Baggrund
galectin-3 er kendt for at regulere kræft metastaser. Men den underliggende mekanisme ikke er blevet defineret,. Gennem DNA microarray studier efter galectin-3 nedregulering, demonstrerede vi her, at galectin-3 spiller en central rolle i opregulering udtrykkene for protease-aktiveret receptor-1 (PAR-1) og matrixmetalloproteinase-1 (MMP-1) PAR-1 og derved fremme mavekræft metastaser.
Metode /vigtigste resultater
Vi undersøgte ekspressionsniveauerne af galectin-3, PAR-1, og MMP-1 i mavekræft patient væv og også virkningerne af tavshed disse proteiner med specifikke siRNA'er og overekspression dem ved hjælp af specifikke Lenti-virale konstruktioner. Vi har også ansat zebrafisk embryo model til analyse af in vivo Konklusioner /Signifikans galectin-3 spiller en central rolle aktivering celleoverfladereceptor gennem produktion af protease og øger gastrisk cancer metastase. Galectin-3 har potentiale til at tjene som en nyttig farmakologisk mål for forebyggelse af mavekræft metastaser Henvisning:. Kim S-J, Shin J-Y, Lee K-D, Bae Y-K, Choi I-J, Park SH, et al. (2011) galectin-3 Letter cellemotilitet i gastrisk cancer ved opregulering Protease-aktiveret receptor-1 (PAR-1) og matrixmetalloproteinase-1 (MMP-1). PLoS ONE 6 (9): e25103. doi: 10,1371 /journal.pone.0025103 Redaktør: Jean-Marc Vanacker, Institut de Génomique fonctionnelle de Lyon, Frankrig Modtaget: 18. maj 2011; Accepteret: August 23, 2011; Udgivet: 22 September, 2011 Copyright: © 2011 Kim et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af National Cancer center (NCC) i Republikken Korea tilskud (NCC-0.910.150 og NCC-0.810.060), Innovative Research Institute for Cell Therapy, Republikken Korea (A062260), og denne forskning blev støttet af Research Program Basic442 Science gennem Grundforskningsfond (NRF) finansieret af Ministeriet for Uddannelse, Videnskab og Teknologi (1.031.790 til 1), Republikken Korea. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser Introduktion kræft, der spredes (metastaserer) fra deres oprindelige sted til et andet område af kroppen, kaldes metastatisk kræft. metastatiske cancere har dårlig prognose og høj dødelighed [1]. En fuld forståelse af den biologiske mekanisme (r) er involveret i metastase og rationelle metoder til at forebygge eller bekæmpe metastaser kan føre til praktiske tilgange til at forbedre overlevelsesraten for patienter ramt af metastatisk kræft. I tidligere undersøgelser fandt vi, at galectin-3 øger gastrisk cancercellelinie motilitet ved opregulering fascin-1, en actin-bundling cytoskeletprotein [2]. Galectin-3 er en 31 kDa kulhydrat-genkendelse protein, der er involveret i tumorigenese, cancercellevækst og metastase [3], [4], [5] og dets høje ekspression i flere humane cancere har vist sig at korrelere med dårlig prognose af metastatisk kræft. for at præcisere, hvilken rolle galectin-3 i kræft metastase, vi bankede-down sit udtryk i gastriske kræftceller ved hjælp af sin siRNA og undersøgt resultaterne i genekspression ved DNA microarray analyse [6]. Blandt tidligere resultater, fandt vi signifikant reduktion i niveauet af protease-aktiveret receptor-1 (PAR-1), et medlem af familien af transmembrane G-protein-koblede receptorer [7], og dens aktivator, matrixmetalloprotease-1 ( MMP-1) (fig S1). Kløvede PAR-1 er auto-phosphoryleret og transduceres af ekstracellulært signal (er) gennem forskellige veje, og spiller en kritisk rolle ved tumormetastase [7], [8], [9]. Over-ekspression af PAR-1 er blevet rapporteret i flere kræftformer, herunder melanomer, bryst- og gastriske cancere. MMP-1 er også opreguleret i en bred vifte af avancerede cancertyper, og der er observeret en signifikant negativ korrelation mellem dets ekspression og patientoverlevelse [10], [11], [12], [13]. flere undersøgelser fandt også, at MMP-1 spiller en afgørende rolle i metastase af brystkræft [14], lever og tyktarmskræft [15], og gastrisk kræft [16], [17], blandt andre. Det fremgår, at når udskilles, MMP-1 fremmer kræftcelle invasion gennem nedbrydning af ekstracellulære matricer og /eller submukøse lag af lymfekar [10], [14]. Talrige undersøgelser viste, at inhibering af MMP'er fører til inhibering af celleinvasion [18], [19]. isse fund førte os til hypotesen, at galectin-3, PAR-1 og MMP-1 kan være involveret i øge migration og invasion af mavekræft. For at teste denne hypotese, vi gennemført undersøgelser for deres rolle i gastriske cancerceller. I begge in vitro Silencing galectin -3 eller PAR-1 reducerer migration og invasion af humane gastriske cancerceller ekspressionsniveauerne for galectin-3 og PAR-1 var høj i de fleste gastriske cancercellelinier. Vi tavshed galectin-3 og PAR-1 i MKN-28 celler anvender de respektive siRNA'er. Behandling med galectin-3 siRNA faldt ekspressionsniveauer af både galectin-3 og PAR-1, hvorimod PAR-1 siRNA behandling kun faldt PAR-1 ekspression, mens der blev observeret nogen forskel i galectin-3 (figur 1A). Transfektion af SNU-638-celler, som oprindeligt udviser ingen ekspression galectin-3, med galectin-3-kodende plasmid resulterede i forøget ekspression af både PAR-1 og galectin-3 (figur 1B). Silencing enten galectin-3 eller PAR-1 reducerede samlede antal at migrere ( s Vi undersøgte forholdet mellem galectin-3-inducerede stigninger i cellemigrering og invasion på den ene side og PAR-1-ekspression på den anden side. Vi inficerede SNU638 celler med et lentivirus indeholdende galectin-3-ekspressionskassetten og undersøgt udtrykkene for galectin-3 og PAR-1, og målte cellemigration. Vi fandt, at overekspression af galectin-3 blev ledsaget af forøget PAR-1 mRNA og protein udtryk (figur 2A), samt cellemigrering ( s Restaurant < 0,001) (figur 2B) og celleinvasion ( s Vi har forsøgt derefter at belyse, hvordan galectin-3 regulerer PAR-1-ekspression. Fordi det blev rapporteret, at AP-1 transkriptionel aktivitet reguleres af galectin-3 [20], vi fokuserede på den rolle, som denne transskription faktor i denne henseende (figur 2D). Vi udførte immunopræcipitationsundersøgelser og konstateret, at galectin-3 direkte interagerede med både Fra-1 og c-Jun i AP-1-komplekset, og at denne interaktion blev associeret med opregulering af AP-1 transkriptionel aktivitet (figur 2E). Dernæst undersøgte vi DNA-bindingsaktivitet af AP-1 med og uden galectin-3 ved chip assays (figur 2F). Vi fandt, at AP-1-komplekset bundet promotoren for PAR-1 i nærvær af galectin-3, men ikke i dets fravær. Vi vurderede også den transkriptionelle aktivitet af AP-1 ved luciferaseanalyse efter transfektion af et reporterplasmid indeholdende AP-1 bindingssekvens foran en luciferase-kørsel minimal promotor i LacZ eller galectin-3 overudtrykker SNU-638 celler ( s MMP-1 er blevet rapporteret at regulere PAR-1-aktivering gennem spaltning af PAR-1 tøjret intracellulær signalering, og påvirke celleinvasion [21]. Som beskrevet i figur S1, viste vi, at galectin-3 regulerede MMP-1-ekspression. Derfor har vi bekræftede det indbyrdes af galectin-3, MMP-1 og PAR-1. Vi analyserede mRNA ekspressionsniveauer af MMP-9, som er en nedstrøms mål for PAR-1 [8], efter silencing galectin-3, MMP-1 og PAR-1 individuelt (figur 3A). Mens galectin-3 lyddæmpning reducerede ekspressionen af alle tre molekyler (MMP-1, PAR-1 og MMP-9), MMP-1 lyddæmpning reduceres kun MMP-9-ekspression og ikke i galectin-3 eller PAR-1. Interessant, PAR-1 lyddæmpning producerede de samme virkninger som MMP-1 lyddæmpning. Vi har registreret også phosphorylering af cytoskeletprotein paxillin (pY181), et kendetegn for PAR-1-aktivering [22], [23]. Efter lyddæmpende galectin-3, MMP-1 og PAR-1 individuelt blev phosphorylaion af paxillin faldet, som foreslog galectin-3 også reguleret PAR-1-aktivitet. Vi kontrollerede også reduktionen af MMP-9-aktivitet efter silencing af galectin-3, MMP-1 og PAR-1 individuelt (figur 3A). Salg galectin-3 over-udtrykkende SNU638 celler viste øget ekspressionsniveauer af MMP -1 og PAR-1-protein, såvel som deres mRNA'er, i tillæg til phosphoryleret paxillin (pY181). I disse celler, MMP-1 lyddæmpning reducerede phosphorylering af paxillin uden at ændre ekspressionen af galectin-3 eller PAR-1 (figur 3B). Desuden MMP-1 lyddæmpning reduceret celleinvasion, som er udløst af galectin-3 overekspression ( s Restaurant < 0,001) (figur 3C), hvilket indebærer, at galectin-3 forøgede MMP-1-ekspression, der fører til aktivering af PAR-1-signalering. over-ekspressionen af MMP-1 i cancerceller øger celle invasion gennem aktivering af PAR-1 signalering Vi bekræftede, at opregulering af MMP-1 ved galectin-3 er vigtig for aktiveringen af PAR-1-signalering og øget invasion gastriske cancerceller. Et lentivirus (pLECE3 Vector) indeholdende MMP-1-ekspressionskassetten reguleret af CMV-promotoren blev fremstillet og inficeret i AGS gastriske cancerceller (figur 4A-B). Som forventet, MMP-1 overekspression øget invasionen potentiale af gastrisk kræftceller, og PAR-1 lyddæmpning vendte markant denne stigning ( s Transgene zebrafisk, Tg (kdrl: EGFP) s843 udtryk for galectin-3, PAR-1 og MMP-1 er forhøjet, parallelt, i de maligne væv af mavecancerpatienter Vi bestemt mRNA og protein ekspressionsniveauer af galectin-3, PAR-1 og MMP-1 i normale og maligne væv fra 20 gastriske kræftpatienter, derefter anvendes RT-PCR under anvendelse af et billede J analysator. Som vist i figur 5C og figur S3, 73,7% af kræftpatienter viste højere ekspressionsniveauer af galectin-3 og 70% af dem viste højere PAR-1 og MMP-1-niveauer i deres maligne væv end i deres normale modstykker. Desuden blandt galectin-3 positive patienter, 71,4% var også PAR-1 positiv, mens 64,3% var også MMP-1 positiv (figur 5D). Disse data viste, at der er en parallel stigning i ekspressionen af galectin-3 samt PAR-1 og MMP-1, i de maligne gastriske væv. Vi fandt også, at disse proteiner co-lokaliseret i de maligne områder af vævene, og ikke i ikke-maligne områder (figur 5C). Galectin-3 var til stede i både cytosolen og kernen, mens PAR-1 og MMP-1 blev set generelt i cytosolen og membranen inden for det samme område (figur 5C). Disse resultater antydede, at både PAR-1 og MMP-1 udtryk signifikant korreleret med galctin-3 ekspression i mavecancerpatienter. Denne undersøgelse viste, at galectin-3 forbedret mavekræft celle migration og invasion. Mekanistisk denne linkede galectin-3 til opregulering af PAR-1 celleoverfladereceptor, og aktiviteten MMP-1-protease. Dette er i overensstemmelse med rapporter viser en korrelation mellem ekspressionen af PAR-1 og tumor invasion og metastase i mave- og flere andre kræftformer [25], [26], [27]. Denne undersøgelse er den første til at påvise en direkte interaktion mellem galectin-3 og AP-1 komplekse komponenter, c-Jun og Fra-1, og regulering af PAR-1-ekspression af AP-1 transkriptionel faktor. Da det allerede er blevet vist af andre, at overekspression af Fra-1 fremmer cancercelleinvasion og metastase [28], opregulering af PAR-1 af c-Jun og Fra-1 syntes at være en mulig mekanisme forklarer binding af galectin-3 induceret opregulering af PAR-1 celleoverfladereceptor, og aktiviteten MMP-1-protease. Denne mulighed understøttes af vores fund af parallelle og co-lokaliserede udtryk for galectin-3 og PAR-1 i maligne væv af gastrisk kræftpatienter. Det er en roman iagttagelse, at galectin-3 stigninger MMP-1-ekspression . Det er klart, at overekspression af MMP-1 kan øge gastrisk cancercelleinvasion aktivitet ved at blokere celle til celle og celle til matrix-interaktioner ved ECM-nedbrydning. Derfor kan en stigning i MMP-1-ekspression fremmet af galectin-3 har dobbelte virkning, nemlig PAR-1-aktivering og ECM-nedbrydning, og begge er kritiske for mavekræft metastase. Men hvordan galectin-3 regulerer MMP-1-ekspression er stadig uklart, fordi ekspressionen af MMP-1 reguleres af en række komplekse begivenheder herunder krydstale mellem flere transkriptionelle faktorer, såsom AP-1, signaltransducer og aktivator af transskription-3, MAP-kinase, og hypoxi-inducerbare faktor-1 i hypoxi [29], [30], [31]. Etablering af zebrafisk ( Danio rerio Som konklusion, vores studier viste, at galectin-3 accelererede mavekræft cellemotilitet ved opregulering af PAR-1 og MMP-1. Yderligere undersøgelser er klart behov for at etablere rolle galectin-3 i cancer metastaser og dens egnethed som et terapeutisk mål for udvalgte kræftformer. Væv Par af 2 mm blev opnået mellemstore biopsi prøver fra gastrisk adenocarcinom væv af 20 patienter, der gennemgår diagnostisk endoskopi og endoskopisk submucosa dissektion, ved National cancer center i Korea, efter at have indhentet deres skriftlige informerede samtykke. Vævsprøverne blev frosset i flydende nitrogen ved -70 ° C umiddelbart efter biopsi indtil anvendelse. Nogle af vævsprøverne blev paraffindized for immunohistokemiske undersøgelser efter behov. Disse undersøgelser blev godkendt af Institutional Review Board of National Cancer Center (# NCCNSH 03-024). Moderat differentierede humane gastrisk adenocarcinom cellelinjer, AGS, MKN- 28 og SNU-638 blev opnået fra Korea cellelinie Bank og opretholdt som tidligere [35] beskrevne. siRNAs anvendt i transfektionerne blev alle leveret af Invitrogen (Carlsbad, CA). Deres sekvenser er galectin-3 (LGAL3) siRNA; 5'-AUAUGAAGCACUGGUGAGGUCUAUG-3 ', PAR-1 siRNA; 5'-CCCAUCUGUGUACACCGGAGUGUUU-3 ', og MMP-1 siRNA; 5'-GGAGAAAUAGUGGCCCAGUGGUUGA-3 '. Transfektioner blev udført under anvendelse af Lipofectamine RNAiMAX reagens (Invitrogen) ved at følge producentens instruktioner. Induktion af forbigående galectin-3 overekspression i SNU-638-celler blev opnået ved anvendelse pcDNA3.1 /NT-galectin-3 med pcDNA3.1 /NT-GFP. Til normalisering kontrol behandling blev gastriske cancercellelinjer behandlet med 1 ug af LTX reagenser (Invitrogen). Totalt RNA blev isoleret fra humane gastriske cancerceller og vævsprøver fra patienter, der anvender TRIzol Reagent (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. Revers transkriptase PCR blev udført under anvendelse af en revers transskription-system (Promega Corp. USA), ifølge producentens instruktioner. Primerne blev anvendt: 5'-ATGGCAGACAATTTTTCGCTCC-3 '(sense) og 5'-ATGTCACCAGAAATTCCCAGTT-3' (anti-sense) til human LGAL3 (galectin-3) gen; 5'-CCAAAACTGAGCATAAGTCC-3 '(sense) og 5'-AGGATGGAGCAAATGTAGTG-3' (anti-sense) til human F2R (PAR-1) genet; 5'-ACAGCTTCCCAGCGACTCTA-3 '(sense) og 5'-CAGGGTTTCAGCATCTGGTT-3' (anti-sense) til human MMP-1 genet; 5'-CTCGAACTTTGACAGCGACA-3 '(sense) og 5'-GCCATTCACGTCGTCCTTAT-3' (anti-sense) til human MMP-9-genet; 5'-AGCCTCGCCTTTGCCGA-3 '(sense) og 5'-CTGGTGCCTGGGGCG-3' (anti-sense) til human β-actin-genet; 5'-GGCTGCTTTTAACTCTGGTA-3 '(sense) og 5'-ACTTGATTTTGGAGGGATCT-3' (anti-sense) til human glyceraldehyd 3-phosphatdehydrogenase (GAPDH). PCR blev udført i et 20 pi volumen under anvendelse af en Ex Taq (Takara). Amplifikationscyklen (denaturering 95 ° C i 1 min, annealing 60 ° C i 1 min og ekstension ved 72 ° C i 2 minutter) blev gentaget 32 gange efterfulgt af endelig forlængelse i 10 minutter ved 72 ° C. Konstruktion af galectin-3 udtrykkende Lenti-viral vektor og infektion fuldlængde human galectin-3 udtrykkende konstruktion pcDNA3.1-NT-GFP-Gal3, pcDNA3.1-NT-GFP-vektoren og den Lenti-viral vektor til over-express LacZ, galectin-3 (1-250) i pLL3.7 er tidligere blevet beskrevet [2]. Human F2R blev klonet ind pLECE3 i BamH1 og Not1 restriktionsenzymsteder, skaber pLECE3-F2R (PAR-1) konstruktion. CDNA'er i fuld længde af F2R, MMP-1, og kontrol mRFP blev anvendt til PCR-amplifikation, sammen med primerne anført i data S1, og resulterende PCR-fragmenter blev klonet ind i pLECE3 vektor under anvendelse PAC1 og Hpa1 restriktionsenzymsteder, skaber pLECE3 MMP-1-konstruktionen. Desuden blev mRFP-stedet i pGEM-T-Easy vektor overført til pLL3.7 vektor erstatte GFP-regionen under anvendelse alder1 og EcoR1 restriktionsenzymsteder, at gøre pLL3.7-mRFP. Lenti-viral vektor produktion er tidligere blevet beskrevet [2] Western blot-analyse cellelysat ekstraktioner blev fremstillet med RIPA-puffer (1% NP-40;. 0,1% natriumdodecylsulfat; 0,5 % desoxycholat; 150 mM NaCI; 50 mM Tris, pH 7,5) og protease inhibiter cocktail. 20 ug totalt protein af hvert lysat blev løst i 8-12% SDS PAGE geler og elektro-overført til PVDF-membran, og derefter blokeret i 5% skummetmælk i 0,05% Tween-20 med 1 × PBS (PBST). Polyklonale primære antistoffer, anti-galectin-3, anti-ThrombinR (PAR-1), anti-c-Jun, anti-Fra-1 og anti-β-actin (Santa Cruz), anti-MMP1 (Calbiochem), anti- paxillin og anti-phospho paxillin (pY181) (Epitomics) inkuberet med blots ved 1:1000 fortynding i minimal volumen af 5% BSA (bovint serumalbumin) i PBST-buffer i 1 time stuetemperatur eller over-nat i 4 ° C. Anti-muse- eller anti-kanin ged-HRP-konjugeret sekundære antistoffer (GE Healthcare UK Limited) blev inkuberet ved 1:5000 fortynding på 5% BSA i PBST-buffer i 1,5 time ved stuetemperatur. Proteiner af interesse blev detekteret ved forøget kemiluminescens (ECL) (Amersham Corp, Arlington Heights, IL, USA). cellelysat ekstrakter blev fremstillet med IP + buffer (20 mM Hepes, 1 % Triton X-100, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 100 mM NaF, 10 mM natriumpyrophosphat, 1 mM natriumorthovanadat, 0,2 mM PMSF, 10 ug /ml proteaseinhibitorcocktail) i is i 30 minutter. Efter affaldsfjernelsesværktøjet ved centrifugering (13200 rpm ved 4 ° C i 20 min) blev supernatanterne underkastet en preclearing trin med protein A /G agaroseperler ved 4 ° C i 30 minutter i rotator. Supernatanter opnået efter en kort centrifugering (2000 rpm ved 4 ° C i 4 min) blev underkastet immunpræcipitation anvendelse af et anti-galectin3 og normalt muse-IgG (negativ kontrol). Immunpræcipitater blev vasket to gange i IP-buffer (20 mM Hepes, 1% Triton X-100, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 100 mM NaF, 10 mM natriumpyrophosphat). Efter 30 pi 2 x SDS-prøvepuffer tilsætning, efterfulgt kogning ved 95 ° C i 5 min. Efter supernatanter opnået efter en kort centrifugering, blev deres protein ekspressionsniveauerne bestemmes gennem Western blot analyse udført. For galectin-3 og PAR-1 immunhistokemi, deparaffineret gastrisk kræftpatienter vævssnit blev efterladt i en mikrobølgeovn i 15 minutter i citratpuffer (Vector Laboratories), og derefter inkuberet med 3% H 2O 2 i 15 minutter for at blokere endogen peroxidase, efterfulgt af inkubation med 10% normalt gedeserum (Vector laboratorier) i 1 × PBS i 10 min. Primære antistoffer blev anvendt en anti-galectin-3 (1:200) anti-MMP1 (Epitomics) og anti-PAR-1 (1:200) antistoffer (Santa Cruz), og næste skridt blev gjort i henhold til vejledningen i Vectastain®ABC kit (Vector Laboratories). Produkterne blev visualiseret ved diaminobenzidin (DAB) kits (Vector Laboratories). Konditionerede medier blev opnået fra kulturer af MKN-28 mavekræft cellelinjer og koncentreret hjælp VIVASPIN 6 (Sartorius ). De koncentrerede supernatanter i 6 × Foz puffer blev separeret på 10% SDS-geler indeholdende 1 mg /ml gelatine. Hver blev inkuberet i 100 ml zymografi reaktionsbuffer og farvet med Bio-Safe ™ coomassie G-250 (Bio-Rad Laboratories). Efter affarvning blev skarpe transparente bånd indikerer gelatinolytisk aktivitet visualiseret på en blå baggrund. For transfilter migration og invasion assay, vi brugte MKN-28 og SNU-638 celler. Cellerne blev transficeret med siRNA'er i 1 dag, isoleret og sat til de øvre kamre i pore indsætter Transwell med collagen type l (BD Bioscience) overtrukne filtre i migration assay, og matrigel (BD Bioscience) coatede filtre, for invasion assays. RPMI 1640 med 10% FBS og 1% antibiotika (Gibco) blev tilsat til det nederste kammer efterfulgt af inkubation i 20 timer. Migrering og invaderende celler blev kvantificeret efter H &E farvning. Hvert eksperiment blev udført i triplikat og data præsenteret som middelværdier. chromatin immunoprecipitation (chip) assays blev udført under anvendelse af en chip assay kit (Millipore). Prøver blev påført på retter efter galectin-3 siRNA behandling og assays blev udført efter producentens anvisninger. Anti-galectin-3, blev anti-c-Jun, anti-Fra-1 og normal mus /kanin IgG bruges til at immunpræcipitere DNA indeholder komplekser. Forud for PCR, blev primere fremstillet for AP-1 med PAR-1-promotor-bindingssteder -666 (5'-CACTGT CGACGTCTCCACAT-3 ') og PAR-1 promotorsted -307 (5'-GGGCCTAGAAGTCCAA ATGA-3'). PCR blev udført med en Ex Taq (Takara). En AP-1 luciferasereporterplasmid blev opnået fra Dr. Sung-Pil Yoon for National Cancer Center i Korea og undersøgelser af virkningerne af galectin-3 på AP-1 transkriptionsaktivitet i lacZ og galectin-3 over-udtrykkende celler blev udført i overensstemmelse med en tidligere rapport [2]. Efter 48 timer blev cellerne høstet og luciferaseaktiviteten blev målt ved anvendelse af et luciferase-assay-systemet (Promega) i overensstemmelse med producentens instruktioner. Hvert forsøg blev udført i tre eksemplarer og data præsenteret som middelværdier cellemigrationsassay hjælp af zebrafisk model transgene zebrafisk linje Tg (kdrl: EGFP). s843 Microarray blev udført i AGS, gastrisk kræft cellelinje efter silencing af galectin-3 som beskrevet tidligere [6]. Microarray resultater blev uploadet på GEO (GSE29630). Data blev præsenteret som gennemsnit ± SD fra mindst 5-10 billeder opnået fra tre uafhængige forsøg hjælp mikroskop (× 100, × 200), medmindre andet er angivet. Statistisk analyse blev udført ved envejs ANOVA test med Prism software. Dataene blev betragtet som signifikant, hvis s Støtte Information
mavekræft celle invasion. Disse undersøgelser viste, at: a) galectin-3 nedregulering formindsker ekspressionen af PAR-1. b) galectin-3 overekspression øger celle migration og invasion og denne stigning kan vendes ved PAR-1 nedregulering, hvilket indikerer, at galectin-3 øger cellemigration og invasion via PAR-1 opregulering. c) galectin-3 direkte interagerer med AP-1 transkriptionel faktor, og dette kompleks binder til PAR-1 promotor og driver PAR-1 transskription. d) galectin-3 forstærker også phospho-paxillin, et PAR-1 nedstrømsmål, ved at øge MMP-1-ekspression. MMP-1 dæmpende blokerer phospho-paxillin forstærkning og celleinvasion forårsaget af galectin-3 overekspression. e) Silencing enten galectin-3, PAR-1 eller MMP-1 signifikant reduceret celle migration til skibene i zebrafisk embryo model. f) galectin-3, PAR-1, og MMP-1 er højt udtrykt og co-lokaliseret i maligne væv fra mavecancerpatienter.
og in vivo
undersøgelser, vi brugte zebrafisk embryo model til bestemmelse af deres virkninger på migration og invasion af cancerceller med levende organeller. Vi har også bestemt ekspressionsniveauerne af galectin-3, PAR-1 og MMP-1 i maligne væv fra mavecancerpatienter til kliniske korrelationer mellem disse proteiner i humane prøver.
Resultater
< 0,001) (Figur 1C) og invaderende celler ( s
< 0,001) (Figur 1D), næsten det halve. Disse data viste, at galectin-3 forøget PAR-1-ekspression og både galectin-3 og PAR-1 moduleret mavekræft celle migration og invasion.
galectin-3 øger gastrisk kræft cellemigration /invasion ved at øge PAR-1 ekspression
< 0,001) aktiviteter (Figur 2C). Disse stigninger blev reduceret med PAR-1 lyddæmpning. Disse resultater antydede, at galectin-3 fremmet migration og invasion af gastriske kræftceller gennem opregulering af PAR-1.
galectin-3 fremmer PAR-1 transskription gennem interaktion med AP-1 kompleks
< 0,001) (Figur 2G). Den transkriptionelle aktivitet af AP-1 signifikant forøget i galectin-3 over-udtrykkende celler, men ikke i LacZ over-udtrykkende celler. Disse resultater antydede, at galectin-3 lettet binding af PAR-1-promotoren ved at interagere med AP-1-komplekset, og derved øge PAR-1 ekspression ved transkriptionel regulering.
galectin-3 øger ekspressionen af MMP-1 og aktiveringen af PAR-1-signalering
< 0,001) (figur 4B). Dette blev også bekræftet af, at overekspression af MMP-1 forøgede phosphorylering af paxillin, og at yderligere lyddæmpning af PAR-1 blokerede sådan phosphorylering (figur 4A). I MMP-1 overudtrykker celler, galectin-3 lyddæmpning reducerede ekspressionen af PAR-1, men ikke fra MMP-1, og også phosphorylering af paxillin og celle invasive potentiale (Figur 4A-B). Disse observationer antydede, at overekspression af MMP-1 forøgede cancercelle invasivitet ved aktivering af PAR-1-signalering. Taget alle sammen, foreslog disse resultater, at galectin-3 forøgede ekspression af både PAR-1 og MMP-1, og at den øgede MMP-1-ekspression aktiveret PAR-1-signalering, hvilket igen, lettet cancercelleinvasion. Disse begivenheder er skematisk vist i figur 4C.
Silencing af galecin-3, PAR-1 eller MMP-1 blokke mavekræft celle migration in vivo
i en zebrafisk model
[24], udtrykker EGFP specifikt i deres kar. De tilsvarende zebrafisk embryoner er gennemsigtige med grønne fluorescerende fartøjer. Vi anvendte disse fisk til at gennemføre in vivo Salg undersøgelser af human gastrisk cancer cell migration (figur 5A). Når den røde fluorescerende mærkede AGS-celler blev injiceret i blommesækken af zebrafisk embryoner ved 48 HPF (timer efter befrugtning), at størstedelen af transplanterede AGS celler blev placeret i centrum af blommesækken af embryonerne ved 4 timer efter transplantation ( HPT). Efter 26 HPT, både normale og scRNA transfekterede celler migreret ind i bagagerummet region, og boede i beholderen af stammen og /eller hale af embryonerne ved 50 HPT. Imidlertid er antallet af migrerede AGS celler, hvor hver af galectin-3, PAR-1 eller MMP-1 er bragt til tavshed, faldt betydeligt (figur 5B). Vi tælles også antallet af zebrafisk embryoner, der viser migrerende celler, og resultaterne er vist (figur S2). Eighty 4-93 procent af zebrafisk embryoner, der blev transplanteret med kontrol celler eller scRNA behandlede celler viste celler migrerer ind i deres kuffert og hale skibe på 50 HPT. Men kun 7 til 11% af embryoner, som blev transplanteret med celler, hvor galectin-3, PAR-1 eller MMP-1 blev stille, vises migrerende celler. Disse resultater viste, at første, zebrafisk embryo model kan anvendes til at overvåge migrationen af gastriske cancerceller som et levende dyr, og dels at silencing af hver af galectin-3, PAR-1 og MMP-1 forårsagede signifikant reduktion i mavekræft celle migration in vivo
.
Diskussion
) embryo model for studere migration og invasion af gastriske cancerceller er en særlig realisering af denne undersøgelse, fordi egnede dyremodeller ikke var tilgængelige for forskning i menneskers gastrisk cancer metastase indtil nu. Den zebrafisk model til at studere gensplejsede kræft og /eller tumorxenoplantater, har mange fordele, herunder muligheden for frem og bak genetiske analyser, gennemsigtighed af embryonerne [32], og egnethed til GFP mærkning af skibe [32], [33], [34]. Denne undersøgelse viste, at RFP mærkede gastriske kræftceller invaderet blodkar mens galectin-3, MMP-1 eller PAR-1 tavshed gastriske kræftceller ikke kunne. Således zebrafisk embryo synes at være en lovende model til at studere invasion og metastase af kræftceller, selv om yderligere undersøgelser er klart behov for at bekræfte dette fund.
Materialer og metoder
Cell Kultur og siRNA transfektioner
RNA-isolering og RT-PCR-analyse
Immunopræcipitation
Immunhistokemi
gelatinezymografi
Transfilter migration og invasion analyser
Chromatin immunopræcipitationsanalyser
luciferaseassays
[24], hvor EGFP udtrykkes specifikt i karrene, blev opretholdt i overensstemmelse med anerkendte standard operationelle procedurer [36] godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg på National Cancer center i Korea; tilladelsens nummer: NCC 11-116. Vi opnåede zebra-fisk embryoner fra national cancer center zebrafisk aqua-værelse. Cancercelle transplantation blev udført ifølge Nicoli et al [37] med små ændringer. Kort beskrevet blev dechorionated embryoner bedøvet med tricaine (Sigma) og cancerceller blev injiceret (150 til 200 pr embryo) ind centrene af embryonale blommesække ved 48 HPF (timer efter befrugtning) under anvendelse af en mikromanipulator (Narishige) og en pneumatisk Picopump (WPI ) udstyret med en borsilikatglas nål. Embryoner blev opretholdt efter transplantation procedurer og blev undersøgt for at migrere cancerceller ved fluorescensmikroskopi. For billeddannelse blev embryoner og larver behandlet med N-phenylthiourinstof (Sigma) fra 12 HPF at forhindre pigmentering og undersøgt med en fluorescerende omvendt mikroskop (Carl Zeiss) under epifluorescens optik. Fluorescerende billeder blev taget med et CCD-kamera (Carl Zeiss). Stabile fluorescerende gastrisk cellelinjer AGS (mRFP) blev genereret af Lenti-virus infektion med pLL3.7-mRFP efterfulgt af FACS sortering.
Microarray dataanalyse
Statistik analyse
. ≪ 0,05
Figur S1.
Lyddæmpet galectin-3 med siRNA i gastrisk kræftceller medført ændringer i celle motilitet relateret genekspression. A, Blandt DNA microarray analyse, valgte vi cellemotilitet relateret gen MMP-1, MMP-3, FSCN1 (Fascin-1), F2R (PAR-1), TIMP-2, SERPINE1 (PAI-1) og viste fold-change-forhold . B, Påvisning af mRNA-ekspression af MMP-1, MMP-3, FSCN1 (Fascin-1), F2R (PAR-1), TIMP-2, SERPINE1 (PAI-1) under anvendelse af PCR. β-actin blev anvendt som en normalisering kontrol
doi:. 10,1371 /journal.pone.0025103.s001
(TIF)
Figur S2.
Antallet af zebrafisk embryoner med migrerede celler ratio. Påvisning af gastrisk kræft celle AGS (RFP) numre efter transplanteret af AGS (RFP) i zebrafisk fisk embryo med behandling specifikt siRNA (galectin-3, MMP-1 og PAR-1) med negativ kontrol scRNA (figur 5A-B). Det viste antal migreret celle pr embyos blev talt og vist i procent
doi:. 10,1371 /journal.pone.0025103.s002
(TIF)
Figur S3.
RT-PCR-analyse af mRNA niveau af galectin-3, MMP-1 og PAR-1 i mavecancerpatienter.
Almindelig genetisk variant forklarer, hvorfor immunterapi ofte mislykkes ved Crohns sygdom
Forskere gør blod af type A til universel type O,
Forskere udvikler en tilgang til at vaccinere mod tarmbetændelse
Genetik kan påvirke sammensætningen af mikrobiomet mere end miljøfaktorer
Almindelig svamp, der findes på huden, kan forårsage inflammatorisk tarmsygdom
Gode nyheder for IBS -syge, da forskere identificerer "tarmkløe"
Matematisk model afslører risikoen for SARS-CoV-2-infektion efter fækal mikrobiotatransplantation
I deres nye papir tilgængeligt på bioRxiv* fortryksserver, Amerikanske forskere fra OpenBiome nonprofit-organisationen brugte en matematisk model til at simulere nytten af forskellige teststrategi
Råt foder til kæledyr er en risiko for mennesker og dyr
Forskere har fundet i en ny undersøgelse, at hunde og katte, der spiser råt kød, kan sprede antibiotikaresistente bakteriestammer til mennesker. Deres undersøgelse med titlen, “Råt kødbaseret kost til
Penis mikrobiom er reservoir for bakterielle vaginose-associerede bakterier
Blandt de seksuelt overførte infektioner (STIer), bakteriel vaginose påvirker mere end 20 procent af kvinderne over hele kloden. Tilstanden stammer fra spredning af visse bakterier i skeden. Tidlige