Plos ONE: galektin-3 Omogoča Cell gibljivost želodčnega raka, ki jih Up regulacijo proteaz aktivira receptor-1 (PAR-1) in Matrix metalo--1 (MMP-1)

Povzetek

Ozadje

galektin-3 je znano, da urejanje rakavih metastaz. Vendar pa ni bil opredeljen osnovni mehanizem. Skozi študij DNA mikromrež po galektin-3 utišanje, smo pokazali tu, da ima galektin-3 ključno vlogo pri up-urejanje izraze-proteaze aktivira receptorja-1 (PAR-1) in matrika metalo-1 (MMP-1) PAR-1 in s tem spodbuja želodčne metastaze raka.

Metodologija /Glavne ugotovitve

preučila raven izražanja galektin-3, PAR-1 in MMP-1 v želodčnih rakavih tkivih bolnikov in tudi učinki utišanje te beljakovine s posebnimi siRNAs in za njihovo pretirano izražanje uporabo posebnih Lenti-virusne konstrukte. Prav tako zaposleni cebric modela zarodkov za analizo in vivo
želodčni rak celic invazijo. Te študije so pokazale, da: a) galektin-3 za dušenje zvoka zmanjša ekspresijo PAR-1. b) galektin-3 prekomerno ekspresijo povečuje migracijo celic in napad, in to povečanje je mogoče obrniti tako PAR-1 utišanje, kar kaže, da galektin-3 povečuje migracijo celic in vdor preko PAR-1 do regulacije. c) galektin-3 direktno komunicira s AP-1 transkripcijskim faktorjem, in ta kompleks veže na PAR-1 promotor in poganja PAR-1 transkripcijo. d) galektin-3 širi tudi fosfo-paxillin, nadaljnjega cilja za PAR-1, s povečanjem MMP-1 izraz. MMP-1 za dušenje zvoka bloki fosfo-paxillin pomnoževanje in celic invazija galektin-3 pretirano izražanje povzročil. e) dušenje zvoka bodisi galektin-3, PAR-1 in MMP-1 bistveno zmanjša celične migracije v plovila v cebric modela zarodka. f) galektin-3, PAR-1 in MMP-1 so zelo izražene in co-lokaliziran v malignih tkiv bolnikov z rakom želodca.

Sklepi /Pomen

galektin-3 igra ključ vloga aktiviranje površine receptorja celic s proizvodnjo proteaze in povečuje želodca metastaz raka. Galektin-3 ima potencial, da služijo kot koristen farmakološkega cilj za preprečevanje želodca metastaz raka

Navedba. Kim S-J, Shin J-Y, Lee K-D, Bae Y-K, Choi I-J, Park SH, et al. (2011) galektin-3 Omogoča Cell gibljivost želodčnega raka, ki jih Up regulacijo proteaz aktivira receptor-1 (PAR-1) in Matrix metalo--1 (MMP-1). PLoS ONE 6 (9): e25103. doi: 10,1371 /journal.pone.0025103

Urednik: Jean-Marc Vanacker, Institut de Génomique Fonctionnelle de Lyon, Francija

Prejeto: 18. maj 2011; Sprejeto: 23. avgust 2011; Objavljeno: 22. september 2011

Copyright: © 2011 Kim et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. Ta študija je bila podprta z National Cancer Center (NCC) Republike Koreje donacije (NCC-0910150 in NCC-0810060), inovativna raziskovalnega inštituta za celično zdravljenje, republika Koreja (A062260) in te raziskave je podprla raziskovalni program Basic442 Science skozi National Research Foundation (NRF), ki ga je ministrstvo za šolstvo, znanost in tehnologijo (1031790-1) financira, republika Koreja. Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

rakavih obolenj, ki se širijo (metastaze), od svojega prvotnega mesta na drugo območje telesa, imenujemo metastaznih rakov. metastatskega raka imajo slabo prognozo in visoko smrtnost [1]. Popolno razumevanje biološkega mehanizma (ov), ki sodeluje pri metastaz in racionalnih pristopov k preprečevanju in nadzorovanju metastaz lahko vodi do praktičnih pristopov za izboljšanje stopnje preživetja bolnikov, prizadetih z metastatskim raka. V predhodnih raziskavah smo ugotovili, da galektin-3 poveča gastrični gibljivost rakava celica z navzgor regulacijo fascin-1, an-aktin povezovanje v citoskeletne proteine ​​[2]. Galektin-3 je ogljikovih hidratov priznanje protein 31 kDa, ki sodelujejo pri tumorigeneze, rast rakavih celic in metastaza [3], [4], [5] in visoka ekspresija v številnih človeških rakih je bilo ugotovljeno, da je v korelaciji s slabo prognozo metastatskega raka.

Da bi pojasnili vlogo galektin-3 v rakastih metastaz, smo Trkal navzdol do izraza v želodčnih rakavih celic z uporabo svojega siRNA in pregledal rezultate v izražanju genov z analizo DNA mikromrež [6]. Med predhodnih rezultatov smo ugotovili znatno znižanje ravni-proteaze aktivira receptorja-1 (PAR-1), član družine transmembranskih G-protein pripojen receptorjev [7], in njeni aktivatorja, matrične metaloproteaze-1 ( MMP-1) (slika S1). Razklani PAR-1 je avto-fosforilirata in transduciramo zunajcelične signala (e) po različnih poteh, in igra ključno vlogo pri tumorski metastaz [7], [8], [9]. Prekomerno izražanje PAR-1, so poročali v več vrst raka, vključno z melanomov, prsih in želodcu raka. MMP-1 je prav tako reguliran v različnih naprednih raka in znatno negativno korelacijo so opazili med njegovo ekspresijo in preživetja bolnikov [10], [11], [12], [13]. Tudi več študij je pokazala, da ima MMP-1 odločilno vlogo pri metastaze raka dojke [14], jeter in debelega črevesa raka [15], in želodca raka [16], [17], med drugim. Zdi se, da je nekoč izloča, MMP-1 spodbuja invazijo rakavih celic z razgradnjo zunajceličnih matrik in /ali Submukozno plasti limfotokom [10], [14]. Številne študije so pokazale, da je zaviranje MMP vodi v inhibicijo celične invazije [18], [19].

hese ugotovitve nas je pripeljala do hipotezo, da galektin-3, PAR-1 in MMP-1 lahko sodeluje pri povečanje migracij in napad na raka želodca. Da bi to hipotezo preverili, smo opravili študije za svojo vlogo v želodcu rakavih celic. V obeh in vitro
in vivo
študij smo uporabili cebric modela zarodkov za določanje njihove učinke na migracije in invazije rakavih celic z živimi organel. Ugotovili smo tudi raven izražanja galektin-3, PAR-1 in MMP-1 pri malignih tkiv pri bolnikih z rakom želodca za klinične korelacije med temi proteinov v človeških vzorcih.

Rezultati

Utišanje galektin -3 ali PAR-1 zmanjšuje migracijo in vdor človeških želodčnih rakavih celic

bile ekspresijski nivoji galektin-3 in PAR-1 visoko najbolj želodčnih raka celičnih linij. utihnile smo galektin-3 in PAR-1 v 28 podjetja MKN-celic, ki zaposlujejo ustrezne siRNAs. Zdravljenje z galektin-3 siRNA zmanjšala nivoje izražanja obeh galektin-3 in PAR-1, ker PAR-1 zdravljenje siRNA zmanjšala le PAR-1 ekspresije, ko ni bilo razlike opazili galektin-3 (slika 1A). Transfekcija snu-638 celic, ki so prvotno prikazujejo nima ekspresije galektin-3, z galektin-3-kodiranje plazmida povzročilo povečano ekspresijo tako PAR-1 in galektin-3 (slika 1B). Utišati ali galektin-3 ali PAR-1 zmanjša skupno število selitve ( p
< 0,001) (slika 1C), ki preplavljajo celic ( p
< 0,001) (Slika 1D), skoraj za polovico. Ti podatki so pokazali, da galektin-3 povečal PAR-1 izraz in tako galektin-3 in PAR-1 modulirano migracije želodčni rak celic in invazijo.

galektin-3 povečuje migracijske želodčni rak celic /invazijo s povečanjem PAR-1 izraz

Proučili smo razmerje med galektin-3-induciranih povečanjem celični migraciji in invazije na eni strani in PAR-1 ekspresijo na drugi strani. okuženih smo SNU638 celice z lentivirusom vsebuje galektin-3 izražanje predal, in preučila izraze galektin-3 in PAR-1, in migracije izmerjene celic. Ugotovili smo, da je prekomerno ekspresijo galektin-3 skupaj z zvišanjem PAR-1 mRNA in beljakovin izrazov (slika 2a), kakor tudi celične migracije ( p
< 0,001) (slika 2B) in celično invazijo ( p
< 0,001) dejavnosti (slika 2C). Ta povečanja so se zmanjšala za PAR-1 utišanja. Ti rezultati kažejo, da galektin-3 spodbujati migracije in vdor želodčnih rakavih celic z up-regulacijo PAR-1.

galektin-3 spodbuja PAR-1 transkripcijo skozi interakcijo z AP-1 kompleksa

nato smo poskušali pojasniti, kako galektin-3 ureja PAR-1 izraz. Ker so poročali, da je AP-1 transkripcijski dejavnost urejena z galektin-3 [20], smo se osredotočili na vlogo te transkripcijski faktor v zvezi s tem (slika 2D). Smo opravili študije imunoprecipitacije in ugotovil, da galektin-3 neposredno interakcijo z obema fra-1 in c-Jun v kompleksu AP-1 in da je bila ta interakcija povezana z regulacijo navzgor AP-1 transkripcijske aktivnosti (slika 2E). Dostavo, smo pregledali vezavno aktivnost DNA AP-1 z in brez galektin-3 s čipom teste (slika 2F). Ugotovili smo, da AP-1 kompleks vezan na promotor PAR-1 v prisotnosti galektin-3, vendar ne v njegovi odsotnosti. po transfekciji reporterskega plazmida, ki vsebuje AP-1 vezavno zaporedje v pred-luciferazni vožnje minimalno promotorjem v LacZ ali galektin-3 smo tudi ocenili transkripcijsko aktivnost AP-1, ki ga luciferazni test prekomerno izražanje snu-638 celice ( p
< 0,001) (Slika 2G). Transkripcijski aktivnost AP-1 v galektin-3 znatno povečala prekomerno izražanje celice, ne pa tudi v LacZ prekomerno ekspresijo celic. Ti rezultati kažejo, da galektin-3 olajšano vezave promotorja PAR-1 z interakcijo z AP-1 kompleksa, s čimer se povečuje PAR-1 ekspresijo po transkripcijske regulacije.

galektin-3 poveča ekspresijo MMP-1 in aktivacija PAR-1 signalizacijo

MMP-1, so poročali za urejanje PAR-1 aktivacijo s cepitvijo PAR-1 privezan znotrajcelično signalizacijo, in vplivajo na celično invazijo [21]. Kot je prikazano na sliki S1, smo pokazali, da galektin-3 regulirano MMP-1 ekspresije. Zato smo potrdili medsebojne iz galektin-3, MMP-1 in PAR-1. Analizirali smo nivoje mRNA ekspresije MMP-9, ki je tarča nadaljnji od PAR-1 [8], po utišanje galektin-3, MMP-1 in PAR-1 posamično (slika 3A). Medtem galektin-3 za dušenje zvoka zmanjša ekspresijo vseh treh molekul (MMP-1, PAR-1 in MMP-9), MMP-1 dušenje zvoka zmanjša le MMP-9 izraz in ne tistih galektin-3 ali PAR-1. Zanimivo je, PAR-1 za dušenje zvoka proizvaja enake učinke kot MMP-1 utišanja. Prav tako smo odkrili fosforilacijo paxillin na citoskeletnim beljakovin (pY181), ki je zaščitni znak za PAR-1 aktivacijo [22], [23]. Po utišati galektin-3, MMP-1 in PAR-1 posamično, se je zmanjšala phosphorylaion od paxillin, ki je predlagal galektin-3 tudi urejeno PAR-1 aktivnost. Prav tako smo preverili zmanjšanje MMP-9 aktivnosti po dušenje zvoka iz galektin-3, MMP-1 in PAR-1 posamično (slika 3A).

galektin-3 prekomerno izražanje SNU638 celice so pokazale povečano ekspresijski nivoji MMP -1 in PAR-1 protein kot tudi njihove mRNA, poleg fosforiliranim paxillin (pY181). V teh celic, MMP-1 utišanje zmanjšalo fosforilacijo paxillin brez spreminjanja ekspresijo galektin-3 ali PAR-1 (slika 3B). Poleg tega, MMP-1 za dušenje zvoka zmanjša celično invazijo, ki je sprožila galektin-3 nad ekspresijo ( p
< 0,001) (slika 3C), kar pomeni, da galektin-3 povečal MMP-1 izraz, ki vodi do aktivacija PAR-1 signalizacijo.

Prekomerno izražanje MMP-1 v rakavih celicah povečuje celično invazijo z aktivacijo PAR-1 signalnih

Potrdili smo, da se regulacijo MMP-1 z galektin-3 je pomembna za aktivacijo PAR-1 signalizacijo in povečane želodca rakavih celic invazije. Lentivirusni (pLECE3 vektor), ki vsebuje MMP-1 ekspresijsko kaseto s CMV promotorjem urejeno smo pripravili in okužili v AGS želodčne rakavih celic (slika 4A-B). Kot je bilo pričakovati, MMP-1 prekomerno ekspresijo povečala invazijo potencial želodčnih rakavih celic in PAR-1 utišanje bistveno obrnilo to povečanje ( p
< 0,001) (slika 4B). To potrjuje tudi dejstvo, da je prekomerno ekspresijo MMP-1 povečala fosforilacijo paxillin, in da dodatna utišanje PAR-1 blokiranem takšno fosforilacije (slika 4A). V MMP-1 prekomerno ekspresijo celic, galektin-3 za dušenje zvoka zmanjša ekspresijo PAR-1, vendar ne da MMP-1, in tudi fosforilacijo paxillin in celične invazivno potenciala (Slika 4A-B). Te ugotovitve kažejo, da prekomerno ekspresijo MMP-1 povečala rakavih celic invasivity z aktivacijo PAR-1 signalizacijo. Sprejeti vse skupaj, ti rezultati kažejo, da galektin-3 povečano izražanje obeh PAR-1 in MMP-1 in da je povečana MMP-1 izražanje aktivira PAR-1 signalizacije, ki v zameno, olajšano rakavih celic invazije. Ti dogodki so shematsko prikazano na sliki 4C.

utišanje galecin-3, PAR-1 in MMP-1 blokov želodca migracije karcinom in vivo
v cebric modelu

Transgena cebrice, Tg (kdrl: EGFP) ^{s843
[24], izražanje EGFP posebej v njihovem ožilju. Ustrezne cebric zarodki so pregledni z zelenimi fluorescentnimi plovil. Zaposlili smo te ribe za vodenje in vivo
študij migracij človeške želodčne rakave celice (Slika 5A). Ko so rdeči fluorescentno označene AGS celice vbrizgali v hranilni mešiček Cebrica zarodkov na 48 HPF (ur po oploditvi), večina transplantiranih AGS celic je bilo, ki se nahajajo v centru hranilni mešiček zarodkov za 4 ure po presaditvi ( HPT). Po 26 HPT, tako običajne in scRNA transficirane celice selili v prtljažnik regiji, in prebival v posodi debla in /ali repa zarodkov pri 50 RVP. Vendar pa je število migrirali AGS celic, pri čemer vsak od galektin-3, zatrejo PAR-1 ali MMP-1, značilno zmanjšal (slika 5B). Prav tako smo prešteli Cebrica zarodkov, ki prikazujejo selitvah celice in rezultati so prikazani (Slika S2). Osemdeset štiri do devetdeset treh odstotkov cebric zarodkov, ki so bile presajene s kontrolnimi celicami ali scRNA obdelanih celic prikazane celice prehaja v svoje prtljažnik in rep plovila 50 RVP. Vendar le 7-11% zarodkov, ki so bile transplantiranih s celicami, v katerih so bile utišane galektin-3, PAR-1 ali MMP-1, prikazan migracija celic. Te ugotovitve predlagali, da prvi model Cebrica zarodkov lahko uporabimo za spremljanje migracije želodčnih rakavih celic kot živi živali, in drugič, da utišanje vsaka galektin-3, PAR-1 in MMP-1 povzročil znatno znižanje migracije želodca karcinom in vivo
.}

Prijave galektin-3, PAR-1 in MMP-1, so povišana, vzporedno, pri malignih tkivih bolnikov z rakom želodca

Ugotovili smo mRNA in koncentracije proteina izraz galektin-3, PAR-1 in MMP-1 v normalnih in malignih tkiv 20 želodčnih bolnikih z rakom, potem zaposleni RT-PCR z uporabo slik J analizatorja. Kot je prikazano na sliki 5C in Slika S3, 73,7% bolnikov z rakom je pokazala višje ekspresijski nivoji galektin-3 in 70% od njih so pokazali višjo stopnjo PAR-1 in MMP-1 v svojih malignih tkivih kot v njihovi običajni kolegi. Poleg tega se med galektin-3 pozitivnih bolnikov je bilo 71,4% tudi PAR-1 pozitivnih medtem ko je bilo 64,3% tudi MMP-1 pozitivnih (Slika 5D). Ti podatki kažejo, da je vzporedno povečanje ekspresije galektin-3, kakor tudi PAR-1 in MMP-1, pri malignih želodčnega tkiva. Prav Ugotovili smo, da so ti proteini co-lokalizirani na maligne področja tkiv, in ne v nemaligne območij (slika 5c). Galektin-3 je bil prisoten tako v citosolu in jedra, medtem ko so PAR-1 in MMP-1 opazili na splošno v citosolu in membrano znotraj istega območja (slika 5C). Te ugotovitve kažejo, da obe PAR-1 in MMP-1 izrazi močno povezana z galctin-3 izražanja pri bolnikih z rakom želodca.

Pogovor

Ta študija je pokazala, da galektin-3 okrepljeno migracije želodčni rak celic in invazija. Mehanično, to povezano galektin-3 za regulacijo navzgor PAR-1 celični površinski receptor, in aktivnost MMP-1 proteaze. To je v skladu s poročili, ki dokazujejo povezavo med izražanjem PAR-1 in tumorske invazije in metastaz v želodcu in več drugih vrst raka [25] [26] [27]. Ta študija je prva dokazati neposredno interakcijo galektin-3 in AP-1 kompleksnih komponent, c-jun in fra-1, in ureditev PAR-1 izražanja z AP-1 transkripcijski faktor. Ker je bilo že razvidno iz drugih, ki prekomerno ekspresijo fra-1 spodbuja rakavih celic invazijo in metastaze [28], up-regulacijo PAR-1 s c-jun in Fra-1 je zdelo, da je možno mehanizem, ki pojasnjuje povezavo od galektin-3 inducirane navzgor regulacijo PAR-1 celični površinski receptor, in aktivnost MMP-1 proteaze. Ta možnost je podprta z našo ugotovitvijo vzporednih in sočasno lokalizirane prijavo galektin-3 in PAR-1 v malignih tkivih bolnikov z rakom želodca.

To je nova ugotovitev, da galektin-3 poveča MMP-1 izraz . Jasno je, da prekomerno izražanje MMP-1 lahko poveča želodčne invazijo aktivnost rakavih celic, tako da blokira celice do celice in celice na matričnih interakcij razgradnjo ECM. Zato se lahko povečanje MMP-1 izražanja galektin-3 spodbujati imajo dvojni učinek, in sicer, PAR-1 aktivacijo in degradacijo ECM, in oba sta ključnega pomena za želodčne metastaz raka. Vendar, kako galektin-3 uravnava MMP-1 ekspresije še vedno nejasen, ker je izražanje MMP-1 ureja serijo kompleksnih dogodkov, vključno z navzkrižno talk med več transkripcijskih faktorjev, kot AP-1 signala pretvornik in aktivator prepis-3, MAP kinaze in hipoksija-inducibilnih faktor-1 v hipoksijo [29] [30] [31].

Vzpostavitev Cebrica ( Danio rerio
) model zarodkov za proučevanje migracij in vdor želodčnih rakavih celic je predvsem dosežek te študije, ker so primerni živalski modeli niso bili na voljo za preučevanje človeške želodčne metastaze raka do sedaj. Cebrica modela za študij genetsko raka in /ali tumorske ksenografi, ima številne prednosti, vključno z izvedljivostjo naprej in vzvratno genetske analize, preglednosti zarodkov [32], in primernosti za GFP označevanje plovil [32], [33], [34]. Ta študija je pokazala, da je RFP označene želodčnih rakave celice napadel krvne žile, medtem ko galektin-3, MMP-1 ali PAR-1 utihnile želodca rakave celice ne bi mogel. Tako se zdi, da je obetaven model za študij invazijo in metastaze rakavih celic, vendar so nadaljnje študije nujno potrebno za potrditev te ugotovitve Cebrica zarodek.

Na koncu naše raziskave so pokazale, da galektin-3 pospešeno raka želodca celične motilitete z up-regulacije PAR-1 in MMP-1. Nadaljnje raziskave so nujno potrebno določiti vlogo galektin-3 v rakastih metastaz in njegovo primernost kot terapevtski cilj za izbrane vrste raka.

Materiali in metode

tkiv

Pari 2 mm so velika biopsije osebki pridobljeni z adenokarcinomom želodca tkiv 20 bolnikih z diagnostično endoskopijo in endoskopsko Submukozno bezgavk, v državnem centru raka v Koreji, po pridobitvi pisne obveščeni soglasij. Vzorci tkiva smo zamrznili v tekočem dušiku pri -70 ° C, takoj po biopsije do uporabe. Nekateri izmed vzorcev tkiva smo paraffindized za Imunohistokemične študije, kot je potrebno. Te študije je odobril revizijski odbor institucionalne National Cancer Center (# NCCNSH 03-024).

Cell Kultura in siRNA Transfekcije

Zmerno diferencirana želodca linije človekovih adenokarcinom celic, AGS, MKN- 28 in snu-638 so bili pridobljeni iz Koreje Cell Line banke in ohraniti kot prej [35] opisano. siRNAs uporablja v transfekcije, so bili vsi, ki jih Invitrogen (Carlsbad, CA). Njihove sekvence so galektin-3 (LGAL3) siRNA; 5'-AUAUGAAGCACUGGUGAGGUCUAUG-3 ', PAR-1 siRNA; 5'-CCCAUCUGUGUACACCGGAGUGUUU-3 in MMP-1 siRNA; 5'-GGAGAAAUAGUGGCCCAGUGGUUGA-3 '. Transfekcije so bile izvedene z uporabo Lipofectamine RNAiMAX reagenta (Invitrogen), po navodilih proizvajalca. Indukcija prehodna galektin-3 prekomerno v snu-638 celic smo dosegli z uporabo pcDNA3.1 /NT-galektin-3 z pcDNA3.1 /NT-GFP. Za zdravljenje nadzorni normalizacijski so želodčni rak celičnih linij obdelamo z 1 ug ga LTX reagentov (Invitrogen).

izolacijo RNA in RT-PCR analizi

Celotno RNA smo izolirali iz človeških želodčne rakavih celic in vzorcev pacientov tkiva, ki uporabljajo TRIzola Reagent (Invitrogen), po navodilih proizvajalca. Reverzne transkriptaze PCR smo izvedli z uporabo povratne sistem Transcription (Promega Corp ZDA), po navodilih proizvajalca. Uporabljeni so bili primerji: 5'-ATGGCAGACAATTTTTCGCTCC-3 "(občutek) in 5'-ATGTCACCAGAAATTCCCAGTT-3" (anti-sense) za prehrano LGAL3 genov (galektin-3); 5'-CCAAAACTGAGCATAAGTCC-3 "(občutek) in 5'-AGGATGGAGCAAATGTAGTG-3" (anti-sense) za prehrano F2R gen (PAR-1); 5'-ACAGCTTCCCAGCGACTCTA-3 '(čut) in 5'-CAGGGTTTCAGCATCTGGTT-3' (anti-sense) za prehrano MMP-1 gena; 5'-CTCGAACTTTGACAGCGACA-3 '(čut) in 5'-GCCATTCACGTCGTCCTTAT-3' (anti-sense) za prehrano MMP-9 gena; 5'-AGCCTCGCCTTTGCCGA-3 '(čut) in 5'-CTGGTGCCTGGGGCG-3' (anti-sense) za P-aktina gena humanega; 5'-GGCTGCTTTTAACTCTGGTA-3 '(čut) in 5'-ACTTGATTTTGGAGGGATCT-3' (anti-sense) za človeško gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenaze (GAPDH). PCR smo izvedli v volumnu 20 ul z uporabo Ex Taq (Takara). Amplifikacije cikel (denaturacija 95 ° C za 1 minuto, žarjenje 60 ° C 1 min in podaljšku koraku pri 72 ° C za 2 min) smo ponovili 32-krat sledi končno razširitvijo za 10 min pri 72 ° C.

Gradnja galektin-3 izražanje Lenti-virusni vektor in infekcijo

celovečerni človek galektin-3 izražajo gradnjo pcDNA3.1-NT-GFP-gal3 je pcDNA3.1-NT-GFP vektor in Lenti-virusni vektor prekomerno hitre LacZ, galektin-3 (1-250) v pLL3.7 so bili že prej opisali [2]. Human F2R smo klonirali v pLECE3 v BamH1 in Not1 restrikcijskih encimov strani ustvarja pLECE3-F2R (PAR-1) konstrukt. Polne dolžine cDNA iz F2R, MMP-1 in kontrolno mRFP smo uporabili za pomnoževanje, skupaj s primerji, navedenimi v podatkovnem S1 in posledični PCR fragmentov smo klonirali v vektor pLECE3 uporabo Pac1 in Hpa1 restrikcijska encima mest, ki ustvarja pLECE3 -MMP-1 konstrukt. Poleg tega je bila mRFP prizorišče pGEM-T-Easy vektor prenese na pLL3.7 vektor nadomešča regijo GFP uporabo AGE1 in EcoR1 restrikcijskih encimov mesta, da bi pLL3.7-mRFP. Lenti-virusni vektor proizvodnja je prej opisano, [2]

Western blot analizo

celični lizat ekstrakcije so bili pripravljeni z RIPA pufrom (1% NP-40,. 0,1% natrijevega dodecil sulfata; 0,5 % desoxycholate; 150 mM NaCl; 50 mM Tris, pH 7,5) in proteaze inhibiter koktajl. 20 mikrogramov celotni protein vsakega lizata je bila rešena 8-12% SDS PAGE gelih in elektro-prenese na PVDF membrano in nato blokirali v 5% posnetega mleka v 0.05% Tween-20 z 1 x PBS (PBST). Poliklonska primarna protitelesa, anti-galektin-3, anti-ThrombinR (PAR-1), anti-c-jun, anti-fra-1 in anti-β-aktina (Santa Cruz), anti-MMP1 (Calbiochem), anti paxillin in anti-fosfo paxillin (pY181) (Epitomics) inkubiramo z blot analiz na 1:1000 razredčenju v minimalnih količinah od 5% BSA (goveji serum albumin) v PBST pufru za sobni temperaturi 1 uro ali čez noč pri 4 ° C. Anti-mišje ali anti-kunčjega koz-HRP-konjugiranimi sekundarna protitelesa (GE zdravstveno Britanska omejeni) inkubiramo pri 1:5000 redčenju 5% BSA v PBST pufru 1.5 ure pri sobni temperaturi. Proteini obresti so odkrili z okrepljenim kemiluminescenco (ECL) (Amersham Corp, Arlington Heights, IL, ZDA).

imuno

celični lizat ekstrakti so bili pripravljeni z IP + pufrom (20 mM Hepes, 1 % Triton X-100, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 100 mM NaF, 10 mM natrijev pirofosfat, 1 mM natrijev ortovanadata, 0,2 mM PMSF, 10 ug /ml inhibitor proteaze koktajl) na ledu 30 minut. Po odstranitvi razbitin s centrifugiranjem (13.200 vrtljajev na 4 ° C za 20 minut), smo supernatante podvržemo stopnji preclearing s protein A /G agarozo kroglic pri 4 ° C za 30 minut v rotor. Supernatante pridobljeni po kratkem centrifugiranjem (2000 rpm pri 4 ° C za 4 minute), so podvrgli imuno uporabo anti-galectin3 in normalno IgG miške (negativna kontrola). Immunoprecipitates smo dvakrat izprali v IP- pufru (20 mM Hepes, 1% Triton X-100, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 100 mM NaF, 10 mM natrijev pirofosfat). Po 30 ul 2 x SDS-vzorčnega pufra Poleg tega, čemur vre pri 95 ° C 5 min. Po supernatante dobimo po kratkem centrifugiranju, so bile njihove stopnje izraženosti beljakovin se določi v zahodni blot analizo opraviti.

Imunohistokemija

Za galektin-3 in PAR-1 imunohistokemijo, deparaffinized dele tkiva želodčnih bolnikov z rakom so ostali v mikrovalovno pečico za 15 minut v citratnega pufra (Vector laboratoriji), in nato inkubirali s 3% H _{2O 2 za 15 minut, da blokira endogenega peroksidazo, ki ji sledi inkubacija z 10% normalno kozjega seruma (Vector laboratoriji) v 1 x PBS 10 minut. Primarna protitelesa so bili uporabljeni kot anti-galektin-3 (1:200) anti-MMP1 (Epitomics) in anti-PAR-1 (1:200) protitelesa (Santa Cruz), in naslednji korak je bilo opravljeno v skladu z navodili Vectastain®ABC kit (Vector laboratoriji). Izdelke smo prikazali s diaminobenzidine (DAB) kompleti (Vector laboratoriji).}

želatina cimografijo

Pogojene mediji so bili pridobljeni iz kultur podjetja MKN-28 želodčnega raka celičnih linijah in zgoščeno uporabo vivaspin 6 (Sartorius ). Koncentrirani Supernatante v 6 × Foz pufra smo ločili na 10% SDS geli, ki vsebujejo 1 mg /ml želatine. Vsak smo inkubirali v 100 ml cimografijo reakcijskega pufra in obarvajo z Bio-safe ™ Coomassie G-250 (Bio-Rad Laboratories). Po razbarvanje, so bile ostre prozorni trakovi označujejo gelatinolytic dejavnost vizualizira na modrem ozadju.

migracije Transfilter in invazijo testi

Za migracijo transfilter in invazijo testu smo uporabili MKN-28 in snu-638 celice. Celice smo transfektirali z siRNAs za 1 dan, izoliran in dodamo k zgornji komor pore vstavlja Transwell s tipom kolagen l (BD biološke) prevlečenih filtri migracij testu in Matrigel (BD bioznanosti) prevlečenih filtri, za invazijo testih. RPMI 1640 z 10% FBS in 1% antibiotikov (Gibco) dodamo k spodnji komori, čemur sledi inkubacija 20 ur. Preseljevanje in preplavljajo celice količinsko po H & E madeži. Vsak poskus smo izvedli v treh izvodih in podatki predstavljeni kot srednje vrednosti.

kromatina imuno testi

kromatina imunoprecipitacije (čip) teste smo izvedli s pomočjo čipa analiznega kompleta (Millipore) je. Vzorci so bili uporabljeni na jedi po galektin-3 zdravljenje siRNA in analize so bile izvedene po navodilih proizvajalca. Anti-galektin-3 so anti-c-jun, anti-fra-1 in normalno miš /zajca IgG se uporablja za imunoprecipitirajo DNA, ki vsebuje komplekse. Pred PCR, smo pripravili primerji za AP-1 z PAR-1 promotor vezavnih mest -666 (5'-CACTGT CGACGTCTCCACAT-3 ') in PAR-1 promotor mestu -307 (5'-GGGCCTAGAAGTCCAA ATGA-3'). PCR smo izvedli z Ex Taq (Takara).

luciferazne teste

AP-1 luciferaze reporter plazmida je pridobljena iz dr Sung-Pil Yoon Nacionalnega centra raka v Koreji in študij učinkov galektin-3 na AP-1 transkripcijske aktivnosti v lacZ in galektin-3 prekomerno izražanje celice so bile izvedene v skladu s predhodnim poročilom [2]. Po 48 urah smo celice poberemo in merimo luciferazno aktivnost z uporabo sistema za luciferazni test (Promega) po navodilih proizvajalca. Vsak poskus smo izvedli v treh izvodih in podatki predstavljeni kot povprečne vrednosti

Cell migracija test z Cebrica modela

Transgenska Cebrica vrstica Tg (kdrl: EGFP). ^{s843
[24], v katerem je EGFP posebej izražena v žilah, se je ohranilo v skladu s sprejetimi standardnimi operativnimi postopki [36] Odbor za institucionalne živali Nega in uporabo na National Cancer Center v Koreji odobril; številka dovoljenja: NCC 11-116. Dobili smo zebra-rib zarodke iz National Cancer center cebric aqua sobi. Presaditev karcinom je bila izvedena v skladu z Nicoli et al [37], z manjšimi spremembami. Na kratko, dechorionated zarodki anestezirali s trikain (Sigma) in so vbrizgali rakave celice (150 do 200 na zarodek) v središčih zarodkov rumenjakov vrečk po 48 HPF (ur po gnojenje) s pomočjo mikromanipulatorjem (Narishige) in pnevmatski Picopump (WPI ) opremljen z borosilikatnega stekla iglo. Zarodki so se ohranili po postopkih presaditve in so bili pregledani za migracijo rakastih celic s fluorescenčno mikroskopijo. Za slikanje, so zarodki in ličinke obdelamo z N-Feniltiosečninski (Sigma) od 12 HPF za preprečevanje pigmentacijo in pregledana s fluorescentnim obrnjenem mikroskopom (Carl Zeiss) pod epifluorescenčnim optiko. Fluorescenčne slike so bile posnete z video kamero (Carl Zeiss). Stabilni fluorescentne želodca celične linije AGS (mRFP) je nastalo z okužbo Lenti-virus z pLL3.7-mRFP sledi FACS sortiranjem.}

Mikromrežni analiza podatkov

Mikromrežni je bila izvedena v letnem pregledu rasti, rak želodca celična linija po dušenje zvoka iz galektin-3, kot je opisano predhodno [6]. Rezultati mikromrež so bili naloženi na GSO (GSE29630).

Statistika analiza

Podatki so predstavljeni kot povprečje ± SD od vsaj 5-10 slik, pridobljenih iz treh neodvisnih poskusov s pomočjo mikroskopa (× 100, × 200), razen če ni navedeno drugače. Statistična analiza je bila opravljena s enosmerno testom ANOVA uporabo Prism programske opreme. Data je zdelo pomembno, če p
. ≪ 0,05

Podpora Informacije
Slika S1.
Tihi galektin-3 z siRNA v želodčnih rakave celice povzročilo spremembe v povezano celico gibljivost genske ekspresije. A Med analizo DNA mikromrež smo izbrali celične motilitete gen povezan MMP-1, MMP-3, FSCN1 (Fascin-1), F2R (PAR-1), TIMP-2, SERPINE1 (PAI-1) in pokazali kratno razmerje spremembe . B odkrivanje mRNA ekspresije MMP-1, MMP-3, FSCN1 (Fascin-1), F2R (PAR-1), TIMP-2, SERPINE1 (PAI-1) z uporabo s PCR. β-aktina smo uporabili kot kontrolo normalizacije
doi:. 10.1371 /journal.pone.0025103.s001
(TIF)
Slika S2.
število cebric zarodkov s preseljeno razmerje celic. Odkrivanje AGS (RFP) številke želodčni rak celic po presadijo od AGS (RFP) v cebric rib zarodku z zdravljenjem posebne siRNA (galektin-3, MMP-1 in PAR-1) z negativno kontrolno scRNA (slika 5A-B). To je pokazala številne migriral celice na je embyos prešteti in prikazani kot odstotek
doi:. 10,1371 /journal.pone.0025103.s002
(IOD)
Slika S3. Analiza
RT-PCR ravni mRNA iz galektin-3, MMP-1 in PAR-1 pri bolnikih z rakom želodca.

• Plos ONE: tumor-Log Kvota pozitivnih bezgavk-Metastasis Uprizoritev sistem, novo obetavno sistem odrov za želodca raka po D2 resekciji na Kitajskem
• Plos ONE: Honokiol povzroča kalpainskega-posredovana glukoza-Predpisane Protein-94 Cepitev in Apoptoza v človeške celice želodca raka in zmanjšuje tumorje Growth