cellulaire a ensuite été authentifié sur Février 24 ^{e 2015 par la Banque de cellules JCRB (Osaka, Japon). Une autre lignée cellulaire de cancer gastrique, MKN74 a été acheté auprès de Cell Bank, RIKEN Bio Resource Center (Tsukuba, Japon). Dans la présente étude, nous avons utilisé stables cellules HIF-1α knockdown KD et 74 KD, qui ont été établies par la transfection du plasmide siRNA hébergeant les séquences ARNi dans les cellules 58As9 et MKN74 comme décrit précédemment [7, 35]. Les séquences de siRNA ciblant HIF-1α et le contrôle brouillées ARNsi ont été conçues comme suit: HIF-1α ou d'ARNsi pour le KD 74 KD (5'-CCA CAT TCA CGT ATA TGA T-3 ') et bousculade ARNsi pour le SC ou 74- SC (5'-TCT TAA TCG CGT ATA AGG C-3 '). Les cellules ont été cultivées dans un milieu RPMI-1640 (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO, USA) additionné de 10% de sérum inactivé à la chaleur fœtal bovin (FBS) et 100 pg /ml de kanamycine (Meiji, Tokyo, Japon ) et incubées à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée. Les cellules ont été cultivées dans des conditions soit normoxiques (20% O _{2 et 5% de CO 2 dans l'air) ou dans des conditions hypoxiques (1% d'O 2, 5% de CO 2 et 94% de N 2) dans une chambre hypoxique (ASTEC, Fukuoka, Japon), puis traité avec le NAC (Sigma-Aldrich) et de l'insuline (Wako, Osaka, Japon) à une concentration finale de 5 mM et 500 ng /ml, respectivement. La concentration du milieu de glucose élevé a été préparé par l'addition de 45% de D - (+) - une solution de glucose (Sigma-Aldrich) et la concentration finale a été déterminée comme étant de 10 g /L, ce qui est 5 fois plus élevé que dans des conditions normales RPMI-1640.}}

La viabilité des cellules test

La viabilité cellulaire sous normoxie ou hypoxie a été évaluée par des tests trypan d'exclusion de colorant bleu. Pour l'évaluation des effets de traitement de la toxicomanie, y compris NAC, riche en glucose et /ou de l'insuline sur la viabilité des cellules, 1 x 10 ^{5 cellules ont été ensemencées sur des boîtes de culture de 6 cm. Les cellules ont été traitées avec divers médicaments aux concentrations indiquées et cultivées dans des conditions de normoxie et d'hypoxie pendant 24 h à 96 h. A la fin de l'incubation, les cellules flottantes et adhérentes ont été recueillies et rassemblées en un culot par centrifugation (3000 rpm, 5 min). Les cellules ont été remises en suspension dans 90 ul de milieu complet, mélangé avec 10 pi de solution de bleu de trypan à 0,4% et comptées en utilisant un hémocytomètre sous un microscope. Le taux de mortalité cellulaire a été déterminée comme étant le rapport entre le nombre de cellules mortes /nombre total de cellules. Toutes les expériences ont été réalisées en triple et répétées de manière indépendante au moins trois fois.}

Analyse par Western blot

lysats de cellules entières à partir des cellules cultivées et des tumeurs de xénogreffe chez la souris ont été préparées en utilisant un tampon de lyse composée de 150 mmoles /L de NaCl, 50 mmol /L de Tris-HCl (pH 7,6), 0,5% de Triton X-100, et un mélange inhibiteur de protéase de cocktail (Roche, Mannheim, Allemagne). Les lysats cellulaires de la fraction et la membrane cellulaire fraction cytosolique ont été préparés en utilisant un Cytochrome c Releasing Kit Apoptose Assay et un kit d'extraction de protéines de membrane plasmatique (BioVision Inc., Milpitas, CA, USA) selon les instructions du fabricant. L'analyse par transfert de Western a été effectuée comme décrit précédemment [7]. Des aliquotes contenant 30 ug de protéine ont été séparés par électrophorèse en 12.04% de gel Bis-Tris (Invitrogen) et transférés sur une membrane Amersham Hybond ECL (GE Healthcare, Buckinghamshire, Royaume-Uni) dans un tampon de transfert. Après le blocage avec 5% de lait de la peau pendant 30 minutes, la membrane a été incubée avec des anticorps primaires pendant une nuit à 4 ° C. Les anticorps primaires suivants ont été utilisés: anti-HIF-1α (1: 1000 dilution Abcam, Cambridge, Royaume-Uni), anti-caspase 3 (1: 1000, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), c anti cytochrome (1 : 500 dilution BioVision), anti-GLUT1 (1: 100 000 dilution Abcam) et anti-β-actine (1: 10 000 dilution; Sigma-Aldrich, Inc.). Après incubation avec les anticorps secondaires correspondants, les signaux ont été développés en utilisant un système Amersham ECL Plus Western blot Detection (GE Healthcare).

Détection de intracellulaire ROS par cytométrie en flux

Les valeurs intracellulaires ROS ont été évalués en utilisant un kit total ROS Detection (Enzo Life Sciences, Inc., Farmingdale, NY, USA) selon les instructions du fabricant. En bref, KD, SC, les cellules ont été cultivées dans des conditions de normoxie soit ou hypoxie avec ou sans traitements médicamenteux (à savoir, NAC, riche en glucose et /ou de l'insuline) pendant 24 h, 48 h et 72 h. 74 KD et 74-SC ont également été cultivées dans des conditions de normoxie soit ou hypoxie pendant 24, 48, et 72 heures sans aucun traitement médicamenteux. Les cellules ont été lavées et remises en suspension dans la solution de détection ERO. ROS fluorescence a été détectée par le flux FACS Calibur cytomètre (Becton-Dickinson, San Jose, CA) et analysé par le programme Cell Quest Software. Toutes les expériences ont été réalisées en triple. La fluorescence moyenne de la production d'ERO est déterminée automatiquement et présenté comme le GEO signifie.

Extraction de l'ARN total et RT-PCR quantitative

ARN total a été extrait à partir de lignées cellulaires en utilisant un kit d'extraction d'ARN Isogen ( Nippon Gene, Osaka, Japon). Un pg d'ARN a été converti en ADNc en utilisant un As ReverTra (Toyobo) Kit de réaction de transcription inverse. L'ADNc a été utilisé comme matrice pour la PCR. Un temps réel RT-PCR quantitative (RT-qPCR) a été réalisée au moyen du système d'instrument de lumière Cycler (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Allemagne) en utilisant un kit Light-Cycler-FastStart DNA Master SYBR Green I (Roche). Les dix gènes qui ont été analysés par le RT-qPCR étaient les suivants: transporteur de glucose 1 ( GLUT1
), aldolase C ( ALDOC
), la pyruvate déshydrogénase kinase 1 ( PDK1
), lactate déshydrogénase A ( LDHA
) et monocarboxylate transporteur 4 ( MCT4
), Bcl-2 /adénovirus BEI de 19 kDa protéine interagissant 3 ( BNIP3
), BINP3 comme ( BNIP3L
), mitochondrial superoxyde dismutase manganèse ( MnSOD
), une protéase mitochondriale LON
et la cytochrome oxydase sous-unité 4-2 ( COX4 - 2
). Les amorces ont été conçues selon les séquences d'ADNc rapportées (GenBank, Bethesda, MD) (tableau 1). Après avoir effectué une étape de dénaturation à 95 ° C pendant 3 min, une amplification par PCR a été réalisée avec 50 cycles de 15 secondes de dénaturation à 95 ° C, 5 s d'hybridation à 60 ° C et 10 s d'extension à 72 ° C. Les valeurs quantitatives ont été normalisés par rapport à la β-actine (
ACTB) expression (tableau 1). Toutes les expériences ont été réalisées en triple et répétées de manière indépendante au moins trois fois.

l'absorption du glucose dosage

L'absorption du glucose dans les cellules en culture a été déterminée au moyen d'une 2-désoxyglucose (2DG) Trousse de mesure d'absorption (COSMO BIO Co. Ltd., Tokyo, Japon). En bref, les cellules ont été cultivées dans des conditions de sérum pendant 6 h, suivi par la poursuite de la culture pendant 18 heures dans du milieu normal supplémenté avec 10% de FBS. Les cellules ont été incubées pendant 24 h sous normoxie et d'hypoxie. Ensuite, les cellules ont été traitées avec ou sans insuline 500 ng /ml pendant 18 min. Finalement, les cellules ont été traitées avec 2DG pendant 20 minutes et on les soumet à la mesure de l'absorption 2DG selon les instructions du fabricant. Toutes les expériences ont été réalisées en triple et les valeurs moyennes ont été calculées.

Les études animales

Les protocoles d'animaux ont été approuvés par les soins et l'utilisation des comités institutionnels animaux de l'Université Saga (PROTOCOLE 24-008-0 ) et conformes aux lignes directrices ARRIVE pour l'utilisation des animaux dans la recherche. 4 semaines d'âge des souris BALB /cA Jcl athymiques femelles (nu /nu) ont été obtenus à partir de Nihon Crea Co. (Osaka, Japon). Les animaux ont été maintenus dans des conditions exemptes d'agents pathogènes spécifiques. Ils ont reçu de la nourriture et de l'eau stérile autoclavé avec un cycle de lumière-obscurité de 12 h. Les souris ont été acclimatés à l'environnement pendant 7 jours avant les expériences. cellules KD ou SC (3 × 10 ^{6) ont été injectés sous-cutanée dans le dos des souris (n = 9 pour chaque lignée cellulaire). Dix jours après l'inoculation sous-cutanée, les xénogreffes des deux cellules sont devenues palpables. Neuf souris porteuses KD ou SC xénogreffes ont ensuite été divisés en trois groupes de traitement par le glucose (8 g /kg /jour, Sigma), du glucose ainsi que de l'insuline (GI) (1 unité par 3 g de glucose /jour, de Wako) ou un tampon phosphate salin (PBS) comme traitement témoin. Chacun de ces médicaments ont été administrés par voie intrapéritonéale en trois souris (six tumeurs total) toutes les 24 h du jour 1 au jour 11. Au cours de cette période, les tumeurs ont été mesurées en 2 dimensions perpendiculaires avec un étrier tous les quatre jours. La taille de la tumeur ( T
) a été évaluée comme la superficie maximale de coupe et déterminé par la formule suivante: T
= π /4 × un
× b
, où un
est l'axe plus court (mm) et b
est plus long axe (mm). Les souris ont été sacrifiées 12 jours après les traitements médicamenteux et les tumeurs ont été récoltées pour l'expérience suivante.}

caspase 3 immunohistochimie et l'évaluation de l'apoptose in vivo

Le tumeurs congelées ont été intégrés avec Tissue-Tek octobre Composé. Ces blocs ont été découpés en sections de 4 um d'épaisseur. Pour la récupération des antigènes, les lames ont été chauffées dans un tampon Tris-EDTA (pH 9,0) dans un micro-ondes (500 W) pendant 5 min. Les sections ont ensuite été incubées avec un anti-caspase 3 (1: 200, Cell Signaling Technology) pendant 2 h à température ambiante, et le système DAKO Envision + (Dako Cytomation, Glostrup, Danemark) a été utilisé comme anticorps secondaire. Les signaux ont été visualisées avec diaminobenzidine (0,02%). Pour l'évaluation de l'apoptose, caspase clivé cellules 3-positifs avec des noyaux de couleur brune ont été comptés dans cinq champs à un grossissement de 400x et la moyenne a été calculée. L'expression immunohistochimique de caspase clivé 3 a été aveuglément examiné et évalué par un pathologiste certifié (Dr AN).

L'analyse statistique

Les données ont été analysées par une ANOVA en utilisant le progiciel Prism 5 logiciel ( GraphPad Software, La Jolla, CA). Pour la comparaison entre les deux groupes, les différences dans les valeurs moyennes ont été évaluées par T-
test de Student et de Mann-Whitney test U de. Pour la comparaison entre les trois groupes, les tests de Bonferroni post hoc ont été effectuées pour une ANOVA à une voie. Une valeur de p < 0,05 a été considérée comme statistiquement significative. Toutes les données sont exprimées en moyenne ± SEM.

Résultats

HIF-1α knockdown induit la mort cellulaire apoptotique sous hypoxie dans les cellules cancéreuses gastriques 58As9

L'expression de HIF-1α était évalués stable HIF-1α knockdown (KD) cellules et SC (comme la lignée cellulaire de contrôle) cellules. Une analyse Western blot a montré que l'expression de HIF-1α a été complètement renversé dans les cellules KD après 8 heures en hypoxie par rapport aux cellules SC (figure 1A). Le taux de mort cellulaire a été estimé après 24 h à 96 heures sous normoxie et hypoxie. Le taux de mortalité était plus élevé dans les cellules KD que dans les cellules SC sous normoxie pendant 24 à 96 heures, mais les différences ne sont pas statistiquement significatives (figure 1B). En revanche, le taux de mort cellulaire dans les cellules KD a été fortement augmentée sous hypoxie et significativement supérieure à celle observée dans les cellules SC à 72 et 96 heures (figure 1C). L'analyse par transfert de Western a démontré que la caspase 3 clivée, ainsi que le cytochrome c cytosolique étaient élevés dans les cellules KD, mais pas dans les cellules SC en hypoxie pendant 8 heures (figure 1D et 1E). Hypoxie la mort cellulaire induite a également été confirmée dans d'autres cellules knockdown gastriques cancéreuses 74 KD (S1 Fig) HIF-1α. Ces résultats indiquent que l'hypoxie induit fortement l'apoptose dans le knockdown KD lignée cellulaire de HIF-1α.

nécrophage ROS inversé le phénotype apoptotique observée dans les cellules knockdown HIF-1α

Le niveau de ROS intracellulaire a été estimée et par rapport entre les cellules KD et SC. Le niveau ERO augmenté d'une manière dépendante du temps dans les cellules en hypoxie KD, tandis que le niveau a été légèrement élevée dans les cellules SC (figure 2A). Le niveau de ROS dans les cellules KD était significativement plus élevée sous hypoxie pendant 24 à 72 heures inférieur à celui dans les cellules SC (figure 2A). Les taux de ROS ont également été évalués dans les cellules 74-SC et les cellules de 74 KD (S2) Fig. Les taux de ROS ne différaient pas entre les 74-SC et 74 KD cellules sous normoxie (S2A) Fig. Toutefois, en vertu de l'hypoxie, les taux de ROS étaient significativement plus élevés dans les cellules de 74 KD que dans les cellules 74-SC à 48 à 72 heures (S2B) Fig. NAC, un antioxydant, a diminué de manière significative le niveau des ROS dans les cellules KD sous hypoxie pendant 48 à 72 heures (figure 2B). Afin de déterminer si la production de ROS induit la mort cellulaire induite par l'hypoxie dans les cellules KD, le taux de mort cellulaire avec ou sans NAC a été évaluée dans les cellules KD sous normoxie et hypoxie. traitement NAC n'a pas d'incidence sur le taux de mort cellulaire dans les cellules KD sous normoxie (Fig 2C). En revanche, le traitement du CNA a réduit de manière significative la mort cellulaire dans les cellules KD sous hypoxie pendant 48 à 96 heures (figure 2D).

HIF-1α effet de choc a réduit l'induction hypoxique des différents gènes impliqués dans le contrôle de la production de radicaux libres

Pour étudier la ROS accumulation induite par l'hypoxie dans les cellules knockdown HIF-1α, l'expression de l'ARNm de dix gènes, qui sont impliqués dans le mécanisme de contrôle ROS ( GLUT1
, ALDOC
, PDK1
, LDHA
, MCT4
, BNIP3
, BNIP3L
, LON
, COX4-2
et MnSOD
) ont été analysées en utilisant une RT-qPCR. L'induction hypoxique de l'expression génique a été évaluée par le pli d'induction (FI). L'IF dans les dix gènes étaient significativement plus faibles dans les cellules KD que dans les cellules SC (figure 3). En outre, lorsque restreinte aux conditions hypoxiques, les niveaux de tous les dix gènes d'expression étaient significativement plus faibles dans les cellules KD que les cellules SC. Ces résultats montrent que HIF-1α effet de choc a diminué de façon marquée l'expression induite par hypoxie des dix gènes. D'autre part, sous normoxie, l'expression de PDK1 et BNIP3L était significativement plus faible dans les cellules KD que dans les cellules SC. A l'inverse, les niveaux d'expression COX4-2 LON et étaient significativement plus élevés dans les cellules KD par rapport aux cellules SC.

traitements de glucose et d'insuline amélioré la mort cellulaire apoptotique dans les cellules sous hypoxie
KD

Nous avons ensuite cherché à savoir si la promotion de l'absorption du glucose affecte l'apoptose induite par l'hypoxie dans les cellules KD. La viabilité cellulaire a été évaluée dans les cellules KD et SC suivants traitements avec le contrôle (PBS), taux élevé de glucose, d'insuline ou glucose élevé, plus l'insuline (GI). la mort cellulaire induite par l'hypoxie a été estimé par la FI. Le taux de mortalité cellulaire sous hypoxie a été comparé entre le traitement témoin et les autres traitements dans les deux lignées cellulaires (figure 4). Dans les cellules SC, aucune différence significative dans le taux de mortalité FI et de cellules en hypoxie ont été observées chez l'un des traitements (figure 4A). Dans les cellules de KD, la FI a été significativement augmentée par l'hypoxie dans tous les traitements. En particulier, le traitement GI a donné le plus élevé parmi tous les traitements FI (figure 4B). Le taux de mortalité cellulaire sous hypoxie était significativement plus élevée dans les cellules gastro-intestinales traitées que dans les cellules témoins traitées (figure 4B). Afin de déterminer si les traitements ont affecté la production de ROS, le niveau ROS a été analysée dans les cellules KD. En comparaison avec les conditions normoxiques, le niveau ROS a été significativement plus élevée dans les cellules KD dans des conditions hypoxiques (figure 4C). Sous l'hypoxie, le niveau de ROS dans les cellules KD a été significativement augmentée par une forte glucose, l'insuline et le traitement de GI en comparaison pour contrôler le traitement. Le niveau de ROS le plus élevé a été positive observée dans les cellules KD GI traités (figure 4C).

Évaluation de l'absorption du glucose après un traitement à l'insuline

La capacité du glucose d'absorption a été analysée dans une étude d'incorporation 2DG . Dans les SC et KD cellules sous normoxie, l'incorporation 2DG était significativement élevée par le traitement 2DG par rapport aux cellules non traitées. L'incorporation 2DG a été augmentée par le traitement supplémentaire de l'insuline dans les cellules (figure 5A). Par rapport à la normoxie hypoxie plus fortement stimulé l'absorption 2DG dans les cellules SC, avec ou sans insuline (figure 5B). Des résultats similaires ont été observés dans les cellules KD sous hypoxie (figure 5B). Toutefois, en vertu de l'hypoxie, moins 2DG a été incorporé dans les cellules KD que dans les cellules SC, avec ou sans le traitement d'insuline supplémentaire (figure 5B). Pour évaluer le mécanisme de l'absorption du glucose insulino-dépendant, l'expression membraneuse de GLUT1 a été analysée dans les cellules KD sous normoxie et hypoxie. Sous normoxie, l'expression GLUT1 membraneux a été élevé à haute teneur en glucose et /ou un traitement à l'insuline par rapport à celle sans traitement (figure 5C). Par rapport à celle observée dans des conditions de normoxie, sous hypoxie, l'expression GLUT1 membraneux était élevé dans tous les traitements. En outre, l'expression a été augmentée de glucose élevé et /ou un traitement à l'insuline, par rapport à celle de l'absence de traitement (figure 5C). En particulier, l'expression de GLUT1 membraneuse a été le plus fortement augmenté par une forte glucose et d'insuline (GI) de traitement dans les cellules hypoxiques KD (figure 5C). D'autre part, l'expression d'une autre famille de GLUT, GLUT3, a été légèrement observée dans les cellules KD, et cette conclusion n'a pas été modifiée entre ces différents traitements (données non présentées). Dans cette étude, GLUT2 et GLUT4 ne sont pas exprimés dans les cellules KD.

knockdown de HIF-1α plus le traitement de GI fortement supprimé la croissance de xénogreffes de tumeurs chez la souris nude

Enfin, nous avons déterminé la in vivo
effet du traitement de GI sur des xénogreffes tumorales KD et SC. La figure 6A montre la conception expérimentale du modèle murin de xénogreffe. Dix jours après l'inoculation sous-cutanée de SC ou de cellules KD, xénogreffes ont été cultivées sur le dos des souris nude. A ce stade, une analyse par transfert Western a confirmé l'expression de HIF-1α dans les tumeurs SC, mais pas dans les tumeurs KD (figure 6B). Ensuite, trois médicaments, composé de PBS, de glucose ou de l'IG, par voie intrapéritonéale ont été injectées dans des souris nues portant une tumeur cutanée ou KD (tous les jours du jour 1 au jour 11). Les images représentatives des souris porteuses de tumeurs qui ont été traitées avec du PBS (SC-PBS et KD-PBS), du glucose (SC-glucose et KD-glucose) ou IG (SC-GI et KD-GI) sont représentés sur la figure 6C . Les tumeurs KD KD-glucose et IG ont semblé être plus petites que les autres tumeurs. La figure 6D montre la courbe des 6 tumeurs de croissance. Les tailles des KD-glucose et les tumeurs KD-GI étaient significativement plus petites que la tumeur KD-PBS au jour 12. Le modèle KD-GI tumeur était le plus petit. D'autre part, chez les souris SC, il n'y avait pas de différence significative de la taille du SC-PBS, SC-glucose et les tumeurs SC-GI (figure 6D). Une analyse immunohistochimique de la caspase 3 clivée a été réalisée pour évaluer l'apoptose induite par le glucose ou le traitement gastro-intestinal. L'expression positive de caspase3 clivé a été fréquemment observée dans le KD-Glucose et tumeurs KD-GI (figure 6E). Cependant, toutes les tumeurs KD présentaient un certain degré de caspase 3 clivée (figure 6F). En revanche, il n'y avait pas de différence significative dans l'expression de la caspase 3 clivée entre le SC-PBS, SC-glucose et les tumeurs SC-GI. Dans les tumeurs KD, l'expression positive de caspase3 clivée était significativement plus élevée dans la tumeur KD-PBS que dans la tumeur SC-PBS. En outre, l'expression de caspase3 clivée était significativement plus élevée dans les tumeurs KD KD-glucose ou le GI que dans la tumeur KD-PBS. L'expression la plus élevée a été observée dans la tumeur KD-GI.

Discussion

Dans la présente étude, les cellules knockdown HIF-1α ont été utilisés pour déterminer si la production de ROS létale peut être induite en hypoxie. Les résultats ont montré que la mort cellulaire par apoptose a été induite dans les cellules KD, mais pas dans les cellules de contrôle SC en hypoxie. Simultanément, ERO accumulée dans la lignée de cellules knock-down en fonction de la durée de l'hypoxie. Hypoxie mort cellulaire induite et de l'accumulation de ROS ont également été observées dans les différentes cellules de 74 KD knockdown HIF-1α, mais pas dans les cellules 74-SC contrôle. En outre, le traitement du CNA a réduit le taux de mort cellulaire induite par l'hypoxie dans les cellules KD. Ces résultats indiquent l'apparition de l'apoptose induite par l'hypoxie due à l'accumulation excessive des ROS dans les cellules KD et pris en charge une étude précédente que HIF-1alpha MEFs knock-out sont morts en raison de la production excessive des ROS [33].

ROS sont principalement généré en les mitochondries par l'ETC [17, 19]. Il a été rapporté que les ERO mitochondriales sont augmentés dans des conditions hypoxiques [17, 19]. Si l'hypoxie persiste, l'induction de HIF-1α conduit à adaptatifs mécanismes pour réduire ROS et rétablir l'homéostasie redox via la régulation positive des gènes concernés [19]. Nous avons donc cherché à savoir si HIF-1α knockdown affecté l'expression de l'ARNm de dix gènes impliqués dans le contrôle de la production de ROS en hypoxie ( GLUT1
, ALDOC
, PDK1
, LDHA
et MCT4
relatif à l'effet Warburg; BNIP3
et BNIP3L
relatif à mitophagy; LON
et COX4-2
relatif à l'ETC, et MnSOD
, un capteur de ROS). Les analyses intégrées de la série RT-qPCR ont démontré que l'expression induite par l'hypoxie des dix gènes a été supprimée de manière significative dans les cellules KD, alors que, sous normoxie, l'expression de l'ARNm de LON et COX4-2 était significativement plus élevée dans les cellules KD que dans les cellules SC. Ces résultats indiquent que l'accumulation létale d'ERO sous hypoxie dans les cellules knock-down HIF-1α pourrait être due à de multiples perturbations du mécanisme de commande ERO. Par conséquent, la thérapie du cancer visant HIF-1α peut être efficace dans la région hypoxique dans un tissu de cancer gastrique. Le mécanisme sous-jacent de l'expression de l'ARNm upregulated de LON et COX4-2 dans les cellules KD sous normoxie n'a pas pu être clarifiée.

Selon les résultats ci-dessus, nous avons supposé que la promotion de l'absorption du glucose peut accélérer induite par l'hypoxie l'apoptose par la poursuite de la production de ROS dans les cellules KD knockdown HIF-1α. Comme prévu, le traitement de GI amélioré la mort cellulaire dans les cellules hypoxiques KD, qui a été accompagné par une augmentation de la production de ROS. Dans l'étude de l'absorption du glucose, l'insuline augmente l'absorption 2DG tant dans le SC et les cellules KD. Par rapport à celle observée sous normoxie hypoxie augmente l'absorption 2DG dans les cellules SC et KD traitées avec ou sans insuline. L'absorption a été augmenté plus fortement dans le SC que les cellules KD, suggérant une différence due à l'induction de GLUT1 atténuée dans les cellules hypoxiques KD. D'autre part, une analyse par Western Blot a montré que l'expression GLUT1 membraneux a été augmentée à teneur élevée en glucose et /ou le traitement à l'insuline, par rapport au traitement témoin dans les cellules KD normoxiques et hypoxiques. En particulier, le traitement GI le plus fortement augmenté l'expression de GLUT1 membraneuse dans les cellules hypoxiques KD. Une étude antérieure a indiqué que l'insuline favorise le transport du glucose en stimulant la translocation de GLUT4 à partir de vésicules de stockage intracellulaire de la membrane plasmique dans les cellules musculaires squelettiques ou des adipocytes [36, 37].

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• PLOS ONE: Sérum HER2 est un substitut potentiel de tissus statut HER2 dans le cancer gastrique: Une revue systématique et méta-analyse