PLoS ONE: apoptoze Učinak HIF-1 a inhibicija u kombinaciji sa glukoze plus Liječenje inzulinom na rak želuca pod uvjetima hipoksije

Sažetak pregled

karcinoma želuca raste pod nedostatka kisika u okolini. HIF-1α je poznato da ima važnu ulogu u kontroli proizvodnju reaktivnih vrsta kisika (ROS) u mitohondrijima pod uvjetima hipoksije. Mi smo ranije osnovana obaranje stanice HIF-1 a (KD) i kontrola (SC) stanica u 58As9 želučanog raka stanične linije. U ovom istraživanju, otkrili smo da KD stanice, ali ne i SC stanica, inducirana apoptoza u uvjetima hipoksije (1% O _{2) zbog prekomjerne proizvodnje ROS. Kvantitativni RT-PCR analiza pokazala je da su izrazi deset gena koji su uključeni u kontrolnim mehanizmima ROS (uključujući Warburg učinka, mitophagy, lanac prijenosa elektrona [ETC] modifikacije i ROS vezivanje), regulirani su po HIF-1 a. Štoviše, promocija ulazak glukoze u glukoza plus inzulin (GI) tretman pojačan apoptotičnog učinak, koji je u pratnji daljnju proizvodnju ROS u hipoksije KD stanicama. Western blot analiza je pokazala da je membranski ekspresija GLUT1 u KD stanicama povišena glukoza i /ili inzulina tretmana, što ukazuje da je GI-induced ulazak glukoze posreduje povećanim premještanje GLUT1 na staničnoj membrani. Konačno, antitumorski učinak HIF-1 a obaranje (KD) plus GI procijenjena pomoću modela tumora ksenografta, gdje nedostatka kisika u okolini, naravno postoji. Kao rezultat toga, liječenje GI snažno inhibira rast tumora KD čime apoptoze stanica je vrlo induciranog u usporedbi sa kontrolnom obradom. Nasuprot tome, rast SC tumora koji HIF-1 a nije bio pod utjecajem tretmana GI. Uzeti zajedno, rezultati ukazuju na to da HIF-1α inhibicija plus GI može biti idealna terapija, jer je apoptoza zbog uništenja ROS homeostaze posebno inducira rakom želuca koja raste pod nedostatka kisika u okolini, ali ne u normalnom tkiva pod aerobni uvjeti pregled}

Izvor:. Tanaka T, Kitajima Y, Miyake S, Yanagihara K, Hara H. Nishijima-Matsunobu A, et al. (2015) apoptoze Utjecaj HIF-1α Inhibicija kombinaciji s glukozom plus Liječenje inzulinom na rak želuca pod uvjetima hipoksije. PLoS ONE 10 (9): e0137257. doi: 10,1371 /journal.pone.0137257 pregled

Urednik: Ester Hammond, Sveučilište u Oxfordu, Velika Britanija pregled

Primljeno: 30. travnja 2015. godine; Prihvaćeno: 13. kolovoz 2015; Objavljeno: 4. rujna 2015 pregled

Copyright: © 2015 Tanaka et al. Ovo je otvoreno pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan pregled

Podaci Dostupnost: sve relevantne podatke su u radu i njegovim popratne podatke datoteka pregled

financiranje:.. autori nemaju podršku ili sredstva za prijaviti pregled

suprotstavljenih interesa. autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi pregled

Uvod pregled

hipoksiji okoliš je značajan kod solidnih tumora gdje se ubrzava njihove maligne ponašanja [1-4]. Kao i drugih čvrstih tumora, karcinom želuca je poznato da uključuju opsežne područja hipoksije unutar tumora [5-7]. Uvjetima hipoksije induciranje nekoliko bioloških događaje kao što su angiogeneze, lokalne invazije, metastatskog širenja, radio ili kemijska otpornost i promijenjenog metabolizma energije u mnogim karcinomima, što dovodi do lošom prognozom u bolesnika [2-4]. Pregled

transkripcijski faktor faktor hipoksije inducibilni 1 (HIF-1) je glavni posrednik stanične prilagodbe hipoksije [8-10]. HIF-1 je heterodimerni protein koji se sastoji od tvorbene izražava β-podjedinica (HIF-1B) i hipoksije inducibilni α (HIF-1α) podjedinica [8-10]. HIF-1α podjedinica je degradirana kroz ubikvitina-proteasomalni put pod normoxia. Nasuprot tome, u hipoksije, HIF-1α stabiliziran i dimerizira s HIF-1β u interakciji s CBP /P300, koji zatim veže na elementu hipoksija odgovora (HRE) na promotorsku regiju stotina ciljnih gena [11-16]. Ta prethodna izvješća su doveli do priznavanja HIF-1 a kao središnjeg regulatora u patogenezi čvrstog raka pregled

Reaktivni kisikovi spojevi (ROS), kao što je superoksid anion (O _{2 ^{. - ), vodikov peroksid (H 2O 2) i hidroksil radikal (HO •), sastoje se od radikala i ne-radikalnim vrsta kisika nastaju djelomičnom redukcijom kisika. Intracelularni ROS uglavnom nastaje u mitohondrijima pomoću oksidativne fosforilacije (OXPHOS), postupak u izvedbi elektron transportnom lancu (ETC) [17]. Kad ROS preplaviti mobilne antioksidacijski obrambeni sustav, javlja oksidativni stres. Pretjerano oksidativni stres uzrokuje ROS-posredovanu oštećenje nukleinskih kiselina, proteina i lipida i dovodi do stanične smrti [17, 18]. Pregled}}

HIF-1α je prijavljen za kontrolu ROS proizvodnju pod uvjetima hipoksije višestrukim mehanizmom uključujući konverziju energetskog metabolizma od OXPHOS do glikolize, koja se naziva Warburg efekt [19-23], induciranje mitohondrijskog selektivnog autophagy (označeni kao mitophagy) [24, 25], ETC modifikacije prekidačem podjedinica u citokroma c oksidaze (COX) [26] i ROS čistači [27]. U metaboličkom putu Warburg učinka, HIF-1α najprije aktivira transkripciju GLUT1
povećanja uptake glukoze u stanicama. Glukoza se zatim metabolizira u piruvata putem djelovanja glikolitičkih enzima članova, koji su poznati ciljeve HIF-1 a [28, 29]. Pod aerobnim uvjetima, piruvat se prevede u acetil-CoA (AcCoA) pomoću piruvat dehidrogenaze (PDH) za ulaz u trikarboksilne kiseline (TCA) ciklusa. S druge strane, u stanicama raka izložene hipoksiju, piruvata je preusmjerena daleko od mitohondrijima, čime HIF-1α regulira povišenje ekspresije PDK1 da inhibiraju PDH aktivnosti. Nakon toga, LDHA alternativno pretvara piruvata u laktat i MCT4 transportira laktat iz ćelije. Ovi geni su regulirani HIF-1 a [16, 30, 31]. Hipoksija izaziva mitophagy bi se spriječilo prekomjerno stvaranje ROS kojim su oštećeni mitohondriji eliminira putem lizosomskog probavu [24, 25]. Nedavne studije su pokazale da HIF-1α aktivira transkripcije gena koji kodiraju BNIP3 i BNIP3L, bitne čimbenike u procesu mitophagy [32]. Druga studija je izvijestio da HIF-1α regulira COX4 prebacivanje podjedinice aktiviranjem transkripciju gena ETC vezane COX4-2 i LON, A mitohondrijski proteaze koji je potreban za COX4-1 degradacije pod hipoksije [26]. Podjedinica prekidač COX4 bio prijavljen kao važan korak u ROS homeostaze, zbog svoje uloge u optimizaciji učinkovitosti disanja pod hipoksije [26]. ROS-sakupljač MnSOD je poznato da se pretvoriti superoksid radikala hidrogen peroksid. Prethodno istraživanje je izvijestio da MnSOD doreguliran u hipoksijom, iako je li to regulaciju je posredovano HIF-1 a još nije prikazano [27]. Nedavno je još jedan izvještaj pokazao zanimljiv nalaz da su embrionalni fibroblasti (MEFs) od uslijed nedostatka kisika HIF-1α-null miševa umro zbog viška ROS proizvodnje, dok su MEFs spašeno obradom s antioksidansom N acetil-L-cistein (NAC) [ ,,,0],33]. Uzeti zajedno, ovi izvještaji ukazuju na to da HIF-1α igra središnju ulogu u organiziranju mitohondrijsku proizvodnju ROS u živim stanicama pod hipoksije. Pregled

U ovoj studiji željeli smo ustanoviti terapijski modela i demonstriraju hipoksiju inducirana apoptoza putem prekomjerna ROS može se uvesti stanica deficijentnih HIF-1α želučanog karcinoma. U početku smo utvrditi da li hipoksija izaziva staničnu smrt prekomjerne proizvodnje ROS u HIF-1 a obaranje (KD) stanica. Nakon toga, obratio mi hipotezu da je uvođenje visoke razine glukoze obradom KD stanica s inzulinom može poboljšati apoptotičnog učinak. Konačno, koristeći tumor modelu ksenografta, predložili smo da HIF-1α inhibicija kombinaciji s glukoze plus inzulina (GI) liječenje može biti potencijalno liječenje za rak želuca. Pregled

materijali i postupci

Kultura stanica uvjeti i reagensi pregled

izvorno osnovan je rak želuca stanična linija 58As9 je ljubazno od Dr. K. Yanagihara (National Cancer Center Hospital Istok, Chiba, Japan) prosinca 2009. godine 58As9 stanične linije od scirrhous karcinom želuca-izvedena stanična linija HSC-58 [34]. Ova stanična linija se zatim dalje ovjerena 24. veljače ^{th, 2015 od JCRB Cell banke (Osaka, Japan). Druga rak želuca stanične linije, MKN74 je kupljen od Cell Bank, Riken Bio Resource Center (Tsukuba, Japan). U ovom istraživanju koristili smo stabilne HIF-1α obaranje stanice KD i 74-KD, koja su osnovana od strane transfekcijom siRNA plazmid RNAi sekvenci u 58As9 i MKN74 stanica kao što je ranije [7, 35] opisano. Sekvence siRNA ciljanja HIF-1 a i kontrolu kodirani siRNA dizajnirani su kako slijedi: HIF-1α siRNA za KD ili 74-KD (5'-CCA MAČKA TCA CGT ATA TGA T-3 ') i otimati siRNA za SC ili 74- SC (5'-TCT TAA TCG CGT ATA AGG C-3 '). Stanice su kultivirane u RPMI-1640 mediju (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO, USA), uz dodatak 10% fetalnog goveđeg seruma inaktiviranog toplinom (FBS) i 100 ug /ml kanamicina (Meiji, Tokyo, Japan ), te inkubira na 37 ° C u vlažnoj atmosferi. Stanice su kultivirane u bilo normoksičnim uvjetima (20% O _{2 i 5% CO 2 u zraku) ili hipoksična stanja (1% O 2, 5% CO 2 i 94% N 2) u hipoksičnom komoru (Astec, Fukuoka, Japan) i tada se tretira sa NAC (Sigma-Aldrich) i inzulin (Wako, Osaka, Japan) u konačnoj koncentraciji od 5 mM i 500 ng /ml, respektivno. Koncentracija medij s velikim sadržajem glukoze je dobiven dodatkom 45% D - (+) - otopinu glukoze (Sigma-Aldrich), a konačna koncentracija određena je da bude od 10 g /L, što je 5 puta veći od onoga u normalnim RPMI-1640 medij. pregled}}

stanična održivost test pregled

vijabilnost stanica u normoxia ili hipoksije je određena s tripan testovima modrilom. Za procjenu učinaka liječenja lijekovima, uključujući i NKP, visokom razinom glukoze i /ili inzulina na stanične održivosti, 1 × 10 ^{5 stanice su posađene na uzgojne posude 6 cm. Stanice su tretirane s različitim lijekovima u naznačenim koncentracijama i uzgojene u normoxia ili hipoksije 24 h do 96 h. Na kraju inkubacije, plutajuće i vezane stanice su prikupljene i peletirane centrifugiranjem (3000 rpm, 5 min). Stanice su ponovno suspendirane u 90 uL kompletnog medija, pomiješana s 10 ul otopine 0,4% tripanskim modrilom, a broje korištenjem hemocitometra pod mikroskopom. Stopa stanične smrti je određena kao omjer broja mrtvih stanica /ukupnog broja stanica. Svi pokusi su izvedeni u tri primjerka neovisno ponovi najmanje tri puta. Pregled}

Western blot analiza pregled

cijelih stanica lizat iz stanica u kulturi i ksenografta tumora kod miševa su pripravljeni korištenjem pufera za lizu koji se sastoji od 150 mmol /L NaCl, 50 mmol /L Tris-HCl (pH 7,6), 0,5% Triton X-100, te koktel proteaznog inhibitora mix (Roche, Mannheim, Njemačka). Stanični lizati iz citosolne frakcije i stanične membrane frakcije su pripravljeni upotrebom citokroma c koji oslobađa Assay Kit i apoptoze plazmatske membrane protein Extraction Kit (BioVision Inc. Milpitas, CA, USA) prema uputama proizvođača. Western blot analiza je provedena kao što je prethodno [7] opisano. Alikvoti sadržaja 30 ug proteina elektroforezom odvojena u 4-12% Bis-Tris gel (Invitrogen) i prenosi na Amersham Hybond-ECL membrane (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) u puferu za prijenos. Nakon blokiranja sa 5% mlijeka kože 30 minuta, membrana se inkubira s primarnim antitijelima preko noći pri 4 ° C. Korišteni su sljedeći Primarna antitijela: anti-HIF-1 a (razrjeđenje 1: 1000, Abcam, Cambridge, UK), anti-cijepana kaspaza 3 (1: 1000, stanično signaliziranje Technology, Danvers, MA), anti-citokrom c (1 : 500 razrjeđenje, BioVision), anti-GLUT1 (1: 100.000 razrjeđenja Abcam) i anti-β-aktin (1: 10000 razrjeđenje, Sigma-Aldrich, Inc.). Nakon inkubacije s odgovarajućim sekundarnim protutijelima, signali su razvijeni koristeći Plus Western detekciju Amersham ECL blot-(GE Healthcare). Pregled

Detekcija intracelularne ROS protočnom citometrijom

unutarstanični ROS vrijednosti procijenjene su koristeći ukupno Detection Kit ROS (Enzo Life Sciences, Inc., Farmingdale, NY, USA) u skladu s uputama proizvođača. Ukratko, KD, SC, stanice su uzgojene u uvjetima ili normoxia ili hipoksije, sa ili bez tretmana lijekova (tj NAC, s visokim sadržajem glukoze i /ili inzulina) tijekom 24 h, 48 h i 72 h. 74-KD i 74-SC također su uzgojene u uvjetima ili normoxia ili hipoksije 24, 48, i 72 sata bez tretmana. Stanice su isprane i ponovno suspendirane u otopini ROS detekcije. ROS fluorescencija detektirana od FACS Calibur protočnom citometru (Becton-Dickinson, San Jose, CA) i analizirani pomoću Cell Quest programu. Svi pokusi su provedeni u triplikatu. Srednja fluorescencija ROS proizvodnje određen je automatski i predstavio se kao GEO znače. Pregled

Ukupno ekstrakcija RNA i kvantitativni RT-PCR

Ukupna RNA je ekstrahirana iz stanične linije korištenjem kompleta ISOGEN ekstrakcije RNA ( Nippon Gene, Osaka, Japan). Jedan J..lg RNA je pretvoren u cDNA pomoću ReverTra Ace (Tovobo) reakcija reverzne transkripcije kit. CDNA je korišten je kao kalup za PCR. U stvarnom vremenu kvantitativni RT-PCR (RT-qPCR) se vrši pomoću sustava instrumenta Light brojača (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Njemačka) upotrebom Light-Cycler-FastStart DNA Master SYBR Green I kita (Roche). Deset gena koji su analizirani pomoću RT-qPCR su kako slijedi: transporter glukoze 1 ( GLUT1 pregled), aldolaza C ( ALDOC pregled), piruvat dehidrogenaze kinaze 1 ( PDK1
), laktat dehidrogenaze a ( LDHA pregled) i monokarboksilatna transporter 4 ( MCT4 pregled), Bcl-2 /adenovirus EIB 19-kDa interakcije protein 3 ( BNIP3 pregled ), BINP3 slično ( BNIP3L pregled), mitohondrijska mangan superoksid dismutaza ( MnSOD pregled), a mitohondrijski proteaze LON pregled i citokrom oksidaza podjedinica 4-2 ( Cox4 - 2 pregled). Primeri su dizajnirani prema prijavljenih cDNA sekvencije (GenBank, Bethesda, MD) (Tablica 1). Nakon provođenja koraka denaturacije na 95 ° C tijekom 3 minute, PCR amplifikacija je provedena u 50 ciklusa od po 15 sekundi denaturacije na 95 ° C, 5 s žarenja na 60 ° C i 10 s u produžetku na 72 ° C. Kvantitativni se normalizira na P-aktin ( ACTB pregled) ekspresiju (Tablica 1). Svi pokusi su izvedeni u tri primjerka neovisno ponovi najmanje tri puta. Pregled

glukoza Test unosa pregled

ulazak glukoze u kulturi stanica određena je upotrebom 2-deoksiglukozom (2DG) Uzimanje Mjerenje Kit (Cosmo BIO Co Ltd, Tokyo, Japan). Ukratko, stanice su uzgojene pod uvjetima izgladnjivanja bez seruma tijekom 6 sati, nakon čega slijedi daljnji uzgoj 18 h u regularnom mediju obogaćenom sa 10% FBS. Stanice su inkubirane tijekom 24 sati pod normoxia ili hipoksije. Nakon toga, stanice su tretirane sa ili bez 500 ng /ml inzulina tijekom 18 min. Konačno, stanice su tretirane s 2DG kroz 20 minuta, te podvrgnute mjerenju uzimanja 2DG prema uputama proizvođača. Svi pokusi su provedeni u tri primjerka, a srednje vrijednosti izračunate su. Pregled

Studije na životinjama pregled

životinjske protokoli su odobreni od strane njega i uporaba odbora institucionalna životinja Sveučilišta Saga (protokola 24-008-0 ) i u skladu s dolazimo smjernicama za uporabu životinja u istraživanjima. Ženski 4 tjedna stare atimične BALB /Ca JCL miševi (nu /nu) dobiveni su od Nihon Crea Co. (Osaka, Japan). Životinje su držane pod specifičnim-nepatogenim uvjetima. Su dobili sterilnu hranu i vodu u autoklavu 12 h svjetlo-tama ciklus. Miševi se aklimatiziraju na okoliš za 7 dana prije pokusa. KD ili SC stanice (3 x 10 ^{6) su injicirani potkožno u leđa miševa (n = 9 za svaku staničnu liniju). Deset dana nakon supkutane inokulacije, ksenografta obiju stanica postaje jasan. Devet miševe KD ili SC ksenografta su zatim podijeljene u tri grupe za liječenje glukozom (8 g /kg /dan, Sigma), glukoze plus inzulin (GI) (1 jedinica po 3 g glukoze /dan, Wako) ili fosfatno puferiranom fiziološka otopina (PBS) kao kontrolni tretman. Svaki od ovih lijekova je intraperitonealno u tri miševa (šest tumori ukupnih) svaka 24 sata od 1. dana do dana 11. Tijekom ovog perioda, tumori su mjereni u 2 okomito dimenzije šestarom svaka četiri dana. Veličina tumora ( T pregled) ocijenjena je kao maksimalni rez područja i određuje prema sljedećoj formuli: T pregled = π /4 × A pregled × b pregled, gdje je a pregled je kraća os (mm) i b pregled je duža os (mm). Miševi su žrtvovani 12 dana nakon tretmana lijekovima i tumori su sakupljene za sljedeću eksperimenta. Pregled}

cijepana kaspaza 3 imunohistokemijski i procjena apoptoze In vivo

smrznuta tumori bili uklopljeni Tissue-Tek OCT Spoj. Ovi blokovi su rezani u 4-um-debljim dijelovima. Za dohvat antigen, stakalca su grije u Tris-EDTA puferu (pH 9,0) u mikrovalnoj (500 W) tijekom 5 min. Sekcije su zatim inkubirane s anti-cijepa kaspaze 3 (1: 200, Cell Signaling Technology) tijekom 2 sata na sobnoj temperaturi, a DAKO EnVision + System (Dako Cytomation, Glostrup, Denmark) korišten je kao sekundarno antitijelo. Signali su vizualizirani s diaminobenzidin tetrahidrokloridom (0,02%). Za procjenu apoptoze, cijepana kaspaza 3 pozitivne stanice s smeđe boje jezgara broje u pet područja na 400X uvećanja i izračunata je srednja vrijednost. Imunohistokemijske izraz cijepa kaspaze 3 slijepo je pregledan i ocijenjen od strane ovlaštenog patologa (Dr. AN). Pregled

Statistička analiza pregled

Podaci su analizirani pomoću ANOVA korištenjem Prism 5 programski paket ( GraphPad Software, La Jolla, CA). Za usporedbu između dvije skupine, razlike u srednjim vrijednostima su ocijenjeni od strane Studentskog t
testa i Mann-Whitney ü pregled, test. Za usporedbu između tri ili više skupina, Bonferronijev Post hoc testovi izvedeni su za jednosmjernim ANOVA. Vrijednost od p < 0.05 je smatra se statistički značajnom. Svi podaci su izraženi kao sredstvo ± SEM. Pregled

Rezultati

HIF-1α obaranje umiranju stanica procesom apoptoze pod hipoksije u 58As9 stanicama raka želuca pregled

HIF-1α izraz bio ocijeniti u stabilnom HIF-1α obaranje (KD) stanicama i SC (kao kontrola stanične linije) stanica. Western blot analiza je pokazala da je HIF-1α izraz potpuno je srušen u KD stanica nakon 8 sati u hipoksije u usporedbi sa SC stanica (Slika 1A). Stopa stanične smrti je procijenjena nakon 24 sata do 96 sati pod normoxia i hipoksije. Stopa smrtnosti bila je veća u KD stanicama nego u stanicama SC pod normoxia od 24 do 96 sati, međutim razlike nisu bile statistički značajne (Slika 1B). Nasuprot tome, stopa staničnog odumiranja u KD stanice je jako pojačana u hipoksijom i znatno veća od one opažene kod SC stanicama nakon 72 i 96 sata (Slika 1C). Western blot analiza je pokazala da se odcijepi kapaze 3 i citosolne citokroma c su povišene u stanicama KD, ali ne i u stanicama SC pod hipoksije 8 sati (Slika 1D i 1e). Hipoksija je smrt izazvana stanična potvrđen je iu drugim HIF-1α obaranje želučanih stanica raka 74-KD (S1 sl). Ovi rezultati pokazuju da hipoksija jako inducirana apoptoza u HIF-1α obaranje stanične linije KD. Pregled

Ispiranje ROS obrnuto apoptotičnog fenotip uočili u obaranje stanice HIF-1α pregled

intracelularni razina ROS je procijenjen i odnosu među KD i SC stanica. Razina ROS povećana na vremenski ovisan način u KD stanicama pod hipoksije, a razina blijedo je uzdignut u SC stanicama (Slika 2A). Razina ROS u KD stanicama bila je znatno viša u hipoksije za 24 do 72 sata, nego što se u SC stanicama (Slika 2A). Razine ROS su također procjenjuje na 74-SC stanice i 74-KD stanica (S2 sl). Razine ROS nisu se razlikovale između 74-SC i 74-KD stanica pod normoxia (S2A sl). Međutim, pod hipoksije, razina ROS su značajno više u 74-KD stanicama koje u odnosu na 74-SC stanica AT 48 do 72 sati (S2B sl). NAC, antioksidans, značajno je smanjio razine ROS u KD stanicama pod hipoksije za 48 do 72 sata (Slika 2B). Da bi se ocijenilo da li ROS proizvodnja potiče hipoksiju izazvanu smrt stanica u KD stanica, stopa stanične smrti, sa ili bez NAC je procijenjena u KD stanicama pod normoxia i hipoksije. NAC tretman nije utjecao na stopu stanične smrti u KD stanica pod normoxia (Slika 2C). Nasuprot tome, NAC tretman značajno smanjuje staničnu smrt u KD stanicama pod hipoksije 48 do 96 sati (Slika 2D). Pregled

HIF-1α obaranje smanjen hipoksično indukciju različitih gena koji su uključeni u kontrolu proizvodnje ROS pregled

Kako bi istražili hipoksiju izazvanu ROS nakupljanje u obaranje stanice HIF-1α, mRNA ekspresiju od deset gena koji su uključeni u ROS kontrolni mehanizam ( GLUT1 pregled, ALDOC pregled, PDK1 pregled, LDHA pregled, MCT4 pregled, BNIP3 pregled, BNIP3L pregled, LON
COX4-2 pregled i MnSOD pregled) analizirane su pomoću RT-qPCR. Hipoksičkog indukcija ekspresije gena procjenjuje se struko induciranje (FI). FIS u deset gena bila je značajno niža u KD stanicama nego u SC stanicama (Slika 3). Nadalje, kada je ograničena uvjetima hipoksije, razina ekspresije svih gena deset bile su značajno niže u KD stanica u odnosu na SC stanica. Ovi rezultati su pokazali da HIF-1α obaranje značajno smanjio hipoksiju inducirana ekspresija deset gena. S druge strane, u normoxia, ekspresija PDK1 i BNIP3L bila značajno niža u KD stanicama nego u SC stanicama. S druge strane, razina ekspresije LON i COX4-2 su značajno više u KD stanica u odnosu na SC stanica. Pregled

glukoze i inzulina tretmani poboljšane apoptoze smrt stanica u KD stanica pod hipoksija Netlogu

Dalje smo istraživali da li je promocija unosa glukoze utječe na apoptozu hipoksiju induciran KD stanica. Stanična vijabilnost je procijenjena na KD i SC stanica nakon tretmana s kontrolom (PBS), s visokim sadržajem glukoze, inzulina i visokim sadržajem glukoze plus inzulina (GI). Hipoksije induciranu smrt stanice procijenjena FI. Stopa stanične smrti u hipoksije uspoređivani liječenje kontrola i drugih tretmana u obje stanične linije (Slika 4). U SC stanica, uočene su značajne razlike u stopi smrtnosti FI i stanica pod hipoksije među bilo koji od tretmana (Slika 4a). U KD stanica, FI je bila značajno povećana kod hipoksije sve tretmane. Konkretno, GI tretman dala najvišu FI među svim tretmanima (Slika 4b). Stopa stanična smrt pod hipoksije bila je značajno viša u stanicama GI-tretirane nego u kontrolnim stanicama tretiranim (Slika 4b). Da bi istražili da li su postupci utjecali na ROS proizvodnje, razina ROS je analiziran u KD stanica. U odnosu na normoksičnim uvjetima, razina ROS značajno je povišena u KD stanica u uvjetima hipoksije (Slika 4c). Pod hipoksije, razina ROS u KD stanica je bila značajno povećana s visokim sadržajem glukoze, inzulina i GI tretmana u odnosu na kontrolu liječenja. Najviša razina ROS pozitivno zabilježeno je u GI-tretirana KD stanica (Slika 4c). Pregled

Procjena unosa glukoze nakon liječenja inzulinom pregled

ulazak glukoze sposobnost je analiziran u 2DG osnivanje studija , U stanicama SC i KD pod normoxia je 2DG inkorporacija značajno povišena u liječenju 2DG u odnosu na netretirane stanice. 2DG Inkorporacija dalje povećava dodatnom liječenja inzulinom u obje stanice (Slika 5A). U odnosu na normoxia, hipoksije snažnije stimulira apsorbiranje 2DG u SC stanicama, sa ili bez inzulina (slika 5B). Slični rezultati su promatrani u KD stanica uz hipoksije (Slika 5b). Međutim, u hipoksijom manje 2DG bio je uključen u KD stanicama nego u SC stanicama, sa ili bez dodatnog liječenja inzulinom (slika 5B). Procijeniti mehanizam inzulin-ovisnog vezanja glukoze je membranski izraz GLUT1 analiziran u KD stanicama pod normoxia i hipoksije. Pod normoxia je membranski GLUT1 ekspresija je povišena s visokim sadržajem glukoze i /ili liječenja inzulinom u usporedbi s onim bez liječenja (Slika 5C). U usporedbi sa opažanjem u normoxia pod hipoksije je membranski GLUT1 ekspresija povišena u svim tretmanima. Nadalje, ekspresija je povećan s visokim sadržajem glukoze i /ili liječenja inzulinom, u usporedbi s onim prema bez liječenja (Slika 5C). Posebno, membranski GLUT1 ekspresija je najjače porasli visokim glukoze i inzulina (GI) tretman u hipoksičnim KD stanica (Slika 5C). S druge strane, ekspresija drugog zasićenost obitelji GLUT3, blijedo je uočeno u KD stanicama, a to otkriće nije promijenila kod tih različitih tretmana (podaci nisu prikazani). U ovom istraživanju, GLUT2 i GLUT4 nisu bili izraženi u KD stanicama. Pregled

HIF-1α obaranje plus GI tretman snažno potisnuti rast tumorskih ksenografta na miševe pregled

Na kraju smo utvrdili in vivo pregled učinak obrade GI na KD i SC tumorskih ksenograftova. Slika 6A prikazuje eksperimentalni model u ksenograft miševa. Deset dana nakon potkožnog inokulacije SC ili KD stanica, stranih tijela su rasle na leđima golim miševima. U ovom trenutku, Western blot analiza potvrdila HIF-1α izraz u tumorima SC, ali ne u KD tumora (Slika 6b). Nakon toga, tri lijeka, koji se sastoji od PBS-a, glukoza ili GI, intraperitonealno ubrizgano je u gole miševe koji nose SC ili KD tumora (dnevno od dana 1 do dana 11). Reprezentativni slike miševa koji nose tumor koji su tretirani s PBS (SC-PBS i KD-PBS), glukoza (SC-glukoze i KD-glukoze) ili GI (SC-GI i KD-GI) su prikazani na slici 6C , KD-glukoza i KD-GI tumora čini se da je manji od ostalih tumora. Slika 6D je pokazao krivulju rasta od 6 tumora. Veličine KD-glukoze i KD-GI tumora bili su znatno manji od KD-JS tumora na dan 12. KD-GI tumora je bila najmanja. S druge strane, u SC miševa, nije bilo značajne razlike u veličini SC-PBS, SC-glukoze i SC-GI tumora (Slika 6D). Imunohistokemijskom analizom cijepati kaspaze 3 izvedena je procijeniti apoptozu izazvanu glukozu ili GI liječenja. Pozitivan izraz cijepa caspase3 često se promatra u KD-glukoze i KD-GI tumora (Sl 6e). Međutim, svi tumori KD izložena neki stupanj cijepanog kaspaze 3 (slika 6f). Nasuprot tome, nije bilo značajne razlike u ekspresiji cijepanog kaspaze 3 među SC-PBS, SC-glukoze i SC-GI tumora. U KD tumora, pozitivan izraz cijepanog caspase3 bila je značajno viša u KD-JS tumora nego u SC-PBS tumora. Štoviše, izraz cijepanog caspase3 bila je značajno viša u KD-glukoza ili KD-GI tumora nego u KD-PBS tumora. Najviši izraz zabilježeno je u tumoru KD-GI. Pregled

Rasprava pregled

U ovom istraživanju, obaranje stanice HIF-1α su se istražiti je li smrtonosna proizvodnja ROS mogu biti izazvana ispod hipoksije. Rezultati su pokazali da apoptotični smrt stanice inducirana KD stanicama, ali ne i u kontrolnim stanicama SC pod hipoksije. Istovremeno, ROS nakupila u staničnoj liniji obaranje prema trajanju hipoksije. Hypoxia- smrt induciranu stanica i akumulaciju ROS također zabilježen u različitim obaranje 74-KD stanica HIF-1α, ali ne i u kontrolnim 74 SC stanica. Štoviše, NAC tretman smanjuje stopu hipoksijom induciranu staničnu smrt u KD stanicama. Ovi rezultati ukazuju na pojavu hipoksije apoptozi zbog pretjeranog ROS akumulacije u KD stanica i podržava prethodne studije koje HIF-1 a knockout MEFs umro zbog prekomjernog ROS proizvodnju [33]. Pregled

ROS su uglavnom generirani u mitohondrija od strane ETC [17, 19]. On je izvijestio da su mitohondrijski ROS povećati pod uvjetima hipoksije [17, 19]. Ako hipoksija i dalje postoji, indukcija HIF-1 a dovodi do adaptivnih mehanizama za smanjenje ROS i uspostaviti redox homeostazu putem u povećanju relevantnih gena [19]. tako smo istraživali da li HIF-1α obaranje utjecati na ekspresiju mRNA za deset gena koji sudjeluju u kontroli ROS proizvodnje pod hipoksiju ( GLUT1 pregled, ALDOC pregled, PDK1 pregled, LDHA pregled i MCT4 pregled koji se odnosi na Warburg efekt; BNIP3 pregled i BNIP3L pregled koji se odnosi na mitophagy; LON pregled i COX4-2
se odnose na drugo; i MnSOD
, a ROS smetlar). Integrirana analiza RT-qPCR serija pokazala da je hipoksija inducirana ekspresija svih deset gena znatno potisnute u KD stanica, dok se pod normoxia, izraz mRNK LON i COX4-2 bila je značajno viša u KD stanica nego u SC stanica. Ovi rezultati pokazuju da je smrtonosna akumulacija ROS pod hipoksije u obaranje stanice HIF-1α može biti zbog višestrukih prekida upravljačkog mehanizma ROS. Stoga, karcinom terapija ciljanje HIF-1 a može biti djelotvoran u hipoksičnom području unutar želuca tkivu raka. Mehanizam u podlozi regulira prema gore ekspresiju mRNA za LON i COX4-2 u KD stanicama pod normoxia ne može biti razjašnjeno. Pregled

Prema navedenim nalazima, pretpostavili smo da je promocija unos glukoze može ubrzati hipoksije izazvanu apoptoza kroz daljnju proizvodnju ROS u HIF-1α obaranje KD stanica. Kao što se očekivalo, liječenje GI poboljšana smrt stanica u hipoksije KD stanica, koje su popraćene povećanom proizvodnjom ROS. U studiji unosa glukoze, inzulin povećana unosa 2DG u oba SC i KD stanica. U odnosu na ona koja je opažena u normoxia, hipoksije povećava apsorpciju 2DG u SC i KD stanica tretiranih sa ili bez inzulina. Unos je snažnije porastao u SC nego KD stanica, što ukazuje na razliku s obzirom na oslabljeni GLUT1 indukcije u hipoksiji KD stanica. S druge strane, Western blot analiza je pokazala da je membranski GLUT1 ekspresija je povećan s visokim sadržajem glukoze i /ili inzulina tretmana, u usporedbi sa kontrolnom obradom, u normoksičnim i hipoksične KD stanica. Konkretno, GI tretman najjače povećao Membranozni GLUT1 izraz u hipoksije KD stanica. Prethodna studija je izvijestio da inzulin potiče transport glukoze u poticanju translokacije GLUT4 iz unutarstaničnih vezikule pohranu na plazma membranu u skeletnim mišićima stanica ili adipocita [36, 37].

• PLoS ONE: Kopiranje Broj Dobici na 8q24 i 20q11-Q13 u rak želuca češći u crijevnom-Type nego difuzno Type
• PLoS ONE: Serum HER2 je potencijalna zamjena za Tissue HER2 statusa u rak želuca: sustavni pregled i meta-Analysis