PLoS ONE: galektiini-3 Helpottaa soluliikkuvuus mahasyövän by Up säätelevä par-reseptori-1 (PAR-1) ja matriksimetalloproteinaasi-1 (MMP-1)

tiivistelmä

Background

galektiini-3: n tiedetään säädellä syövän etäpesäkkeiden. Kuitenkin taustalla olevaa mekanismia ei ole määritelty. Kautta DNA-siru tutkimusten jälkeen galektiini-3 hiljentäminen, osoitimme tässä, että galektiini-3: lla on keskeinen rooli ajan säätelemällä ilmaisuja par-reseptori-1 (PAR-1) ja matriksimetalloproteinaasi-1 (MMP-1) PAR-1 edistää näin mahasyövässä etäpesäke.

Menetelmät /Principal havainnot

tutki ekspressiotasot galektiini-3, PAR-1, ja MMP-1 mahasyövän potilaan kudosten ja myös vaikutukset hiljentäminen näiden proteiinien erityisiä siRNA: t ja yli-ilmentävien niitä käyttämällä erityistä lenti-virus- konstruktioita. Olemme myös työssä zebrafish alkio mallin analyysi in vivo
mahalaukun syöpäsoluinvaasiota. Nämä tutkimukset osoittivat, että: a) galektiini-3 hiljentäminen vähentää ilmentymistä PAR-1. b) galektiini-3 yli-ilmentyminen lisää solumigraation ja invaasion ja nousun voidaan kumota PAR-1 hiljentäminen, mikä osoittaa, että galektiini-3 lisää solumigraation ja invaasion kautta PAR-1 säätelyä ylöspäin. c) galektiini-3 suoraan vuorovaikutuksessa AP-1 transkriptiotekijän, ja tämän monimutkaisen sitoutuu PAR-1-promoottori ja ohjaa PAR-1 transkriptio. d) galektiini-3 myös vahvistaa fosfo-paksilliini, par-1 alavirran kohde, lisäämällä MMP-1 ilme. MMP-1 hiljentäminen lohkot fosfo-paksilliini vahvistusta ja solujen invaasiota aiheuttamat galektiini-3 yli-ilmentyminen. e) hiljentäminen joko galektiini-3, PAR-1 tai MMP-1 vähensi merkittävästi solujen kulkeutuminen alusten seeprakala alkion malli. f) galektiini-3, PAR-1, ja MMP-1 ilmentyy voimakkaasti ja yhteistyötä lokalisoitu pahanlaatuinen kudoksissa mahasyöpäpotilaista.

Johtopäätökset /merkitys

galektiini-3 ovat keskeisessä rooli aktivoimalla solun pinnan reseptorin kautta proteaasin tuotantoa ja boosteja mahasyövän etäpesäke. Galektiini-3 on potentiaalia olla hyödyllinen farmakologinen kohde ehkäisyyn mahasyövän etäpesäkkeiden.

Citation: Kim S-J, Shin J-Y, Lee K-D, Bae Y-K, Choi I-J, Park SH, et al. (2011) galektiini-3 Helpottaa soluliikkuvuus mahasyövän by Up säätelevä par-reseptori-1 (PAR-1) ja matriksimetalloproteinaasi-1 (MMP-1). PLoS ONE 6 (9): e25103. doi: 10,1371 /journal.pone.0025103

Editor: Jean-Marc Vanacker, Institut de Génomique Fonctionnelle de Lyon, Ranska

vastaanotettu: toukokuu 18, 2011; Hyväksytty: 23 elokuu 2011; Julkaistu: 22 syyskuu 2011

Copyright: © 2011 Kim et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat National Cancer Center (NCC) ja Korean tasavallan avustus (NCC-0910150 ja NCC-0810060), Innovative Research Institute for Cell Therapy, Korean tasavalta (A062260) ja tämä tutkimus tukee Basic442 Science Research Program kautta National Research Foundation (NRF) rahoittama opetus-, Science and Technology (1031790-1), Korean tasavalta. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

syövät, jotka leviävät (etäispesäkkeitä) alkuperäisestä sivustosta toiseen alueen elin, kutsutaan metastaattisen syöpiä. metastaattinen syövät ovat huonon ennusteen ja korkea kuolleisuus [1]. Täyden tietoa biologisista mekanismi (t) mukana etäpesäke ja järkevä lähestymistapoja ehkäisemisessä tai etäpesäke voi johtaa käytännön lähestymistapoja parantaa eloonjäämisaste kärsivien potilaiden metastaattista syöpiä. Aiemmissa tutkimuksissa, huomasimme, että galektiini-3 lisääntyy mahasyövän soluliikkuvuus jopa säätelevä fascin-1, joka on aktiini-niputtaminen tukirangan proteiini [2]. Galektiini-3 on 31 kDa: n hiilihydraatteja tunnustamista proteiinia, kasvaimien syntyyn liittyvien, syöpäsolujen kasvun ja etäpesäkkeiden [3], [4], [5] ja sen korkea ekspressio useissa ihmisen syövissä on todettu korreloivan huono ennuste metastaattinen syövät.

selkeyttämiseksi roolia galektiini-3 syövän etäpesäkkeiden, koputimme alas ilmaisunsa mahasyövän soluissa käyttämällä siRNA ja tutki tulokset geeniekspressiossa DNA mikrosiruanalyysillä [6]. Niistä edellinen tuloksia, löysimme merkittävä väheneminen tason par-reseptori-1 (PAR-1), joka on perheenjäsen transmembraanisten G-proteiiniin kytkettyjen reseptorien [7], ja sen aktivaattori, matriisi--1 ( MMP-1) (kuvio S1). Lohkaistaan ​​PAR-1 on automaattinen fosforyloituu ja transduktio solunulkoisen signaali (t) kautta eri reittejä pitkin, ja on keskeisessä asemassa tuumorimetastaasissa [7], [8], [9]. Yli-ilmentyminen PAR-1: n on raportoitu useissa syövissä, mukaan lukien melanoomat, rinta- ja syöpien. MMP-1 on myös säädellään ylöspäin monenlaisia ​​kehittyneitä syöpiä, ja merkittävä negatiivinen korrelaatio on havaittu sen ilmaisun ja potilaan eloonjääminen [10], [11], [12], [13]. Myös useissa tutkimuksissa havaittu, että MMP-1: lla on keskeinen rooli etäpesäke rintasyövän [14], maksan ja paksusuolen syöpiin [15], ja syöpien [16], [17], muiden muassa. Vaikuttaa siltä, ​​että kun erittyy, MMP-1 edistää syöpäsolujen invaasiota hajoamisen kautta ekstrasellulaaristen matriisien ja /tai limakalvon alaista kerrosta imukudoksen [10], [14]. Lukuisat tutkimukset ovat osoittaneet, että inhibitio MMP johtaa inhibitioon soluinvaasion [18], [19].

hese havainnot johtivat meidät oletuksen, että galektiini-3, PAR-1 ja MMP-1 voi olla osallisena parantamalla muuttoliike ja hyökkäys mahasyövän. Tämän hypoteesin testaamiseksi teimme tutkimuksia niiden roolia mahalaukun syöpäsoluja. Molemmissa in vitro
ja in vivo
tutkimuksissa käytimme seeprakala alkion määrittämiskaavion niiden vaikutukset maahanmuutosta ja invaasion syöpäsolujen kanssa elävä organelles. Olemme myös päättäneet ilmentymisen tasojen galektiini-3, PAR-1 ja MMP-1 in pahanlaatuinen kudoksissa mahasyöpäpotilaista kliinisiin korrelaatiot näiden proteiinien ihmisen yksilöitä.

Tulokset

Äänenvaimennus galektiini -3 tai PAR-1 vähentää maahanmuuttoa ja hyökkäys ihmisen mahalaukun syöpäsolujen

ekspressiotasot galektiini-3 ja PAR-1 olivat korkeat useimmissa mahasyövässä solulinjoissa. Me vaiennetaan galektiini-3 ja PAR-1 in MKN-28 solujen työllistää kunkin siRNA: t. Hoito galektiini-3 siRNA vähentynyt ekspressiotasoja sekä galektiini-3 ja PAR-1, kun taas PAR-1 siRNA hoito laski vain PAR-1 ilmentymisen aikana ei havaittu eroja galektiini-3 (kuvio 1A). Transfektio SNU-638 soluja, jotka alun perin niissä ole ilmentymistä galektiini-3, jossa galektiini-3-koodaus plasmidin lisännyt ilmentyminen sekä PAR-1 ja galektiini-3 (kuvio 1 B). Hiljentäminen joko galektiini-3 tai PAR-1 vähensi kokonaismäärät muuttavia ( p
< 0,001) (kuvio 1 C) ja tunkeutuvat soluihin ( p
< 0,001) (kuvio 1 D), lähes puoleen. Nämä tulokset osoittivat, että galektiini-3 kasvoi PAR-1 ilmentymisen ja molemmat galektiini-3 ja PAR-1 moduloidun mahasyövässä solujen vaeltamiseen ja invaasiota.

galektiini-3 parantaa mahasyövän solumigraation /invaasiota lisäämällä PAR-1 ilmaisu

tutkinut suhdetta galektiini-3-indusoimaa kasvua solumigraatioon ja invaasion toisaalta ja PAR-1 ilmentymisen toisaalta. Me tartunnan SNU638 solut lentivirus sisältävä galektiini-3 ekspressiokasetin, ja tutki ilmaisuja galektiini-3 ja PAR-1, ja mitatun solujen vaeltamiseen. Huomasimme, että yli-ilmentyminen galektiini-3 oli mukana lisääntynyt PAR-1-mRNA ja proteiini ilmauksia (kuvio 2A), sekä solujen vaeltamiseen ( p
< 0,001) (kuvio 2B) ja solujen invaasiota ( p
< 0,001) toiminta (kuvio 2C). Nämä korotukset vähenivät PAR-1 hiljentäminen. Nämä tulokset viittaavat siihen, galektiini-3 edisti muuttoliike ja invaasion mahasyövän soluihin säätely ylöspäin PAR-1.

galektiini-3 edistää PAR-1 transkriptio vuorovaikutuksessa AP-1 kompleksin

jälkeen olemme yrittäneet valaista miten galektiini-3 säätelee PAR-1 ilme. Koska todettiin, että AP-1 transkriptionaalista aktiivisuutta säätelee galektiini-3 [20], olemme keskittyneet roolista tämän transkriptiotekijän tässä suhteessa (kuvio 2D). Suoritimme immunosaostus tutkimukset ja todennut, että galektiini-3 suoraan vuorovaikutuksessa sekä Fra-1 ja c-Jun in AP-1 monimutkainen, ja että tämä vuorovaikutus liittyi säätely ylöspäin AP-1 transkriptionaalisen aktiivisuuden (kuvio 2E). Seuraavaksi tutkimme DNA: ta sitovaa aktiivisuutta AP-1 kanssa ja ilman galektiini-3 Chip määritykset (kuvio 2F). Olemme havainneet, että AP-1-kompleksin sidottu promoottori PAR-1: n läsnä ollessa galektiini-3, mutta ei sen puuttuessa. Olemme myös arvioitiin transkriptionaalista aktiivisuutta AP-1 lusiferaasianalyysissä transfektion jälkeen reportteriplasmidi sisälsi AP-1 sitova sekvenssi edessä lusiferaasi-ajo minimaalinen promoottori LacZ tai galektiini-3 yli-ilmentävät SNU-638-solut ( p
< 0,001) (kuvio 2G). Transkriptionaalista aktiivisuutta AP-1 kasvoi merkittävästi galektiini-3 yli-ilmentävien solujen, mutta ei LacZ yli-ilmentäviä soluja. Nämä tulokset viittaavat siihen, että galektiini-3 helpotti sitoutumisen PAR-1-promoottorin kanssa vuorovaikutuksessa AP-1 monimutkainen, mikä lisää PAR-1 ilmentymisen transkription säätelyyn.

galektiini-3 lisää MMP-1 ja aktivointi PAR-1 signalointi

MMP-1: n on raportoitu säädellä PAR-1 aktivointi pilkkomalla PAR-1 ankkuroitu solunsisäinen signalointi, ja vaikuttaa solujen invaasiota [21]. Kuten esitetään kuviossa S1, osoitimme, että galektiini-3 säädellään MMP-1 ilmentymisen. Näin ollen, olemme vahvistaneet keskinäiset galektiini-3, MMP-1 ja PAR-1. Analysoimme mRNA: n ilmentymisen MMP-9, joka on alavirrassa oleva kohde on PAR-1 [8], kun hiljentäminen galektiini-3, MMP-1 ja PAR-1 yksin (kuvio 3A). Kun taas galektiini-3 hiljentäminen vähensi ilmaus kaikkien kolmen molekyylin (MMP-1, PAR-1 ja MMP-9), MMP-1 hiljentäminen alentaa vain MMP-9 ilmentymisen eikä suhteessa galektiini-3 tai PAR-1. Mielenkiintoista, PAR-1 hiljentäminen tuotti samat vaikutukset kuin MMP-1 hiljentäminen. Olemme myös havainneet fosforylaation tukirankaproteiinin proteiinin paksilliini (pY181), tunnusmerkki PAR-1 aktivaatio [22], [23]. Sen jälkeen hiljentäminen galektiini-3, MMP-1 ja PAR-1 erikseen, phosphorylaion on paksilliini pienennettiin, mikä viittasi galektiini-3 säädellään myös PAR-1 aktiivisuutta. Olemme myös tarkistaa vähentää MMP-9: n aktiivisuutta, kun hiljentäminen ja galektiini-3, MMP-1 ja PAR-1 yksin (kuvio 3A).

galektiini-3 yli-ilmentävät SNU638 solut osoittivat lisääntynyttä ilmentymistä MMP -1 ja PAR-1-proteiinia sekä niiden mRNA: iden lisäksi fosforyloidun paksilliini (pY181). Näissä soluissa MMP-1 hiljentäminen vähentää fosforylaation paksilliini muuttamatta ilmentymisen galektiini-3 tai PAR-1 (kuvio 3B). Lisäksi MMP-1 hiljentäminen vähennetään soluinvaasiota, joka laukaisee galektiini-3 over-ilmentyminen ( p
< 0,001) (kuvio 3C), mikä tarkoittaa, että galektiini-3 lisäsi MMP-1 ilmentymisen johtaa aktivointi PAR-1 signalointi.

Yli-MMP-1 syöpäsoluissa lisää soluinvaasiota aktivoitumisen kautta PAR-1 signalointi

vahvisti, että säätely ylöspäin MMP-1 by galektiini-3 on tärkeä aktivointi PAR-1 signalointi ja lisääntynyt mahalaukun syöpäsolujen invaasiota. Lentiviruksesta (pLECE3 Vector), joka sisälsi MMP-1-ekspressiokasetin säätelee CMV-promoottori, valmistettiin ja tartunnan AGS mahasyövän soluja (kuvio 4A-B). Kuten odotettua, MMP-1 yli-ilmentymisen lisäsi hyökkäyksen mahdollisuudet mahasyövän soluja, ja PAR-1 hiljentäminen merkittävästi käänteinen tämä kasvu ( p
< 0,001) (kuvio 4B). Tämä vahvisti myös, että yli-ilmentyminen MMP-1 lisäsi fosforylaatiota paksilliinin, ja että lisää hiljentäminen PAR-1 esti fosforylaatiota (kuvio 4A). MMP-1 yli-ilmentävät solut, galektiini-3 hiljentäminen vähensi ilmentymistä PAR-1, mutta ei MMP-1, ja myös fosforylaatiota paksilliinin ja solujen invasiivinen mahdollisia (kuvio 4A-B). Nämä havainnot viittaavat siihen, että yli-ilmentyminen MMP-1 kasvoi syöpäsolun invasivity aktivoimalla PAR-1-signalointia. Toteuttanut kaikki yhdessä, nämä tulokset viittaavat siihen, että galektiini-3 lisäsi ilmentymistä sekä PAR-1 ja MMP-1, ja että lisääntynyt MMP-1 ilmentymisen aktivoitu PAR-1 signalointia, mikä puolestaan ​​helpottaa syöpäsoluinvaasiota. Nämä tapahtumat ovat kaavamaisesti kuviossa 4C.

vaiennettu galecin-3, PAR-1 tai MMP-1 estää mahalaukun syövän solujen vaeltamiseen in vivo
on zebrafish malli

Siirtogeeniset seeprakala, Tg (kdrl: EGFP) ^{s843
[24], ilmaista EGFP erityisesti niiden verisuonistossa. Vastaavat Seeprakala alkiot ovat avoimia kanssa vihreä fluoresoiva aluksilla. Käytimme nämä kalat tehdä in vivo
tutkimuksissa ihmisen mahasyövän solujen vaeltamiseen (kuvio 5A). Kun punainen fluoresoivasti leimattuja AGS solut ruiskutetaan ruskuaispussista että zebrafish alkioiden 48 HPF (tuntia lannoitus), suurin osa siirrettyjen AGS soluja sijaitsee keskellä ruskuaispussista alkioiden 4 tuntia siirron jälkeen ( HPT). 26. HPT, sekä normaali ja scRNA transfektoidut solut muuttivat runko alueelle, ja asunut aluksen runko ja /tai pyrstö alkioiden 50 HPT. Kuitenkin, määrä siirtynyt AGS soluja, joissa kukin galektiini-3, PAR-1 tai MMP-1 on vaimennettu, laski merkittävästi (kuvio 5B). Olemme myös laskea määrän zebrafish alkioita, jotka näyttävät vaeltavien solujen ja tulokset esitetään (kuva S2). Kahdeksankymmentä neljä-yhdeksänkymmentäkolme prosenttia zebrafish alkioita, jotka oli siirretty säätökennoja tai scRNA käsitellyt solut näytetään solujen kulkeutuminen niiden runko ja pyrstö alukset 50 HPT. Kuitenkin vain 7-11% alkioiden, jotka siirrettiin yhdessä soluja, joissa galektiini-3, PAR-1 tai MMP-1 hiljennettiin, näyttöön vaeltavat soluja. Nämä havainnot ehdotti, että ensinnäkin seeprakala alkio mallia voidaan käyttää valvomaan siirtymistä mahasyövän solujen elävä eläin, ja toiseksi, että hiljentäminen jokaisen galektiini-3, PAR-1 ja MMP-1 aiheutti merkittävä väheneminen mahasyöpä solumigraation in vivo
.}

ilmaisujen galektiini-3, PAR-1 ja MMP-1 ovat koholla, rinnakkain, että pahanlaatuinen kudosten mahasyöpäpotilaista

määritetty mRNA ja proteiini ekspressiotasot galektiini-3, PAR-1 ja MMP-1 normaaleissa ja pahanlaatuisia kudoksia 20 mahasyöpäpotilaista, käytettiin sitten RT-PCR käyttämällä kuvan J analysaattori. Kuten kuviossa 5C ja kuviossa S3, 73,7% syöpäpotilaiden osoittivat korkeampia ekspressiotasoja galektiini-3 ja 70% heistä osoitti korkeamman PAR-1 ja MMP-1-tasot niiden pahanlaatuisten kudosten kuin niiden normaalissa kanssa. Lisäksi joukossa galektiini-3 positiiviset potilaat, 71,4% oli myös PAR-1 positiivisia, kun taas 64,3% oli myös MMP-1 positiivisia (kuvio 5D). Nämä tulokset osoittivat, että on olemassa rinnakkainen lisääntyminen ilmentymisen galektiini-3 sekä PAR-1 ja MMP-1, että pahanlaatuinen mahalaukun kudoksiin. Olemme myös havainneet, että nämä proteiinit yhteistyössä lokalisoitu pahanlaatuinen alueilla kudoksia, eikä ei-pahanlaatuinen alueilla (kuvio 5C). Galektiini-3 oli läsnä sekä sytosoliin ja ytimen, kun taas PAR-1 ja MMP-1 nähtiin yleensä sytosolissa ja kalvo samalla alueella (kuvio 5C). Nämä havainnot ehdotti, että molemmat PAR-1 ja MMP-1 ilmaisuja korreloi merkitsevästi galctin-3 ilmentymisen mahasyöpäpotilaista.

Keskustelu

Tämä tutkimus osoitti, että galektiini-3 parannettu mahasyövän solujen vaeltamiseen ja hyökkäys. Mekanistisesti tämä liittyy galektiini-3 säätely ylöspäin PAR-1 solun pinnan reseptoriin, ja aktiivisuus MMP-1 proteaasin. Tämä on yhtäpitävä raportteja, joissa osoitetaan korrelaatio ilmaus PAR-1 ja kasvainten invaasio ja etäpesäkkeiden mahalaukun ja useita muita syöpiä [25], [26], [27]. Tämä tutkimus on ensimmäinen, joka osoittaa suoraa vuorovaikutusta galektiini-3 ja AP-1 monimutkaisia ​​osia, c-Jun ja Fra-1, ja sääntely PAR-1 ilmentymisen AP-1 transkriptiotekijän. Koska on jo osoitettu muille, että yli-ilmentyminen Fra-1 edistää syöpäsolujen invaasiota ja etäpesäkkeiden [28], säätely ylöspäin PAR-1 c-Jun ja Fra-1 näytti olevan mahdollinen mekanismi selittää nostolaitteen of galektiini-3 indusoi säätely ylöspäin PAR-1 solun pinnan reseptoriin, ja aktiivisuus MMP-1 proteaasin. Tätä mahdollisuutta tukee meidän havainto rinnakkain ja yhteistyössä lokalisoitu ilmauksia galektiini-3 ja PAR-1 in pahanlaatuinen kudoksissa mahasyöpäpotilaista.

Se on uusi havainto, että galektiini-3 kasvaa MMP-1 ilmentymisen . On selvää, että yli-MMP-1 voi lisätä mahalaukun syöpäsoluinvaasiota aktiivisuutta estämällä solusta soluun ja solun matriisi vuorovaikutusten ECM hajoamista. Siksi kasvu MMP-1 ilmentymisen edistetään galektiini-3 voi olla kaksi vaikutuksia, nimittäin, PAR-1 aktivointi ja ECM hajoamista, ja molemmat ovat kriittisiä mahasyövän etäpesäke. Kuitenkin miten galektiini-3 säätelee MMP-1 ilme on vielä epäselvä, koska MMP-1 säätelee useita monimutkaisia ​​tapahtumia, kuten rajat talk useiden transkriptiotekijöitä, kuten AP-1, signaali anturin ja aktivaattori transkriptio-3, MAP-kinaasin, ja hypoksia-indusoituva tekijä-1 in hypoksia [29], [30], [31].

perustaminen zebrafish ( Danio rerio
) alkio malli tutkimalla muuttoliikkeen ja invaasion mahalaukun syöpäsolujen on erityinen saavutus tämän tutkimuksen, koska sopivia eläinmalleja puuttuivat tutkimalla ihmisen mahasyövän etäpesäkkeiden asti. Seeprakala malli tutkia geneettisesti syöpien ja /tai tuumoriksenografteissa, on monia etuja, kuten toteutettavuus eteen ja taakse geneettisiä analyysejä, läpinäkyvyys alkioiden [32], ja soveltuvuus GFP merkintöjä alusten [32], [33], [34]. Tämä tutkimus osoitti, että RFP merkitty mahalaukun syöpäsolut tunkeutuneet verisuonia, kun taas galektiini-3, MMP-1 tai PAR-1 vaiennetaan mahalaukun syöpäsolut voinut. Siten seeprakala alkio näyttää olevan lupaava malli opiskeluun ja metastaasit syöpäsolujen, vaikka lisätutkimuksia tarvitaan selvästi vahvistaa tämän toteamuksen.

Yhteenvetona tutkimuksemme osoittivat, että galektiini-3 kiihtyi mahasyövän soluliikkuvuus jopa säätelevä of PAR-1 ja MMP-1. Lisätutkimuksia tarvitaan selvästi luomaan roolin galektiini-3 syövän etäpesäkkeiden ja soveltuvuutta terapeuttisena kohteena valittujen syöpien.

Materiaalit ja menetelmät

Kudokset

Parit 2 mm kokoinen koepalanäytteistä saatiin mahalaukun adenokarsinooman kudoksista 20 potilaalla, joille diagnostisia tähystys ja endoskooppinen limakalvon alaista leikkely, National cancer center Koreassa, saatuaan kirjalliset tietoon perustuva suostumus. Kudosnäytteet jäädytettiin nestetypessä -70 ° C: ssa heti sen jälkeen, kun koepala ennen käyttöä. Osa kudosnäytteet paraffindized immunohistokemiallista tutkimuksia, tarpeen mukaan. Nämä tutkimukset hyväksyi Institutional Review Board of National Cancer Center (# NCCNSH 03-024).

Soluviljely ja siRNA transfektoinneilla

Kohtuullisen eriytetty ihmisen mahalaukun adenokarsinooman solulinjoja, AGS, MKN- 28 ja SNU-638 saatiin Korea Cell Line Bank ja ylläpidetään kuten aiemmin on kuvattu [35]. siRNA käytetään transfektioihin, olivat kaikki tarjoamat Invitrogen (Carlsbad, CA). Niiden sekvenssit ovat galektiini-3 (LGAL3) siRNA; 5'-AUAUGAAGCACUGGUGAGGUCUAUG-3 ', PAR-1 siRNA; 5'-CCCAUCUGUGUACACCGGAGUGUUU-3 ', ja MMP-1 siRNA; 5'-GGAGAAAUAGUGGCCCAGUGGUUGA-3 '. Transfektiot suoritettiin käyttäen Lipofectamine RNAiMAX reagenssia (Invitrogen) seuraten valmistajan ohjeita. Induktio ohimenevä galektiini-3 yliekspressio SNU-638-solut saatiin aikaan käyttämällä pcDNA3.1 /NT-galektiini-3 pcDNA3.1 /NT-GFP. Normalisoinnin kontrollikäsittely, mahalaukun syövän solulinjat käsiteltiin 1 ug mukaan LTX reagenssit (Invitrogen).

RNA: n eristys ja RT-PCR-analyysi

Kokonais-RNA eristettiin ihmisen mahalaukun syöpäsolujen ja potilaan kudosnäytteistä käyttämällä TRIzol-reagenssia (Invitrogen) seuraten valmistajan ohjeita. Käänteistranskriptaasi-PCR suoritettiin käyttäen Reverse Transcription (Promega Corp. USA), seuraten valmistajan ohjeita. Alukkeet käytettiin: 5'-ATGGCAGACAATTTTTCGCTCC-3 '(sense) ja 5'-ATGTCACCAGAAATTCCCAGTT-3' (anti-sense) ihmisen LGAL3 (galektiini-3) geeni; 5'-CCAAAACTGAGCATAAGTCC-3 '(sense) ja 5'-AGGATGGAGCAAATGTAGTG-3' (anti-sense) ihmisen F2R (PAR-1) geenin; 5'-ACAGCTTCCCAGCGACTCTA-3 '(sense) ja 5'-CAGGGTTTCAGCATCTGGTT-3' (anti-sense) ja ihmisen MMP-1-geeni; 5'-CTCGAACTTTGACAGCGACA-3 '(sense) ja 5'-GCCATTCACGTCGTCCTTAT-3' (anti-sense) ja humaani-MMP-9-geenin; 5'-AGCCTCGCCTTTGCCGA-3 '(sense) ja 5'-CTGGTGCCTGGGGCG-3' (anti-sense) ihmisen β-aktiini-geenin; 5'-GGCTGCTTTTAACTCTGGTA-3 '(sense) ja 5'-ACTTGATTTTGGAGGGATCT-3' (anti-sense) ihmisen glyseraldehydi 3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH). PCR suoritettiin 20 ul: n tilavuudessa käyttäen Ex Taq (Takara). Vahvistus sykliä (denaturaatio 95 ° C 1 min, pariutuminen 60 ° C: ssa 1 minuutin ajan ja pidennys 72 ° C ° C: ssa 2 min ajan) toistettiin 32 kertaa, jota seuraa lopullinen laajennus 10 minuutin ajan 72 ° C: ssa.

rakentaminen galektiini-3 ilmentävien lenti-virusvektoria ja infektion

täysimittaista ihmisen galektiini-3 ilmentävät rakentaa pcDNA3.1-NT-GFP-gal3, pcDNA3.1-NT-GFP-vektorilla, ja lenti-virusvektori yli-express LacZ, galektiini-3 (1-250) in pLL3.7 on aiemmin kuvattu [2]. Ihmisen F2R kloonattiin pLECE3 in BamH1- ja Not1 restriktioentsyymikohdat, luo pLECE3-F2R (PAR-1) rakentamiseksi. Täyspitkä cDNA: t F2R, MMP-1, ja ohjaus MRFP käytettiin PCR-monistuksen, yhdessä alukkeiden lueteltujen Data S1, ja tuloksena PCR-fragmentit kloonattiin pLECE3 vektoriin käyttäen Pac1 ja Hpa1 restriktioentsyymikohdat, luoda pLECE3 -MMP-1-rakenne. Myös MRFP sivusto pGEM-T-Easy-vektori siirrettiin sen pLL3.7 vektori korvaa GFP alueella käyttäen AGE1 ja EcoR1 restriktioentsyymikohtia, jotta pLL3.7-MRFP. Lenti-virusvektori tuotanto on kuvattu aiemmin [2].

Western blot-analyysi

Solulysaatti uutteet valmistettiin RIPA-puskurilla (1% NP-40; 0,1% natriumdodekyylisulfaattia, 0,5 % desoksykolaatti; 150 mM NaCl; 50 mM Tris, pH 7,5) ja proteaasi inhibiter cocktail. 20 ug kokonaisproteiinia kutakin lysaattia ratkaistiin 8-12% SDS PAGE-geeleissä ja elektro-siirrettiin PVDF kalvo, ja sitten tukossa 5% rasvatonta maitoa 0,05% Tween-20, 1 x PBS (PBST). Polyklonaalisia primaarisilla vasta-aineilla, anti-galektiini-3, anti-ThrombinR (PAR-1), anti-c-Jun, anti-Fra-1 ja anti-β-aktiini (Santa Cruz), anti-MMP-1 (Calbiochem), anti- paksilliinin ja anti-fosfo paksilliini (pY181) (Epitomics) inkuboitiin blotissa 1:1000 laimennoksena minimaalinen tilavuus on 5% BSA: ta (naudan seerumin albumiini) PBST-puskurissa 1 tunti huoneenlämpötilassa tai yön yli 4 ° C: ssa. Anti-hiiri- tai anti-kani-vuohi-HRP-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineita (GE Healthcare UK Limited) inkuboitiin 1:5000 laimennoksena 5% BSA: ta PBST-puskurissa 1,5 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Kiinnostavia proteiineja havaittiin tehostetulla kemiluminesenssilla (ECL) (Amersham Corp, Arlington Heights, IL, USA).

immunosaostus

Solulysaatti uutteet valmistettiin IP + puskuria (20 mM Hepes, 1 % Triton X-100, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 100 mM NaF: ää, 10 mM natriumpyrofosfaatti, 1 mM natriumortovanadaattia, 0,2 mM PMSF, 10 ug /ml proteaasiestäjäseostabletit) jäissä 30 minuuttia. Sen jälkeen, kun raivaus- sentrifugoimalla (13200 rpm 4 ° C: ssa 20 min), supernatantit altistettiin preclearing askel proteiini A /G--agaroosihelmiä 4 ° C: ssa 30 min rotaattorin. Supernatantit saadaan, kun lyhyen sentrifugoimalla (2000 rpm 4 ° C: ssa 4 min) suoritettiin immunosaostus käyttäen anti-galectin3 ja normaali hiiri-IgG (negatiivinen kontrolli). Immunosaostumat pestiin kahdesti IP-puskurissa (20 mM Hepes, 1% Triton X-100, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 100 mM NaF: ää, 10 mM natriumpyrofosfaatti). 30 ui 2 x SDS-näytepuskuria Lisäksi, sen jälkeen, joka kiehui 95 ° C: ssa 5 min. Jälkeen supernatantit on saatu sen jälkeen, kun lyhyen sentrifugoinnin, niiden proteiinin ilmentymisen tasot määritettiin Western blot-analyysi suoritettiin.

immunohistokemia

galektiini-3 ja PAR-1 immunohistokemia, parafiini poistettiin mahasyöpäpotilaista kudosleikkeiden jätettiin mikroaaltouunissa 15 minuutin ajan sitraattipuskurissa (Vector laboratories), ja inkuboitiin sitten 3% H _{2O 2 15 min endogeenisen peroksidaasin salpaamiseksi, jota seuraa inkubaatio 10% normaalia vuohen seerumia (Vector laboratoriot) 1 x PBS: ssä 10 min. Ensisijainen vasta-aineita käytettiin anti-galektiini-3 (1:200) anti-MMP-1 (Epitomics) ja anti-PAR-1 (1:200) vasta-aineita (Santa Cruz), ja seuraava vaihe suoritettiin ohjeiden mukaisesti Vectastain®ABC kit (Vector Laboratories). Tuotteet visualisoitiin diaminobentsidiiniä (DAB) sarjat (Vector laboratories).}

gelatiinitsymografialla

väliaine saatiin viljelmistä MKN-28 mahasyövän solulinjoissa ja konsentroitiin käyttämällä VIVASPIN-6 (Sartorius ). Konsentroitu supernatantteja 6 x Foz puskuria erotettiin 10% SDS-geeleissä, jotka sisältävät 1 mg /ml gelatiinia. Jokainen inkuboitiin 100 ml: zymografian reaktiopuskuria ja värjättiin Bio-safe ™ Coomassie G-250 (Bio-Rad Laboratories). Sen jälkeen poistamalla väri, terävä läpinäkyvä bändejä osoittaa Gelatinolyyttinen aktiivisuutta visualisoitiin sinisellä pohjalla.

Transfilter maahanmuutto- ja invaasion määritykset

transfilter muuttoliike ja invaasiomääritys, käytimme MKN-28 ja SNU-638 solut. Solut transfektoitiin siRNA 1 päivän eristetty ja lisätään yläkammiot huokosten insertit Transwell kollageeni tyyppi l (BD biotieteiden) päällystetty suodattimia migraatiokokeessa, ja matrigeelin (BD biotieteiden) päällystetty suodattimia varten invaasio määrityksiä. RPMI 1640, jossa oli 10% FBS: ää ja 1% antibiooteilla (Gibco) lisättiin alempaan kammioon seurasi inkubointi 20 tunnin ajan. Siirtyminen ja tunkeutuvat solut kvantifioitiin jälkeen H &E-värjäystä. Kukin koe suoritettiin kolmena kappaleena ja tiedot esitetään keskiarvoina.

Kromatiini immunosaostusmäärityksissä

Kromatiini immunosaostuksella (ChIP) analyysit suoritettiin käyttämällä ChIP määrityskittiä (Millipore). Näytteet levitettiin ruokia jälkeen galektiini-3 siRNA hoidon ja määritykset suoritettiin noudattaen valmistajan ohjeita. Anti-galektiini-3, anti-c-Jun, anti-Fra-1 ja normaali hiiri /kaniinin IgG käytettiin immunosaostamaan sisältävä DNA komplekseja. Ennen PCR-alukkeet valmistettiin AP-1 PAR-1-promoottori sitoutumiskohtia -666 (5'-CACTGT CGACGTCTCCACAT-3 ') ja PAR-1-promoottori päällä -307 (5'-GGGCCTAGAAGTCCAA ATGA-3'). PCR suoritettiin Ex Taq (Takara).

Lusiferaasimäärityksiä

AP-1 lusiferaasireportteriplasmidin saatiin tri Sung-Pil Yoon National Cancer Center Koreassa ja tutkimuksissa vaikutuksista galektiini-3 AP-1 transkriptionaalista aktiivisuutta lacZ ja galektiini-3 yli-ilmentäviä soluja mukaisesti tehty aiemman raportin [2]. 48 tunnin jälkeen solut kerättiin ja lusiferaasiaktiivisuus mitattiin käyttämällä lusiferaasin määritystä (Promega) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kukin koe suoritettiin kolmena kappaleena ja tiedot esitetään keskiarvoina.

Solun migraatiokokeessa käyttäen zebrafish mallia

siirtogeenisiä Seeprakala linja Tg (kdrl: EGFP) ^{s843
[24], jossa EGFP on erityisesti ilmaistu verisuonistossa, pidettiin mukaisesti hyväksyttyjen toimintaohjeistojaan [36] hyväksymän Institutional Animal Care ja käyttö komitea National Cancer Center Koreassa; luvan numero: NCC 11-116. Saimme seepra-kala alkioita kansallisista syövän keskustasta zebrafish Aqua-huone. Syöpäsolun transplantaatio suoritettiin Nicoli et ai [37] pienin muutoksin. Lyhyesti, dechorionated alkioiden nukutettiin tricaine (Sigma) ja syöpäsolujen injektoitiin (150-200 alkiota kohden) osaksi keskuksia alkion keltuaisen pusseja 48 hpf (tunnin kuluttua hedelmöityksestä) käyttäen mikromanipulaattoria (Narishige) ja pneumaattinen Picopump (WPI ) varustettu borosilikaattilasista neula. Alkiot säilyivät siirron jälkeen menettelyjä ja tutkittiin vaeltavien syöpäsolujen fluoresenssimikroskopialla. Kuvantaminen, alkiot ja toukat käsiteltiin N-fenyylitioureaa (Sigma) 12 HPF estää pigmentin ja tutkittiin fluoresoivalla käänteismikroskooppi (Carl Zeiss) alla epifluoresenssilla optiikka. Fluoresenssikuvia otettiin kiinni CCD-kameraan (Carl Zeiss). Vakaa loisteputki mahalaukun solulinjoja AGS (MRFP) tuotettiin lenti-virusinfektion kanssa pLL3.7-MRFP seuraa FACS lajittelua.}

Microarray data-analyysi

Microarray suoritettiin AGS, mahasyövän solulinja jälkeen hiljentäminen of galektiini-3 kuten aiemmin on kuvattu [6]. Microarray tuloksia ladataan GEO (GSE29630).

Tilastot analyysi

Tulokset esitettiin keskiarvona ± SD vähintään 5-10 kuvaa saatiin kolmesta itsenäisestä kokeesta käyttäen mikroskooppia (x 100, x 200), ellei toisin ole mainittu. Tilastollinen analyysi suoritettiin yksisuuntaisella ANOVA testi käyttäen Prism-ohjelmiston. Tiedot pidettiin merkittävinä, jos p
< 0,05.

tukeminen Information
Kuva S1.
Silenced galektiini-3 siRNA mahasyövän soluissa johti muutoksiin soluliikkuvuus liittyvien geenien ilmentymisen. A, joukossa DNA microarray-analyysi, päätimme soluliikkuvuus liittyvät geeni MMP-1, MMP-3, FSCN1 (Fascin-1), F2R (PAR-1), TIMP-2, SERPINE1 (PAI-1) ja osoitti kertainen muutos suhde . B, havaitseminen mRNA MMP-1, MMP-3, FSCN1 (Fascin-1), F2R (PAR-1), TIMP-2, SERPINE1 (PAI-1) käyttäen PCR: llä. β-aktiini käytettiin normalisointia ohjaus.
doi: 10,1371 /journal.pone.0025103.s001
(TIF)
Kuva S2.
määrä zebrafish alkioiden siirtynyt solujen suhteen. Detection of mahalaukun syöpäsolun AGS (RFP) numerot jälkeen istutetut AGS (RFP) in seeprakalalla kalan alkio hoidon erityisiä siRNA (galektiini-3, MMP-1 ja PAR-1) negatiiviseen kontrolliin scRNA (kuvio 5A-B). Se osoitti kuinka monen solun kohti embyos laskettiin ja esitetään prosentteina.
Doi: 10,1371 /journal.pone.0025103.s002
(TIF) B Kuva S3.
RT-PCR-analyysi mRNA tason galektiini-3, MMP-1 ja PAR-1 mahalaukun syöpäpotilailla.

• PLoS ONE: kasvain-Log Kerroin Positiivisten imusolmukkeiden-Metastasis Välivarastointi System, lupaava uusi Välivarastointi System mahasyövän jälkeen D2 Kaarileikkaus Kiinassa
• PLoS ONE: Honokiol indusoi Calpain välittämää glukoosin säätelemä proteiini-94 lohkaisu ja apoptoosi ihmisen mahasyöpä Syöpäsolut ja Vähentää kasvaimen kasvu