PLoS ONE: apoptozės poveikis HIF-1α slopinimas Kombinuotoji gliukozės plius gydymą insulinu skrandžio vėžio pagal hipoksinio sąlygos

Anotacija

Skrandžio vėžys auga pagal hipoksinio aplinkoje. HIF-1α yra žinoma, vaidina svarbų vaidmenį reaktyvių deguonies formų (ROS) į mitochondrijas pagal hipoksinės sąlygomis, kontroliuojant gamybos. Mes anksčiau nustatyto HIF-1α triuškinantis "(KD) ląsteles ir kontrolė (SC) ląsteles 58As9 skrandžio vėžio ląstelių linija. Šiame tyrime mes atskleidė, kad KD ląsteles, bet ne SC ląsteles, sukeltos apoptozės sąlygomis hipoksija (1% O _{2) dėl pernelyg didelio gamybos ROS. Kiekybinė PGR analizė parodė, kad dešimt genų, kurie yra įtraukti į kontrolės mechanizmus ROS (įskaitant Warburg poveikį, mitophagy, elektronų transporto grandinės [ETC] modifikacijos ir ROS oro kondicionavimo) išraiškas, buvo reguliuojami HIF-1α. Be to, gliukozės įsisavinimą gliukoze plius insulino (GI) gydymui skatinimas sustiprintas apoptozės poveikį, kuris buvo kartu su tolesnio ROS gamybos hipoksinės KD ląsteles. Vakarų dėmė analizė parodė, kad membraninis išraiška GLUT1 į KD ląstelių buvo padidėjusi gliukozės kiekis ir /ar insulino gydymo, nurodant, kad GN sukeltos gliukozės patekimas tarpininkaujant padidėjusios GLUT1 perkėlimas dėl ląstelių membranose. Pagaliau, priešnavikinis poveikis HIF-1α triuškinantis (KD), taip pat GI buvo įvertintas naudojant auglio svetimo transplantanto modelį, kai kraujagyslių, hipoksinių aplinka natūraliai egzistuoja. Kaip rezultatas, GI gydymas stipriai slopino KD navikų, pagal kurią ląstelių apoptozę buvo labai indukuotų palyginti su kontroliniu variantu augimą. Priešingai, PK navikų išreiškė HIF-1α augimas nebuvo paveikti GN gydymą. Paimti kartu, rezultatai rodo, kad HIF-1α slopinimas plius GI gali būti idealus terapija, nes apoptozę dėl to, kad ROS homeostazės naikinimo yra specialiai sukeltas skrandžio vėžio, kad auga pagal hipoksinio aplinkos, bet ne normalaus audinio pagal aerobinėmis sąlygomis}

nurodomoji dalis:. Tanaka T Kitajima Y Miyake S Yanagihara K Hara H Nishijima-Matsunobu A et al., (2015) apoptozės poveikis HIF-1α slopinimas Kartu su gliukozės plius gydymą insulinu skrandžio vėžio pagal hipoksinio sąlygų. PLoS ONE 10 (9): e0137257. Doi: 10,1371 /journal.pone.0137257

redaktorius: Ester Hammond Oksfordo universitetas, JUNGTINĖ KARALYSTĖ

Įstojo: balandžio 30, 2015; Priimtas rugpjūčio 13, 2015 m Paskelbta: Spalis 4, 2015

Visos teisės saugomos: © 2015 Tanaka et al. Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Duomenų Prieinamumas: Visi susiję duomenys yra per popieriaus ir jo Pagalbinė informacija failus

finansavimas:.. autoriai neturi paramą ar finansavimą pranešti

konkuruojančių interesų. autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

kraujagyslių, hipoksinių aplinka yra pakankamai dideli solidinių navikų, kur jis spartina savo piktybinius elgesį [1-4]. Kaip ir kiti solidinių navikų, skrandžio karcinoma yra žinoma, kad įtraukti plačius sritis hipoksija per naviko [5-7]. Hipoksinio sąlygos sukelti keletą biologinių renginių, tokių kaip angiogenezę, vietos invazijos, metastazuojantys, radijo ar Atsparumas cheminėms ir pakeisti energijos apykaitos daugelyje karcinoma, todėl prastos prognozės pacientams [2-4].

transkripcijos faktorius hipoksija indukuojamas 1 faktorius (HIF-1) yra pagrindinis tarpininkas korinio ryšio prisitaikyti prie hipoksija [8-10]. HIF-1 yra heterodimerinis baltymas, sudarytas iš konstitutyviai išreikštas β-subvieneto (HIF-1β) ir hipoksija indukuojamas α (HIF-1α) subvieneto [8-10]. HIF-1α subvieneto yra skaidomas ubikvitino-proteosomos keliu pagal normoxia. Priešingai, pagal hipoksija, HIF-1α stabilizuojama ir dimerizuojasi su HIF-1β bendrauja su CBP /P300, kuris vėliau jungiasi su hipoksija reagavimo elemento (HRE) dėl promotoriaus regione šimtai tikslinių genų [11-16]. Šie ankstesni pranešimai paskatino HIF-1α pripažinimo centrinio reguliuotojo kietų vėžio patogenezės

reaktyvių deguonies formų (ROS), pavyzdžiui, superoksido anijono (O _{2 ^{. - ), vandenilio peroksidas (H 2O 2), ir hidroksilo radikalas (HO •), susideda iš radikalą ir ne radikalų deguonies formų, susidariusių dalinio sumažinimo deguonies. Ląstelės viduje ROS daugiausia yra gaunamos, kurį oksidacinio fosforilinimo (OXPHOS) mitochondrijas, procesas, elektronų transporto grandinės (ETC) atliekamas [17]. Kai ROS sukrėsti ląstelių antioksidacinį gynybos sistemą, oksidacinis stresas pasireiškia. Pernelyg oksidacinis stresas sukelia ROS-tarpininkaujant žalą iš nukleino rūgščių, baltymų ir lipidų ir veda prie ląstelių mirtis [17, 18].}}

Buvo pranešta kontroliuoti ROS gamybą pagal hipoksinės sąlygomis per kelis mechanizmus HIF-1α įskaitant energijos apykaitos konversijos iš OXPHOS į glikolizės, kuri yra vadinama Warburg poveikio [19-23], mitochondrijų selektyvaus autofagija (paskirtos mitophagy) indukcijos [24, 25], ETC keičia subvieneto jungiklis citochromo c oksidazės (COG) [26] ir ROS sugerejus [27]. Į metabolizmo būdus, Warburg poveikio, HIF-1α pirmasis suaktyvina GLUT1
padidinti gliukozės įsisavinimą ląstelėse transkripciją. Gliukozės tada yra metabolizuojamas į piruvato pagal glikolizinių fermentų narių veiksmų, kurie yra žinomi tikslus HIF-1α [28, 29]. Aerobinėmis sąlygomis, piruvato yra konvertuojamas į acetil-CoA (AcCoA) pagal piruvato dehidrogenazės (PDH) įvestų į trikarboksirūgšties (TCA) ciklo metu. Priešingai, vėžinių ląstelių, veikiamų hipoksija, piruvato yra nustumiami nuo mitochondrijas, kuriuo HIF-1α upregulates į PDK1 išraišką slopina PDH veiklą. Vėliau LŠTA alternatyviai konvertuoja piruvato į laktato ir MCT4 veža laktato iš ląstelių. Šie genai taip pat reglamentuoja HIF-1α [16, 30, 31]. Hipoksija sukelia mitophagy užkirsti kelią pernelyg dideliam ROS gamybą, kuri pažeistų mitochondrijos yra eliminuojami per lizosominio virškinimo [24, 25]. Naujausi tyrimai parodė, kad HIF-1α aktyvuoja genų, koduojančių BNIP3 ir BNIP3L, esminius veiksnius mitophagy procesą [32] transkripcijas. Kitas tyrimas pranešė, kad HIF-1α reguliuoja COX4 subvieneto perjungimas aktyvuojant ETC susijusias genų COX4-2 ir LON, mitochondrijų proteazės, kuri yra reikalinga COX4-1 degradacija pagal hipoksija [26] transkripciją. COX4 subvieneto jungiklis buvo pranešta kaip svarbų žingsnį ROS homeostazės, dėl savo vaidmens optimizavimas kvėpavimo efektyvumą pagal hipoksija [26]. ROS sugėriklis MnSOD yra žinoma, kad konvertuoti superoksido radikalų su vandenilio peroksidu. Ankstesnis tyrimas pranešė, kad MnSOD yra aktyvinama pagal hipoksija, nors ar tai ląstelę tarpininkaujant HIF-1α dar nebuvo parodyta [27]. Neseniai kitas ataskaita parodė įdomų išvados, kad embrioninės fibroblastai (MEF) hipoksinio HIF-1α null pelių mirė dėl perteklinio ROS gamybą, o MEF buvo išgelbėti gydymo su antioksidantas N acetil-L-cisteino (ŠAT) [ ,,,0],33]. Kartu paėmus, šios ataskaitos rodo, kad HIF-1α vaidina pagrindinį vaidmenį organizuojant mitochondrijų ROS gamybą gyvų ląstelių pagal hipoksija.

Šiame tyrime siekėme nustatyti terapinį modelį, rodančius, kad hipoksijos sukeltos apoptozės per apie ROS perprodukcija gali būti pristatyta HIF-1α trūkumas skrandžio vėžio ląsteles. Mes iš pradžių nustatyti, ar hipoksija sukelia ląstelių žūtį perviršinio ROS gamybą į HIF-1α triuškinantis (KD) ląsteles. Vėliau kreipėmės į hipotezę, kad didelio gliukozės lygio įvedimas į KD ląstelių su insulinu gydyti gali padidinti apoptozės poveikį. Galiausiai, naudojant navikas svetimo modelį, mes pasiūlėme, kad HIF-1α slopinimas kartu su gliukozės plius insulino (GI) gydymui gali būti potencialus gydymas skrandžio vėžio.

Medžiagos ir metodai

Mobilusis kultūra sąlygos ir reagentai

skrandžio vėžio ląstelių linija 58As9 buvo maloniai pateikė dr K. Yanagihara (Nacionalinis vėžio centras ligoninės Rytuose, Chiba, Japonija) nuo gruodžio 2009. 58As9 ląstelių linijos iš pradžių buvo nustatytas nuo Tarpikliai skrandžio karcinoma kilmės ląstelių linija SAK-58 [34]. Ši ląstelių linija buvo tada dar patvirtintas vasario 24 ^{-ąją, 2015 metų JCRB Mobilusis bankas (Osaka, Japonija). Kitas skrandžio vėžio ląstelių linija, MKN74 buvo įsigytas iš ląstelių bankas, RIKEN Biologinių išteklių centro (Tsukuba, Japonija). Šiame tyrime mes naudojome stabilius HIF-1α triuškinantis ląsteles KD ir 74-KD, kuri buvo nustatyta atsižvelgiant į siRNA plazmidžių padermių RNAi sekas į 58As9 ir MKN74 ląstelių transfekciją kaip aprašyta anksčiau [7, 35]. Į siRNA sekas skirtos HIF-1α ir kontrolės plakta siRNR buvo suprojektuoti taip: HIF-1α siRNR už KD ar 74-KD (5'-CCA CAT TBS CGT ATA TGA, T-3) ir peštynės siRNR SC arba 74- AB (5'-TCT TPI TCG CGT ATA AGG, C-3 "). Ląstelės buvo auginamos RPMI-1640 terpėje (Sigma-Aldrich, Inc, St. Louis, MO, JAV), papildytoje su 10% šilumos-inaktyvuota vaisiaus galvijų serumo (FBS) ir 100 mikrogramų /ml kanamicinui (Meiji, Tokijas, Japonija ) ir inkubuojama 37 ° C temperatūroje drėgnoje atmosferoje. Ląstelės buvo auginamos pagal arba normoxic sąlygomis (20% O _{2 ir 5% CO 2 ore) arba hipoksinių sąlygos (1% O 2, 5% CO 2 ir 94% N 2) į hipoksinio kameros (ASTEC, Fukuoka, Japonija) ir po to yra veikiamas su NAC (Sigma-Aldrich) ir insulino (WAKO, Osaka, Japonija), kurio galutinė koncentracija 5 mM ir 500 ng /ml, atitinkamai. Iš aukšto gliukozės terpės koncentracija buvo pagamintas būdu pagal 45% D to - (+) - gliukozės tirpalo (Sigma-Aldrich) ir galutinė koncentracija buvo nustatyta, kad 10 g /l, kuris yra 5 kartus didesnis nei, kad įprastu būdu RPMI-1640 terpėje.}}

Mobilusis gyvybingumo tyrimą

ląstelių gyvybingumas pagal normoxia ar hipoksija buvo įvertintas Trypan mėlyna dažų pašalinimo tyrimus. Dėl priklausomybės nuo narkotikų gydymo poveikio vertinimu, įskaitant NAC, aukštos gliukozės ir /ar insulino dėl ląstelių gyvybingumo, 1 × 10 ^{5 ląstelės buvo pasėjamos į 6 cm kultūros patiekalų. Ląstelės buvo gydomi įvairių su narkotikais, nurodytų koncentracijų ir kultivuojamos pagal normoxia arba hipoksija 24 h iki 96 h. Ties Inkubavimo pabaigoje, plaukiojantieji ir prisitvirtinę ląstelės buvo surinkti ir daro žirnelius centrifuguojant (3000 rpm, 5 min). Ląstelės buvo resuspenduotos 90 pL visiškai terpėje, sumaišyti su 10 pL 0,4% Trypan mėlynojo tirpalo ir skaičiuojami naudojant hemocitometru pagal mikroskopu. Ląstelių mirtis norma buvo nustatyta kaip žuvusių ląstelių /bendras laukų ląstelių skaičiaus santykis. Visi eksperimentai buvo atliekami trimis egzemplioriais ir savarankiškai pakartoti bent tris kartus.}

Vakarų dėmė analizė

Sveikos ląstelių fragmentai iš išaugintų ląstelių ir ksenografiniuose navikų pelių buvo paruošti naudojant lizės buferiniame tirpale, kurį sudaro 150 mmol /L NaCl, 50 mmol /l Tris-HCl (pH 7,6), 0,5% Triton X-100, ir proteazės inhibitorius kokteilis mišinys (Roche, Mannheim, Vokietija). Ląstelių fragmentai iš citozoliniame frakcija ir ląstelių membranų frakcijos buvo paruošti naudojant citochromo c atpalaiduojančio Apoptozę Analizės Kit ir Plazma membranos baltymo nusiurbimu rinkinį (BioVision Inc., Milpitas, CA, JAV), pagal gamintojo nurodymus. Western blot testo analizė buvo atlikta kaip buvo aprašyta anksčiau [7]. Mėginiai, kuriuose yra 30 mikrogramų baltymo buvo atskiriama elektroforezės 4-12% bis-tri Gel (Invitrogen) ir perkeliamas ant kurio "Amersham Hybond-ECL membranos (" GE Healthcare, Buckinghamshire, Jungtinė Karalystė) į perdavimo buferio. Po blokavimo su 5% odos pieno 30 min, membrana buvo inkubuojami su pirminiais antikUnais per naktį 4 ° C temperatūroje. buvo naudojami šie pirminiai antikūnai: Anti-HIF-1α (1: 1000 atskiedžiant Abcam, Kembridžas, Jungtinė Karalystė), anti-suskaldyti kaspazės 3 (1: 1000, Mobilaus ryšio Signalizacijos technologija, Danvers, MA), anti-citochromo c (1 : 500 praskiedimą, BioVision), anti-GLUT1 (1: 100,000 praskiedimo, Abcam), ir anti-β-aktino (1: 10.000 praskiedimo; Sigma-Aldrich, Inc). Po inkubacijos su atitinkamų antrinių antikūnų, signalai buvo sukurta naudojant "Amersham ECL Plus Imunoblotingo aptikimo sistema (" GE Healthcare ").

aptikimas ląstelėje ROS tėkmės citometrijos

Ląstelės viduje ROS vertės buvo vertinamos naudojant viso ROS aptikimo rinkinį (ENZO Gyvosios gamtos mokslai, Inc., Farmingdale, NY, JAV) pagal gamintojo instrukcijas. Trumpai tariant, KD, SC, ląstelės buvo auginamos sąlygomis arba normoxia ar hipoksija su arba be narkotikų gydymo (t NAC, aukštos gliukozės ir /ar insulino) 24 val, 48 val ir 72 val. 74-KD ir 74-PK taip pat buvo auginamos tokiomis sąlygomis, kurios iš šių normoxia arba hipoksija už 24, 48, ir 72 valandų be jokių narkotikų gydymui. Ląstelės buvo plaunama ir sustabdomas ROS aptikimo tirpalo. ROS fluorescencija buvo aptikta FACS Calibur srauto citometro (Becton-Dickinson, San Chosė, CA) ir analizuojamos Mobilusis Quest programa. Visi eksperimentai buvo pakartotas tris kartus. Vidutinė fluorescencija ROS gamybą buvo automatiškai nustatyta ir pateikta kaip GEO galvoje.

Iš viso RNR gavybos ir kiekybinė PGR

Viso RNR buvo išskirta iš ląstelių linijų, naudojant Isogen RNR išskyrimo rinkinys ( "Nippon Genų Osaka, Japonija). Vienas mikrogramų RNR buvo paversta kDNR naudojant ReverTra ACE (Toyobo) atvirkštinės transkripcijos reakcija komplektas. KDNR buvo naudojamas kaip už PGR matrica. Realaus laiko kiekybine PGR (RT-qPCR) buvo atliekami naudojant šviesos Jutiklis ciklų prietaisų sistemos (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Vokietija), naudojant šviesos Jutiklis ciklų-FastStart DNR magistras SYBR Žalioji I komplektą (Roche). Dešimt genai, kurie buvo analizuojami pagal RT-qPCR buvo taip: gliukozės transporterio 1 ( GLUT1
), aldolazės C ( ALDOC
), piruvato dehidrogenazės kinazės 1 ( PDK1
), laktatdehidrogenazės A ( LŠTA
) ir monocarboxylate transporteris 4 ( MCT4
), BCL-2 /adenovirusinė EIB 19-kDa bendrauja baltymų 3 ( BNIP3
), BINP3 kaip ( BNIP3L
), mitochondrijų mangano superoksido dismutazė ( MnSOD
), mitochondrijų proteazės , LON parsisiųsti ir citochromo oksidazės subvieneto 4-2 ( Cox4 - 2
). Pradmenys buvo sukurta pagal pateikiamų kDNR sekų (GenBank, Bethesda, MD) (1 lentelė). Po to, kai atlikti denaturavimo žingsnį ne mažesnis nei 95 ° C temperatūroje 3 min, PGR amplifikacija buvo atliktas su 50 ciklų 15 s denatūravimo 95 ° C temperatūroje, 5 S iš atkaitinimo esant 60 ° C ir 10 S iš pratęsimo 72 ° C temperatūroje. Kiekybiniai vertės buvo standartizuoti beta-aktino ( ACTB
) išraiška (1 lentelė). Visi eksperimentai buvo atliekami trimis egzemplioriais ir savarankiškai pakartoti bent tris kartus.

gliukozės įsisavinimą tyrimas

gliukozės įsisavinimas išaugintų ląstelių buvo nustatoma naudojant 2-Deoxyglucose (2DG) įsisavinimas Matavimo Kit (COSMO BIO Co Ltd, Tokijas, Japonija). Trumpai, ląstelės buvo auginamos pagal serumo-alkanas sąlyga 6 h, o po to toliau auginti 18 valandų į reguliariai terpėje papildyti su 10% FBS. Ląstelės buvo inkubuojami 24 h pagal normoxia arba hipoksija. Po to, ląstelės buvo apdorotas arba be 500 ng /ml insulino 18 min. Pagaliau, ląstelės buvo gydomi 2DG 20 min ir veikiamas į 2DG įsisavinimą matavimo pagal gamintojo instrukcijas. Visi eksperimentai buvo atliekami trimis egzemplioriais ir vidutinės vertės buvo apskaičiuotos.

Gyvūnų tyrimai

gyvūnų protokolai buvo patvirtinti institucinį gyvūnų priežiūrai ir naudojimui komitetų Saga universiteto (Protokolas 24-008-0 ) ir atitiko atvykti gaires dėl gyvūnų naudojimas moksliniuose tyrimuose. Moteris 4 savaičių senumo athymic BALB /KI JCL pelėms (Nu /Nu) buvo gauti iš Nihon CREA Co (Osaka, Japonija). Gyvūnai buvo laikomi tam tikromis-patogenais neužkrėstų sąlygomis. Joms buvo suteikta sterilų maisto ir AUTOKLAVINIO vandenį 12 h šviesos ir tamsos ciklo. Pelių buvo prisitaikyti prie aplinkos 7 dienų iki eksperimentams. KD ar SC ląstelės (3 × 10 ^{6) buvo švirkščiamas į poodį į pelių nugarą (n = 9 kiekvienam ląstelių linijos). Dešimt dienų po oda suleistas, abiejų ląstelių ksenoimplantai tapo apčiuopiamas. Devynių pelių guolis KD arba SC ksenoimplantai tada buvo suskirstyti į tris grupes gydymui, o gliukozės kiekis (8 g /kg /per dieną, Sigma), gliukozės plius insulino (GI) (1 vienetas už 3 g gliukozės /dieną, Wako) arba fosfato buferinis druskų tirpalo (PBS) kaip kontrolinio varianto. Kiekviena iš šių vaistų buvo pilvaplėvę vartojamas į tris peles (šeši navikai viso) kas 24 val nuo 1 dienos iki dienos 11. Per šį laikotarpį, augliai buvo matuojamas 2 statmenų matmenis su slankmačiu kas keturias dienas. Navikas dydis (, T
) buvo įvertintas kaip didžiausias pjovimo zonoje ir nustatomas pagal formulę: , T
= π 4 ×
× /b
, kur
yra trumpesnis ašis (mm) ir b
yra ilgesnis ašis (mm). Pelėms buvo paaukota 12 dienų po narkotikų gydymo ir augliai buvo paruošta vėliau eksperimentą.}

suskaldyti kaspazės 3 imunohistocheminis ir apoptozės vivo

vertinimas šaldytos navikai buvo integruotas su audinių Tek UŠT Junginys. Šie blokai buvo supjaustyti 4 mkm storio sekcijas. Antigeno paieška, skaidrės buvo šildomas tri-EDTA buferinio tirpalo (pH 9,0) A mikrobangų (500 vatų) 5 min. tada dalys buvo inkubuotos su anti-suskaldyti kaspazė, 3 (1: 200, Mobilusis signalines technologijos) 2 val kambario temperatūroje, ir DAKO Įsivaizduoti + sistema (Dako Cytomation, Glostrup, Danija) buvo naudojamas kaip antrinio antikūno. Signalai buvo atvaizduojami diaminobenzidinas tetrahidrochlorido (0,02%). Dėl apoptozės vertinimo, suskaldyti kaspazės 3-teigiamos ląstelės, turinčios rudos spalvos branduolių buvo skaičiuojami iš penkių laukus 400X padidinimu, o vidutinis buvo apskaičiuojamas. Imunohistocheminis išraiška suskaldyti kaspazė 3 buvo aklai peržiūrimi ir vertinami pagal patvirtintą patologas (dr AN).

Statistinė analizė

duomenys buvo analizuojami kaip ANOVA naudojant PRISM 5 programinės įrangos paketą ( GraphPad Programinė įranga, La Jolla, Kalifornija). Dėl tarp dviejų grupių palyginimui, tiriamųjų vidutinių reikšmių skirtumai buvo įvertinti Stjudento T- pervežimas bandymo ir Mann-Whitney U "
testą. Dėl palyginti tarp trijų ar daugiau grupių, Bonferroni post hoc tyrimai buvo atliekami už vieną pusę ANOVA. buvo laikoma 0,05 statistiškai reikšmingas; A p <vertės. Visi duomenys yra išreikštas priemonėmis ± SEM.

Rezultatai

HIF-1α nokdaunas sukeltas Apoptozė ląstelių mirtis pagal hipoksija į 58As9 skrandžio vėžio ląstelių

HIF-1α išraiška buvo įvertintas stabilus HIF-1α triuškinantis (KD) ląstelių ir SC (kaip kontrolinės ląstelių linija) ląstelės. Vakarų dėmė analizė parodė, kad HIF-1α išraiška buvo visiškai nugriauti ir KD ląstelių po 8 val pagal hipoksija, palyginti su SC ląstelių (pav 1A). Ląstelių mirtis norma buvo apskaičiuota, po 24 h iki 96 valandų pagal normoxia ir hipoksija. Mirtingumas buvo didesnis KD ląstelių negu SC ląstelių pagal normoxia 24 iki 96 valandų, tačiau skirtumai nebuvo statistiškai reikšmingi (pav 1B). Priešingai, ląstelių mirtis norma KD ląstelių buvo stipriai padidėjo po hipoksijos ir žymiai didesnė negu PK ląstelių po 72 ir 96 valandų (pav 1c). Western blot testo analizė parodė, kad Perskelta kaspazė 3, taip pat citozolinių citochromo c buvo padidėjusi KD ląstelių, bet ne į SC ląstelių pagal hipoksija už 8 valandų (pav 1D ir 1e). Hipoksija sukelta ląstelių mirtis taip pat buvo patvirtinta kitais HIF-1α triuškinantis skrandžio vėžio ląsteles 74-KD (S1 pav). Šie rezultatai parodė, kad hipoksija stipriai sukeltas apoptozę į HIF-1α triuškinantis ląstelių linijos KD.

prapūtimo ROS atstatomi apoptozės fenotipą pastebėtas HIF-1α triuškinantis ląstelių

ląstelėje ROS lygis buvo apskaičiuotas ir palyginti tarp KD ir AB ląsteles. ROS lygis išaugo laiko priklausomu būdu į KD ląstelių pagal hipoksija, o lygis buvo silpnai padidėjusi PK ląstelių (pav 2a). ROS lygis KD ląstelių buvo reikšmingai didesnis pagal hipoksija 24 iki 72 valandų, negu kad PK ląstelių (pav 2a). ROS lygiai taip pat buvo įvertintos per 74-SC ląstelių ir 74-KD ląstelių (S2 pav). ROS koncentracija nesiskyrė tarp 74-SC ir 74-KD ląstelių pagal normoxia (S2A pav). Tačiau pagal hipoksija, ROS koncentracija buvo gerokai didesnė 74-KD ląstelių negu 74-SC ląsteles nuo 48 iki 72 valandų (S2B pav). NAC, antioksidantas, žymiai sumažino reaktyviųjų deguonies formų lygį KD ląstelių pagal hipoksija 48 iki 72 valandų (pav 2b). Siekiant įvertinti, ar ROS gamyba skatina hipoksijos sukeltos ląstelių žūtį KD ląstelių, ląstelių mirtingumas su arba be NAC buvo įvertintas KD ląstelių pagal normoxia ir hipoksija. ŠAT gydymas neturėjo įtakos ląstelių mirtingumas KD ląstelių pagal normoxia (pav 2C). Priešingai, ŠAT gydymas žymiai sumažino ląstelių mirtį KD ląstelių pagal hipoksija 48 iki 96 valandų (pav 2D).

HIF-1α nokdaunas sumažino hipoksinio indukcijos įvairių genų, dalyvaujančių ROS gamybos kontrolės

Jei ištirti hipoksijos sukeltos ROS kaupimosi HIF-1α triuškinantis ląstelių, iRNR išraišką dešimties genų, kurie yra susiję su ROS kontrolės mechanizmo ( GLUT1
ALDOC
PDK1
LŠTA
MCT4
BNIP3
BNIP3L
LON
COX4-2 parsisiųsti ir MnSOD
) buvo analizuojami naudojant RT-qPCR. Kraujagyslių, hipoksinių indukcija genų ekspresijos buvo įvertintas lenkimo indukcijos (FI). FIS per dešimt genų buvo gerokai mažesnis KD ląstelių negu SC ląstelių (3 pav). Be to, kai tik prie hipoksinės sąlygomis, ekspresijos lygis visų dešimties genų buvo žymiai mažesnis KD ląstelių negu SC ląstelių. Šie rezultatai parodė, kad HIF-1α parbloškimo žymiai sumažino hipoksijos sukeltos ekspresiją dešimt genų. Kita vertus, pagal normoxia, kad PDK1 ir BNIP3L išraiška buvo žymiai mažesnis KD ląstelių negu SC ląsteles. Priešingai, ekspresijos lygis LON ir COX4-2 buvo žymiai didesnis KD ląstelių, palyginti su SC ląsteles.

Gliukozės ir insulino gydymo sustiprintas apoptozės ląstelių mirtis KD ląstelių pagal hipoksija

Mes šalia ištirti, ar gliukozės įsisavinimą skatinimas veikia hipoksijos sukeltos apoptozę KD ląsteles. Ląstelių gyvybingumas buvo įvertintas KD ir AB ląstelių šių būdų su kontrole (PBS), didelės gliukozės, insulino ar didelio gliukozės plius insulino (GI). Hipoksija sukelta ląstelių mirtis buvo įvertintas, FI. Ląstelių mirtis norma pagal hipoksija buvo palyginti tarp kontrolinio varianto ir kitų gydymo abiem ląstelių linijų (4 pav). PK ląsteles, buvo pastebėtas tarp bet gydymo (pav 4a) jokių reikšmingų skirtumų tarp FI ir ląstelių mirtingumas pagal hipoksija. Be KD ląsteles, FI buvo žymiai padidėjęs hipoksija visose gydymo. Visų pirma, gydymas GN davė aukščiausią FI tarp visų gydymo (pav 4b). Ląstelių mirtingumas pagal hipoksija buvo reikšmingai didesnis geografinių nuorodų gydytų ląstelių negu kontrolinių gydytų ląstelių (pav 4b). Ištirti, ar gydymas paveikė ROS gamybą, ROS lygis buvo analizuojamas KD ląsteles. Lyginant su normoxic sąlygomis ROS lygis buvo gerokai padidėjusi KD ląstelių pagal hipoksinės sąlygos (pav 4c). Pagal hipoksija, ROS lygis KD ląstelių buvo žymiai išaugo didelio gliukozės, insulino ir GN gydymo, palyginti kontroliuoti gydymą. Didžiausias ROS lygis teigiamai pastebėta virškinimo trakto gydytų KD ląstelių (pav 4c).

vertinimas gliukozės įsisavinimą po insulino gydymo

gliukozės įsisavinimas gebėjimas buvo analizuojami 2DG steigimo tyrimo , PK ir KD ląstelių pagal normoxia, The 2DG įtraukimas reikšmingai padidėti gydymo 2DG lyginant su negydytų ląsteles. 2DG įtraukimas dar labiau padidino papildomo insulino gydymo abiejų ląstelių (pav 5A). , Palyginti su normoxia, hipoksija labiau skatino 2DG įsisavinimą SC ląstelių, su arba be insulino (5B pav). Panašūs rezultatai buvo pastebėtas KD ląstelių pagal hipoksija (pav 5B). Tačiau pagal hipoksija, mažiau 2DG buvo įtraukta į KD ląstelių negu SC ląstelių, su arba be papildomo insulino preparatais (pav 5B). Siekiant įvertinti insulino priklausomas gliukozės įsisavinimą mechanizmas, membraninis išraiška GLUT1 buvo analizuojamas KD ląstelių pagal normoxia ir hipoksija. Pagal normoxia, membraninis GLUT1 išraiška buvo padidėjusi aukštos gliukozės ir /ar insulino gydymo, palyginti su, kad be gydymo (pav 5C). Palyginti su stebima normoxia pagal hipoksija, membraninis GLUT1 išraiška buvo padidėjusi visų procedūrų. Be to, išraiška buvo padidintas aukštos gliukozės ir /arba insulino gydymą, palyginti su, kad joks gydymas (pav 5C). Visų pirma, membraninis GLUT1 išraiška buvo labiausiai išaugo didelio gliukozės ir insulino (GI) gydymo į hipoksinės KD ląstelių (pav 5c). Kita vertus, kitos GLUT šeimos, GLUT3 išraiška, buvo silpnai pastebėta, kad KD ląstelių, ir ši išvada nebuvo pakeista tarp šių įvairių gydymo (duomenys neparodyta). Šiame tyrime GLUT2 ir GLUT4 nebuvo išreikšta KD ląsteles.

HIF-1α nokdaunas plius GN gydymas stipriai slopino navikų audiniuose augimą nuogas pelių

Galiausiai, mes nustatomas vivo
poveikis GN gydymą KD ir AB navikų audiniuose. Pav 6A rodo eksperimentinį dizainą ksenografiniuose pelių modelį. Dešimt dienų po oda suleistas AB ar KD ląsteles, ksenoimplantai buvo auginami ant nuogas pelių nugarą. Šiuo metu A Vakarų dėmė analizė patvirtino HIF-1α išraiška SC navikų, bet ne KD navikų (pav 6b). Vėliau trys vaistai, sudaryti iš PBS, gliukozės ar GN, buvo pilvaplėvės ertmę suleista į nuogas pelių žinutę SC arba KD naviką (kasdien nuo 1 dienos iki 11 dienos). Tipinės vaizdų naviko guolis pelių, kurios buvo gydomi PBS (SC-PBS ir KD-PBS), gliukozės (SC-gliukozės ir KD-gliukoze) arba GN (SC-GN ir KD-GI) yra parodyta pav 6C , KD-Gliukozė ir KD-Gi navikai pasirodė mažesnis, nei kitų navikų. Pav 6D parodė, kad augimo kreivė 6 navikų. Šio KD-gliukozės ir KD-Gi navikų dydžiai buvo gerokai mažesnis nei KD-PBS naviko Dieną 12. KD-Gi naviko buvo mažiausias. Kita vertus, SC pelėmis, nebuvo reikšmingo skirtumo dydžio SC-PBS, SC-gliukozės ir SC-GN navikų (pav 6d). Atlikta imunohistocheminis analizė suskaldoma kaspazė, 3, siekiant įvertinti apoptozę, kurį sukelia gliukozės arba GI gydymui. Teigiamas išraiška suskaldyti caspase3 buvo dažnai pastebima KD-gliukozės ir KD-Gi navikų (pav 6e). Tačiau visi KD navikų eksponuojami šiek tiek prilipdavo kaspazė 3 (pav 6F) laipsnį. Priešingai, nebuvo reikšmingo skirtumo išraiška suskaldyti kaspazė 3 tarp SC-PBS, SC-gliukozės ir SC-GN navikų. Be KD navikų, teigiama išraiška suskaldyti caspase3 buvo reikšmingai didesnis KD-PBS naviko nei SC-PBS naviko. Be to, suskaldyti caspase3 išraiška buvo reikšmingai didesnis KD-gliukozės arba KD-Gi navikų negu KD-PBS naviko. Didžiausias išraiška buvo pastebėtas KD-Gi naviko.

Diskusijos

Šiame tyrime HIF-1α Klojinius išardomi ląstelės buvo panaudotos ištirti, ar mirtina ROS gamyba gali būti sukeltas pagal hipoksija. Rezultatai parodė, kad apoptozės ląstelių mirtis buvo sukeltas KD ląsteles, bet ne į kontrolės SC ląstelių pagal hipoksija. Tuo pačiu metu, ROS sukaupta triuškinantis ląstelių linijos pagal hipoksijos trukmę. Hypoxia- sukelta ląstelių mirtis ir ROS kaupimas taip pat buvo pastebėta, kad skirtingų HIF-1α triuškinantis 74-KD ląsteles, bet ne kontrolės 74-SC ląsteles. Be to, NAC gydymas sumažino hipoksija sukelta ląstelių mirtingumas KD ląsteles. Šie rezultatai rodo, kad hipoksija sukeltos apoptozės atsiradimo dėl pernelyg didelio ROS kaupimosi KD ląsteles ir palaiko ankstesnį tyrimą, HIF-1α nokautas MEF mirė dėl per didelio ROS gamybą [33].

ROS daugiausia yra gaunamos iš ETC mitochondrijas [17, 19]. Buvo pranešta, kad mitochondrijų ROS padidėjo pagal hipoksinės sąlygomis [17, 19]. Jei hipoksija išlieka, iš HIF-1α indukcija veda į prisitaikanti mechanizmų sumažinti ROS ir atkurti redokso homeostazę per atitinkamų genų [19] ląstelę. Taigi mes ištirti, ar HIF-1α nokdaunas paveikė iRNR išraišką dešimties genų, dalyvaujančių ROS gamybos kontrolės pagal hipoksija ( GLUT1
ALDOC
PDK1
LŠTA parsisiųsti ir MCT4
susijusios su Warburg poveikio; BNIP3 parsisiųsti ir BNIP3L
susijusios su mitophagy LON parsisiųsti ir COX4-2
susijusios su ETC ir MnSOD
A ROS maitėda). Integruotos analizė AT-qPCR serijos parodė, kad hipoksija sukeltos išraiška visus dešimt genų buvo reikšmingai slopino per KD ląsteles, kadangi pagal normoxia, mRNR išraiška LON ir COX4-2 buvo reikšmingai didesnis KD ląstelių nei PK ląsteles. Šie rezultatai parodė, kad mirtina kaupimas ROS pagal hipoksija į HIF-1α triuškinantis ląstelių gali būti dėl kelių sutrikimų ROS kontrolės mechanizmo. Todėl vėžio terapija orientacija HIF-1α gali būti veiksmingas hipoksinio regione per skrandžio vėžio audinyje. Mechanizmas grindžiama aktyvinama iRNR išraišką LON ir COX4-2 į KD ląstelių pagal normoxia negalėjo būti patikslinta.

Pasak minėtų išvadų, mes iškėlė hipotezę, kad gliukozės įsisavinimą skatinimas gali paspartinti hipoksija sukeltas apoptozė per tolesnio ROS gamybos HIF-1α triuškinantis KD ląsteles. Kaip ir tikėtasi, GN gydymas sustiprintas ląstelių mirtį hipoksinės KD ląstelių, kurios lydėjo padidėjo ROS gamybą. Į gliukozės įsisavinimą tyrimo, insulino padidino 2DG įsisavinimą tiek PK ir KD ląsteles. Lyginant su, kad stebima normoxia, hipoksija padidino 2DG įsisavinimui PK ir KD ląstelių gydomi arba be insulino. Sugerties buvo padidintas labiau į SC nei KD ląstelių, o tai rodo skirtumą dėl susilpninto GLUT1 indukcijos į kraujagyslių, hipoksinių KD ląsteles. Kita vertus, Western blot analizė parodė, kad membraninis GLUT1 išraiška buvo padidintas su aukštos gliukozės ir /arba insulino gydymo, lyginant su kontroliniu variantu į normoxic ir hipoksinių KD ląstelių. Visų pirma, gydymas GN labiausiai padidino membraninis GLUT1 išraišką hipoksinės KD ląsteles. Ankstesnis tyrimas pranešė, kad insulinas skatina gliukozės transportą stimuliuoja GLUT4 perkėlimas iš ląstelėje saugojimo pūslelių į plazminės membranos skeleto raumenų ląstelių arba adipocitų [36, 37].

• PLoS ONE: Kopijuoti skaičius Pelnas at 8q24 ir 20q11-Q13 skrandžio vėžiu dažniau žarnyne-Type nei Difuzinė-Type
• PLoS ONE: Serumas HER2 yra potencialus pakaitalas audinių HER2 būklės skrandžio vėžiu: sisteminė apžvalga ir meta-Analysis