PLoS ONE: Die apoptotische Wirkung von HIF-1α Hemmung in Kombination mit Glucose plus Insulin-Behandlung auf Magenkrebs unter hypoxischen Bedingungen

Abstrakt

Magenkrebs wächst unter einer hypoxischen Umgebung. HIF-1α ist bekannt, bei der Kontrolle der Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in den Mitochondrien unter hypoxischen Bedingungen eine wichtige Rolle zu spielen. Wir zuvor HIF-1α Knockdown (KD) Zellen etabliert und Steuerung (SC) Zellen in der 58As9 Magenkrebs-Zelllinie. In dieser Studie zeigten wir, dass KD-Zellen, aber nicht SC-Zellen induzierte Apoptose unter den Bedingungen einer Hypoxie (1% O _{2) aufgrund einer übermäßigen Produktion von ROS. Eine quantitative RT-PCR-Analyse zeigte, daß die Ausdrücke von zehn Gene, die in den Steuermechanismen ROS (einschließlich der Warburg-Effekt, Mitophagie, Elektronentransportkette [ETC] Modifikation und ROS Scavenging) reguliert wurden von HIF-1α beteiligt sind. Darüber hinaus verstärkt die Förderung der Glukoseaufnahme durch Glukose und Insulin (GI) Behandlung der apoptotischen Wirkung, die durch weitere ROS-Produktion in hypoxischen KD-Zellen begleitet wurde. Eine Western-Blot-Analyse zeigte, dass die Expression von membranartige GLUT1 in KD-Zellen durch Glucose- und /oder Insulin Behandlungen erhöht war, was darauf hinweist, dass die GI-induzierte Glukoseaufnahme durch die erhöhte Translokation von GLUT1 auf der Zellmembran vermittelt wird. Schließlich wird die Antitumor-Wirkung von HIF-1α Knockdown (KD) und GI wurde unter Verwendung eines Tumor-Xenotransplantat-Modell ausgewertet, wobei eine hypoxische Umgebung existiert natürlich. Als Ergebnis inhibierte die GI-Behandlung stark das Wachstum der Tumoren KD wodurch Zell-Apoptose hoch im Vergleich zu der Kontrollbehandlung induziert wurde. Im Gegensatz dazu wurde das Wachstum der SC-Tumoren exprimiert HIF-1α nicht durch die GI-Behandlung beeinflusst. Zusammengenommen legen die Ergebnisse nahe, dass HIF-1α-Hemmung und GI kann eine ideale Therapie, weil die Apoptose aufgrund der Zerstörung von ROS Homöostase spezifisch in Magenkrebs induziert wird, die unter einer hypoxischen Umgebung wächst, aber nicht in dem normalen Gewebe unter der aeroben Bedingungen}

Citation:. Tanaka T, Kitajima Y, Miyake S, Yanagihara K, Hara H, Nishijima-Matsunobu A, et al. (2015) Die apoptotische Wirkung von HIF-1α Hemmung in Kombination mit Glucose plus Insulin-Behandlung auf Magenkrebs unter hypoxischen Bedingungen. PLoS ONE 10 (9): e0137257. doi: 10.1371 /journal.pone.0137257

Editor: Ester Hammond, University of Oxford, Grossbritannien in

Empfangen: 30. April 2015; Akzeptiert: 13. August 2015; Veröffentlicht am: 4. September 2015

Copyright: © 2015 Tanaka et al. Dies ist ein offener Zugang Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons Attribution verteilt, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorgesehen sind der ursprüngliche Autor und Quelle genannt

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Einführung

Die hypoxischen Umgebung in soliden Tumoren wesentlich ist, wo sie ihre bösartigen Verhaltensweisen beschleunigt [1-4]. Wie bei anderen soliden Tumoren, ist Magenkarzinom bekannt ausgedehnte Gebiete von Hypoxie im Tumor beinhalten [5-7]. Hypoxischen Bedingungen mehrere biologische Ereignisse induzieren wie Angiogenese, lokale Invasion, Metastasierung, Strahlen- oder Chemoresistenz und verändert den Energiestoffwechsel in vielen Karzinomen bei Patienten mit einer schlechten Prognose führen [2-4].

Der Transkriptionsfaktor Hypoxie-induzierbaren Faktor 1 (HIF-1) ist der Hauptmediator der zellulären Anpassung an die Hypoxie [8-10]. HIF-1 ist ein heterodimeres Protein, bestehend aus einer konstitutiv exprimierten β-Untereinheit (HIF-1β) und eine Hypoxie-induzierbaren α (HIF-1α) -Untereinheit [8-10]. Das HIF-1α-Untereinheit wird durch das Ubiquitin-Proteasom-Weg unter Normoxie abgebaut. Im Gegensatz dazu wird unter Hypoxie, HIF-1α stabilisiert und dimerisiert mit HIF-1β mit CBP /p300 interagieren, die auf die Hypoxie-Response-Element (HRE) auf der Promotorregion von Hunderten von Zielgenen bindet dann [11-16]. Diese früheren Berichten haben die Anerkennung von HIF-1α als zentraler Regulator in der Pathogenese der festen Krebs führte

Reaktive Sauerstoffspezies (ROS), wie Superoxid-Anion (O _{2 ^{. - ), Wasserstoffperoxid (H 2 O 2) und Hydroxylradikale (HO •), bestehen aus radikalen und nicht radikale Sauerstoffspezies durch die partielle Reduktion von Sauerstoff gebildet. Intrazellulärem ROS werden hauptsächlich in den Mitochondrien durch oxidative Phosphorylierung (OXPHOS) erzeugt wird, ein Verfahren durch die Elektronentransportkette ausgeführt (ETC) [17]. Wenn ROS die zelluläre antioxidative Abwehrsystem zu überwältigen, tritt auf oxidativen Stress. Übermäßige oxidativen Stress verursacht die ROS-vermittelten Schädigung von Nukleinsäuren, Proteinen und Lipiden und führt zum Zelltod [17, 18].}}

HIF-1α wurde berichtet ROS-Produktion unter hypoxischen Bedingungen durch mehrere Mechanismen zu steuern einschließlich der Umwandlung des Energiestoffwechsels von OXPHOS zu Glykolyse, der als der Warburg-Effekt bezeichnet wird [19-23], die Induktion der mitochondrialen selektiven autophagy (als Mitophagie bezeichnet) [24, 25], ETC Modifikation durch eine Untereinheit Schalter in Cytochrom c Oxidase (COX) [26] und ROS-Fänger [27]. In den Stoffwechselweg des Warburg-Effekt, HIF-1α aktiviert zunächst die Transkription von GLUT1
die Glukoseaufnahme in Zellen zu erhöhen. Glucose wird dann durch die Aktionen der glykolytischen Enzym Mitglieder zu Pyruvat metabolisiert, die Ziele für HIF-1α bekannt sind [28, 29]. Unter aeroben Bedingungen wird Pyruvat durch Pyruvat-Dehydrogenase (PDH) für den Eintritt in die Tricarbonsäure (TCA) -Zyklus zu Acetyl-CoA (AcCoA) umgewandelt. Umgekehrt Zellen in Krebs Hypoxie ausgesetzt wird Pyruvat geshuntet weg von den Mitochondrien, wobei HIF-1α, die Expression von PDK1 upregulates um die PDH-Aktivität hemmen. Danach wandelt LDHA alternativ Pyruvat zu Lactat und MCT4 transportiert das Lactat aus der Zelle. Diese Gene werden auch von HIF-1α reguliert [16, 30, 31]. Hypoxie induziert Mitophagie exzessive ROS-Produktion zu verhindern, durch die die geschädigten Mitochondrien über lysosomalen Verdauung eliminiert werden [24, 25]. Jüngste Studien haben gezeigt, dass HIF-1α die Transkriptionen der Gene, die für BNIP3 und BNIP3L, wesentliche Faktoren im Mitophagie Prozess aktiviert [32]. Eine weitere Studie berichtet, dass HIF-1α-Untereinheit die COX4 Schalt reguliert, indem die Transkription der ETC-verwandte Gene COX4-2 und LON Aktivierung ein mitochondriales Protease, die für COX4-1 Abbau unter Hypoxie erforderlich ist [26]. Die COX4 Untereinheit Schalter wurde als wichtiger Schritt in ROS Homöostase aufgrund seiner Rolle berichtet die Effizienz der Atmung unter Hypoxie bei der Optimierung [26]. Die ROS-Scavenger MnSOD ist bekannt, Superoxidradikalen zu Wasserstoffperoxid umwandeln. In einer früheren Studie wurde berichtet, dass MnSOD unter Hypoxie hinaufreguliert wird, obwohl ob diese upregulation von HIF-1α vermittelt ist noch nicht gezeigt worden [27]. Vor kurzem zeigte ein weiterer Bericht über die interessante Erkenntnis, dass die embryonale Fibroblasten (MEF) von hypoxische HIF-1α-null-Mäuse aufgrund von zu viel ROS-Produktion starb, während die MEFs durch Behandlung mit dem Antioxidans N Acetyl-L-Cystein (NAC) gerettet wurden [ ,,,0],33]. Zusammengenommen zeigen diese Berichte, dass HIF-1α eine zentrale Rolle spielt die mitochondriale ROS-Produktion in der Organisation von Zellen unter Hypoxie zu leben.

In dieser Studie wollten wir, dass die Hypoxie-induzierte Apoptose ein therapeutisches Modell zu etablieren demonstrieren über die Überproduktion von ROS können HIF-1α-defizienten Magenkrebszellen eingebracht werden. Wir haben uns zunächst festgestellt, ob eine Hypoxie induziert durch die übermäßige Produktion von ROS in der HIF-1α Knockdown (KD) Zellen den Zelltod. Danach richten wir die Hypothese, dass die Einführung von hohen Glucosespiegel durch Behandlung von KD-Zellen mit Insulin die apoptotische Wirkung verstärken kann. Schließlich ein Tumorxenotransplantates Modell, wir vorgeschlagen, dass HIF-1α Hemmung in Kombination mit Glucose plus Insulin (GI) Behandlung eine mögliche Therapie für Magenkrebs sein kann.

Materialien und Methoden

Zellkultur Bedingungen und Reagenzien

die Magenkrebs-Zelllinie 58As9 freundlicherweise von Dr. K. Yanagihara (National Cancer Center Hospital East, Chiba, Japan) im Dezember 2009. die 58As9 Zelllinie ursprünglich aus dem szirrhösen gegründet wurde zur Verfügung gestellt wurde Magenkarzinom abgeleitete Zelllinie HSC-58 [34]. Diese Zelllinie wurde dann weiter am 24. Februar authentifiziert ^{th, 2015 von der JCRB Cell Bank (Osaka, Japan). Ein weiterer Magenkrebs-Zelllinie, MKN74 wurde von Cell Bank, RIKEN Bio Resource Center (Tsukuba, Japan) erworben. In der vorliegenden Studie verwendeten wir stabile HIF-1α Knockdown Zellen KD und 74 KD-, die durch die Transfektion der siRNA Plasmid eingeführt wurden, die RNAi-Sequenzen in das 58As9 und MKN74-Zellen beherbergen, wie zuvor beschrieben [7, 35]. Die Sequenzen von siRNA Targeting HIF-1α und Kontrolle verschlüsselten siRNA gestaltet sich wie folgt: HIF-1α siRNA für KD oder 74-KD (5'-CCA CAT TCA CGT ATA TGA T-3 ') und Gerangel siRNA für SC oder 74- SC (5'-TCT TAA TCG CGT ATA AGG C-3 '). Die Zellen wurden in RPMI-1640-Medium (Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO, USA), ergänzt mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS) und 100 ug /ml Kanamycin (Meiji, Tokyo, Japan ) und bei 37 ° C in einer befeuchteten Atmosphäre inkubiert. Die Zellen wurden unter kultiviert entweder normoxischen Bedingungen (20% O _{2 und 5% CO 2 in der Luft) oder hypoxischen Bedingungen (1% O 2, 5% CO 2 und 94% N 2) in einer hypoxischen Kammer (ASTEC, Fukuoka, Japan) und dann mit NAC (Sigma-Aldrich) und Insulin (Wako, Osaka, Japan) bei einer Endkonzentration von 5 mM und 500 ng /ml bzw. behandelt. Die Konzentration des Hochglucosemedium wurde durch Zugabe von 45% D hergestellt - (+) - Glucose-Lösung (Sigma-Aldrich) und die Endkonzentration wurde bestimmt, 10 g /L zu sein, die 5-mal höher ist als die in normalen RPMI-1640-Medium.}}

Zelllebensfähigkeitstest

Die Lebensfähigkeit der Zellen unter Normoxie oder Hypoxie durch Trypanblaufarbstoff Ausschluss-Assays bewertet. Für die Bewertung der Arzneimittelbehandlungswirkungen, einschließlich NAC, hohe Glucose- und /oder Insulin auf der Lebensfähigkeit der Zellen, 1 × 10 ^{5 Zellen wurden auf 6 cm Kulturschalen ausgesät. Die Zellen wurden mit verschiedenen Medikamenten in den angegebenen Konzentrationen und kultiviert unter Normoxie Hypoxie oder für 24 h bis 96 h behandelt. Am Ende der Inkubation werden die schwimmenden und haftenden Zellen wurden gesammelt und durch Zentrifugation pelletiert (3000 Upm, 5 min). Die Zellen wurden in 90 &mgr; l Vollmedium, mit 10 &mgr; l von 0,4% Trypanblau-Lösung resuspendiert und gezählt einer Zählkammer unter einem Mikroskop. Die Zelltodesrate wurde als das Verhältnis der Anzahl der toten Zellen /Gesamtzellzahl bestimmt. Alle Experimente wurden dreifach wiederholt und unabhängig mindestens dreimal durchgeführt.}

Western blot analysis

Ganzzelllysate aus kultivierten Zellen und das Xenotransplantat-Tumoren in Mäusen wurden mit Lysepuffer, bestehend aus 150 mmol /L NaCl, 50 mmol /L Tris-HCl (pH 7,6), 0,5% Triton X-100, und eine Protease-Inhibitor-Cocktail-Mix (Roche, Mannheim, Deutschland). Zelllysate aus der cytosolischen Fraktion und Zellmembranfraktion wurden unter Verwendung eines Cytochrome c Releasing Apoptosis Assay Kit hergestellt, und ein Plasma Membrane Protein Extraction Kit (BioVision Inc., Milpitas, CA, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die Western-Blot-Analyse wurde durchgeführt, wie zuvor beschrieben [7]. Aliquots 30 ug Protein enthielten, wurden elektrophoretisch in 4-12% Bis-Tris-Gel (Invitrogen) und auf eine Amersham Hybond-ECL-Membran (GE Healthcare, Buckinghamshire, UK) in einem Transferpuffer übertragen getrennt. Nachdem mit 5% Milch blockiert Haut für 30 min wurde die Membran mit primären Antikörpern über Nacht bei 4 ° C inkubiert. Die folgenden primären Antikörper wurden verwendet: anti-HIF-1α (1: 1000 Verdünnung, Abcam, Cambridge, UK), anti-gespaltenen Caspase 3 (1: 1000, Cell Signaling Technology, Danvers, MA), anti-Cytochrom c (1 : 500-Verdünnung, BioVision), anti-GLUT1 (1: 100.000 Verdünnung Abcam) und anti-β-Actin (1: 10.000 Verdünnung; Sigma-Aldrich, Inc.). Nach der Inkubation mit den entsprechenden sekundären Antikörper wurden die Signale mit Hilfe eines Amersham ECL Plus Western Blotting Detection System (GE Healthcare) entwickelt.

Der Nachweis von intrazellulären ROS durch Durchflusszytometrie

Die intrazelluläre ROS-Werte wurden bewertet mit einem Gesamt ROS Detection Kit (Enzo Life Sciences, Inc., Farmingdale, NY, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Kurz gesagt, KD, SC, wurden die Zellen unter Bedingungen kultiviert, entweder Normoxie Hypoxie oder mit oder ohne Arzneimittelbehandlungen (d.h. NAC, hohe Glucose- und /oder Insulin) für 24 h, 48 h und 72 h. 74-kD- und 74-SC wurden ebenfalls unter den Bedingungen von entweder gezüchtet Normoxie Hypoxie oder für 24, 48 und 72 Stunden ohne medikamentöse Behandlung. Die Zellen wurden gewaschen und in der ROS Detektionslösung resuspendiert. ROS-Fluoreszenz wurde durch FACS Calibur Durchflußzytometer (Becton-Dickinson, San Jose, CA) analysiert und durch die Cell Quest Software-Programm detektiert wird. Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt. Die mittlere Fluoreszenz der ROS-Produktion wurde automatisch ermittelt und als GEO präsentiert bedeuten.

Gesamt-RNA-Extraktion und quantitative RT-PCR

Gesamt-RNA aus Zelllinien extrahiert wurde unter Verwendung eines Isogen RNA-Extraktions-Kits ( Nippon Gene, Osaka, Japan). Ein ug RNA wurde in cDNA umgewandelt unter Verwendung eines ReverTra Ace (Toyobo) reverse Transkriptionsreaktion Kit. Die cDNA wurde als Matrize für die PCR verwendet. Eine quantitative Echtzeit-RT-PCR (RT-qPCR) wurde mit Hilfe des Light Cycler Instrumentensystem (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Deutschland) mit einem Licht-Cycler-Fast Start DNA Master SYBR Green I-Kit (Roche) durchgeführt. Die zehn Gene, die durch die RT-qPCR analysiert wurden, waren wie folgt: Glukosetransporters 1 ( GLUT1
), Aldolase C ( Aldoc
), Pyruvat-Dehydrogenase-Kinase-1 ( PDK1
), Lactatdehydrogenase A ( LDHA
) und Monocarboxylatsalzen Transporter 4 ( MCT4
), Bcl-2 /Adenovirus EIB 19-kDa interacting protein 3 ( BNIP3
), BINP3 wie ( BNIP3L
), mitochondriale Mangan Superoxid-Dismutase ( MnSOD
), eine mitochondriale Protease LON
und Cytochrom-Oxidase Untereinheit 4-2 ( COX4 - 2
). Die Primer wurden entsprechend den berichteten cDNA-Sequenzen (GenBank, Bethesda, MD) (Tabelle 1) konstruiert. bei 60 ° C und 10 s Extension bei 72 ° C nach dem Durchführen bei 95 ° C, einen Denaturierungsschritt bei 95 ° C für 3 min, PCR-Amplifikation wurde 5 s Annealing bei 50 Zyklen von 15 s Denaturierung durchgeführt. Die quantitativen Werte wurden auf die β-Aktin normalisiert ( ACTB
) Ausdruck (Tabelle 1). Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt und unabhängig mindestens dreimal wiederholt.

Glucose-Aufnahmetest

Die Glukoseaufnahme in kultivierten Zellen wurde unter Verwendung eines 2-Desoxyglucose (2DG) Uptake Mess Kit bestimmt (COSMO BIO Co. Ltd., Tokyo, Japan). Kurz gesagt, wurden die Zellen für 6 h unter einem serumausgehungerten Zustand kultiviert, durch die weitere Kultivierung für 18 Stunden folgte in regelmäßigen Medium mit 10% FBS ergänzt. Die Zellen wurden für 24 h unter Normoxie oder Hypoxie inkubiert. Danach wurden die Zellen für 18 min mit oder ohne 500 ng /ml Insulin behandelt. Schließlich wurden die Zellen für 20 min mit 2DG behandelt und zur Messung der Aufnahme 2DG unterworfen nach den Anweisungen des Herstellers. Alle Experimente wurden in dreifacher Ausfertigung und die Mittelwerte wurden berechnet durchgeführt.

Tierstudien

Die Tier Protokolle durch die Institutional Animal Care und Verwenden Ausschüsse der Saga University (Protokoll 24-008-0 genehmigt ) und angepasst für die Verwendung von Tieren in der Forschung zu den ARRIVE Richtlinien. Weiblich 4 Wochen alten athymischen BALB /cA Jcl Mäuse (nu /nu) wurden von Nihon Crea Co. (Osaka, Japan) erhalten. Die Tiere wurden gehalten unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen. Sie wurden sterile Nahrung und autoklaviert Wasser mit einem 12-h Hell-Dunkel-Zyklus gegeben. Die Mäuse wurden vor den Versuchen für 7 Tage an die Umgebung gewöhnt. KD oder SC-Zellen (3 x 10 ^{6) wurden subkutan in den Rücken der Mäuse (n = 9 für jede Zelllinie) injiziert. Zehn Tage nach der subkutanen Inokulation werden die Xenotransplantate beider Zellen wurde tastbar. Neun Mäuse KD oder SC-Xenotransplantate trugen, wurden dann in drei Gruppen unterteilt für die Behandlung von Glucose (8 g /kg /Tag, Sigma), Glucose plus Insulin (GI) (1 Einheit pro 3 g Glucose /Tag, Wako) oder phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) als die Kontrollbehandlung. Jedes dieser Medikamente wurden intraperitoneal verabreicht in drei Mäusen (sechs Tumoren total) alle 24 h von Tag 1 bis Tag 11. Während dieser Zeit wurden die Tumore gemessen in 2 senkrechten Dimensionen mit einer Abgreifhöhe alle vier Tage. Die Tumorgröße ( T
) wurde als die maximale Schnittfläche ausgewertet und durch die folgende Formel bestimmt: T
= π /4 × ein
× b
, wobei a Was ist die kürzere Achse (mm) und b Was ist die längere Achse (mm). Die Mäuse wurden 12 Tage nach der Behandlung mit Medikamenten getötet und die Tumore wurden für die nachfolgende Experiment geerntet.}

Cleaved Caspase 3 Immunhistochemie und die Beurteilung der Apoptose in vivo

gefrorene Tumoren wurden mit Tissue-Tek Oktober eingebettet Verbindung. Diese Blöcke wurden geschnitten in 4 um dicke Abschnitte. Für Antigen-Retrieval wurden die Objektträger in Tris-EDTA-Puffer (pH 9,0) in einer Mikrowelle (500 Watt) für 5 min erhitzt. (200, Cell Signaling Technology 1) für 2 h bei Raumtemperatur und die DAKO Envision +-System (Dako Cytomation, Glostrup, Dänemark) wurde als sekundärer Antikörper verwendet, die Abschnitte wurden dann mit anti-gespaltenen Caspase 3 inkubiert. Die Signale wurden mit Diaminobenzidin-tetrahydrochlorid (0,02%) sichtbar gemacht. Für die Bestimmung der Apoptose gespalten Caspase 3-positive Zellen mit braun gefärbten Kerne wurden in fünf Felder bei 400facher Vergrößerung und der Mittelwert wurde berechnet gezählt. Die immunhistochemischen Expression gespalten Caspase 3 wurde blind durch einen zertifizierten Pathologen (Dr. AN) überprüft und bewertet.

Die statistische Analyse

Die Daten, die von einer ANOVA analysiert wurden die Prism 5 Software-Paket ( GraphPad Software, La Jolla, CA). Für den Vergleich zwischen den beiden Gruppen wurden die Unterschiede in den Mittelwerten von Student bewertet t-
-Test und Mann-Whitney U
Test. Für den Vergleich zwischen drei oder mehr Gruppen, Bonferroni post hoc-Tests wurden für eine Einweg-ANOVA durchgeführt. Ein Wert von p < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Alle Daten sind als Mittelwert ± SEM ausgedrückt.

Ergebnisse

• PLoS ONE: Copy Number Gewinne bei 8q24 und 20q11-q13 in Magenkrebs sind häufiger in Darm-Typ als Diffuse-Typ
• PLoS ONE: Serum HER2 ist ein potenzielles Surrogate für Tissue HER2-Status in Magenkrebs: Eine systematische Übersicht und Meta-Analysis