Helicobacter pylori Visto:. Li G, H Wulan, canción Z, Paik PA, Tsao ML, Goodman GM, et al. (2015) Función Reguladora de la célula B es suprimida por el tabaquismo y obesidad en H Editor: Masaru Katoh, Centro Nacional del Cáncer, JAPÓN Recibido: 3 Febrero 2015; Aceptado: July 13, 2015; Publicado: July 30, 2015 Derechos de Autor © 2015 Li et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel financiación:.. los autores no tienen ningún soporte o financiación reportar Conflicto de intereses:. los autores han declarado que no existen intereses en competencia Introducción Helicobacter pylori (H Recientemente, el papel de tolerance- la inducción de células B se ha caracterizado en una serie de enfermedades infecciosas y enfermedades autoinmunes [12]. En ratones, CD1d hiCD5 han sido encontrados + B células para ayudar a establecer entorno tolerogénico en los tejidos y tienen un papel en la prevención de la inducción autoinmune [13]. En los seres humanos, CD19 + CD24 hiCD38 hi células B tienen que induce tolerancia en función saludable, así como las personas infectadas por el VHB [14] similares; la aparición de la enfermedad autoinmune se correlaciona con la pérdida de la función de regulación en este subconjunto de células B [15]. IL-10 es una citocina inmunorreguladora pleiotrópica que es capaz de inhibir una serie de citoquinas pro-inflamatorias, incluyendo IL-2, IL-17, IFN-g y TNF-a, y se muestra para suprimir potentemente la capacidad presentadora de antígeno de células presentadoras de antígenos [16]. Central para todos los subconjuntos de células B que induce tolerancia, la producción de IL-10 es fundamental para la regulación B mediada por células T en la supresión de la inflamación mediada por células [12,17]. El papel de la regulación mediada por células B en H En este estudio, se analizó el perfil de composición de las células B y la expresión de citoquinas en H Los sujetos del estudio Se obtuvieron muestras de sangre periférica primarias de 55 H periféricos células mononucleares de sangre (PBMCs) a partir de muestras de sangre periférica con el procedimiento estándar de Ficoll-Hypaque y se congelarse inmediatamente a -150 ° C hasta su uso, o usado en los experimentos de inmediato si se indica. medio de cultivo regular es RPMI-1640 suplementado con suero bovino fetal al 10%, 5 ml de 100 U de penicilina /0,1 mg /ml de estreptomicina, y 5 ml de 2 mM de L-glutamina. Las células fueron cultivadas en 5% de CO 2 a 37 ° C durante el período de tiempo establecido. T y B utilizando células T humanas o células B Negativo Kit de Selección (Stemcell, Vancouver, Canada), siguiendo los protocolos proporcionados por el fabricante. Las purezas de aislamientos de células T y B fueron mayores que 94% por citometría de flujo. Para el agotamiento de CD24 + CD38 + células B en algunos experimentos, las células B purificadas se tiñeron con CD24 PE anti-humana y APC CD38 anti-humano durante 30 min. Se enviaron entonces las células para vivir clasificación de células y se agotaron las células CD24 + CD38 +. En el entorno general de las células B, las células fueron enviados total de B a vivir clasificación de células sin los anticuerpos La citometría de flujo Se utilizaron los siguientes anticuerpos monoclonales anti-humanos:. IL-10, TNF un (eBioscience, San Diego, CA, EE.UU.); CD3, CD4, CD19, CD20, CD21, CD24, CD27, CD38 (Biolegend, San Diego, CA, EE.UU.); IFN-g (BD Biosciences, San Jose, CA, EE.UU.); CD8 (Invitrogen, Grand Island, NY, EE.UU.). Purificada IgG humana (Biolegend, San Diego, CA, EE.UU.) se utilizó para bloquear los receptores Fc cuando la tinción de las poblaciones de células B que contienen. Para algunos experimentos, forbol-12-miristato-13-acetato (PMA, Sigma), ionomicina (Sigma, Munich, Alemania), o muertos por calor H IL-2, IL-17, IFN-g, TNF-a y IL-10 a partir de células T y células B se midieron cuantitativamente por ensayo de Luminex multiplex siguiendo los protocolos proporcionados por el fabricante con modificaciones (EMD Millipore, Etobicoke, Canadá). Un total de 2x10 5 células T y /o células B se sembraron en cada pocillo de una placa de 96 pocillos (Corning, Tewksbury, MA, EE.UU.). Para la estimulación de las células B, muertos por calor H D'Agostino y prueba de normalidad ómnibus Pearson se utilizó para examinar si los datos se distribuyen normalmente. Se utilizó el análisis de una vía de la varianza (ANOVA) para las comparaciones entre múltiples grupos, seguido por la prueba de Dunn. Se utilizó la prueba t de Student para las comparaciones entre los dos grupos. Si los conjuntos de datos desviación significativa en la distribución normal, se utilizaron pruebas no paramétricas. Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando Prism (GraphPad Software). P < 0,05 se consideró significativo. Los resultados se muestran como media ± E.E.M. H Para analizar los posibles cambios en el papel de las respuestas de células B en H Las células circulantes B en la sangre periférica de sujetos sanos se componen principalmente de IgD + CD27 - células B vírgenes y CD21 + CD27 + descansando células B de memoria, mientras que en las infecciones crónicas, frecuentemente hay una disminución de las células B vírgenes y descansando células B de memoria, y un incremento en CD21 lo activa las células B y CD24 + CD38 + B células [15,18]. Primero examinamos la composición de las células B circulantes en H Anteriormente, se encontró que las células B para amplificar o suprimir la respuesta inmune a través de la producción de una serie de citocinas con diferentes funciones, incluyendo pro- citoquinas inflamatorias tales como IL-2, IL-4, IL-6, IL-12, IFN-g y TNF-a, así como IL-10 y el factor de crecimiento transformante beta (TGF-b) como citoquinas reguladoras [19] . Aquí, hemos examinado la expresión de citoquinas de las células B en los sujetos de estudio. Se encontró que el ex vivo CD24 + CD38 + B células tienen funciones reguladoras en otros estudios y tenía interesantes niveles de expresión en diferentes H En conjunto, estos datos demostró que la citocina reguladora IL-10 es producida principalmente por CD24 + CD38 + B y las células se incrementa en H Se sabe que las células B reguladoras para inhibir las respuestas de células T en las infecciones crónicas, tales como la infección por hepatitis B y la infección por virus de la inmunodeficiencia humana [14,20], mediante el establecimiento de entorno tolerogénico a través de IL-10 antes de la inducción de la inflamación [15,21]. Hemos examinado si CD38 + + B células de la IL-10 de producción de CD24 tuvieron efectos reguladores similares en H A continuación trató de examinar el mecanismo de la regulación positiva de IL-10 en las células B de H
la infección se produce en más de la mitad de la población del mundo y es la principal causa de cáncer gástrico. Una serie de factores de estilo de vida y nutricionales, tales como el consumo de tabaco y la obesidad, se han encontrado para elevar el riesgo de desarrollar cáncer. En este estudio, hemos tratado de determinar los aspectos inmunológicos durante H
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la infección y el desarrollo de cáncer gástrico. Hemos encontrado que las células B de H
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pacientes infectados presentó composición y función alterada en comparación con los pacientes no infectados. + CD38 + B células IL-10 que expresan CD24 se upregulated en H
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pacientes infectados, contenían actividad reguladora potente en la inhibición de las células T secreción de citoquinas pro-inflamatorias, y respondieron directamente a H
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estimulación antigénica. Curiosamente, en H
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sujetos infectados fumadores y los obesos, el número de IL-10 + B y células CD24 + CD38 + se redujeron las células B en comparación con H
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infectados sujetos asintomáticos. funciones de regulación mediada por CD24 + CD38 también fueron perjudicados + B células. Además, los pacientes con cáncer gástrico positivos habían reducido IL-10 de producción de frecuencias de células B después de H
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-estímulo. En conjunto, estos datos sugieren que en H
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: infección, CD24 + CD38 + células B es aumentada y desempeña un papel en la supresión de las respuestas pro-inflamatorias, posiblemente a través de la producción de IL-10, una característica que no se observó en fumadores y los pacientes obesos
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Los sujetos infectados y se correlaciona con riesgo elevado de cáncer gástrico. PLoS ONE 10 (7): e0134591. doi: 10.1371 /journal.pone.0134591
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es una especie de bacterias patógenas Gram-negativas que se encuentra en más de la mitad de la población del mundo y preferentemente inhibe el tracto gastrointestinal superior, incluyendo el epitelio del estómago y el tracto duodeno [1,2]. Aunque la gran mayoría (> 80%) de las infecciones son asintomáticas, 10-20% de los sujetos infectados se desarrollan úlceras pépticas, mientras que el 1-2% adquirirá el cáncer [3] gástrica. El mecanismo preciso de desarrollo de cáncer como resultado de H
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no está bien definido, pero la inflamación crónica no tratada en el tracto gastrointestinal superior se cree que contribuyen al daño continuado del epitelio del estómago [4,5]. Específicamente, la inflamación asociada a moléculas, tales como el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-a) de señalización, se ha encontrado que la promoción de tumorigénesis gástrico y es upregulated en H
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infección [6]. Otras citoquinas pro-inflamatorias secretadas por las células T, incluyendo IL-2, IL-17, e interferón gamma (IFN-g), también están regulados por incremento en H
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infección y están asociados con un mayor riesgo de tumorigénesis gástrica [7-10]. Una serie de otros factores, como la exposición continua al consumo de tabaco y la obesidad, están correlacionados positivamente con un mayor riesgo de cáncer gástrico, aunque el mecanismo subyacente no está claro [3,11].
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y la posterior inducción de cáncer gástrico, sin embargo, no fue estudiado previamente.
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sujetos infectados. El aumento de los porcentajes de CD24 + CD38 + B y células reducidos porcentajes de células B vírgenes y que descansan las células B de memoria se encuentran en H
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sujetos infectados por i. El CD24 + CD38 + B en células H
. temas pylori infectadas habían aumentado
porcentaje de la producción de IL-10, y se había suprimido la expresión de citoquinas pro-inflamatorias cuando se co-cultivaron con células T autólogas. H
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timulated CD24 + CD38 + B células de H
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sujetos infectados de forma potente secretadas IL-10. Curiosamente, H
. fumar pylori infectadas
sujetos obesos y subects habían disminuido los niveles de CD24 + CD38 + B células. Se encontraron además, el CD24 + CD38 + células B reguladoras de fumadores y de los sujetos obesos a exhibir pérdida de la función supresora cuando se co-cultivaron con células T autólogas y estimulado los niveles de IL-10 redujo después directa H
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estimulación. Además, con el hábito de fumar y los pacientes obesos que luego desarrollaron cáncer gástrico, las frecuencias de las células B de IL-10 secretoras se redujeron aún más, en comparación con los sujetos que no desarrollaron cáncer gástrico. En conjunto, estos datos demuestran que CD38 + + B células CD24 se upregulated en H
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infectado con y había suprimido funcionalmente las células T producción de citoquinas inflamatorias. El CD24 + CD38 + células B en sujetos fumadores y los obesos, sin embargo, eran refractarios a H
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-estímulo, produjo menos IL-10, y carecían de la capacidad supresora.
Materiales y Métodos
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pacientes sin úlcera infectadas, de las cuales 15 son consumidores primarios de humo de tabaco y 15 son con obesidad clase I (30 kg /m 2 < IMC < 35 kg /m 2 sujetos), así como 15 sana H
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libre de las personas con úlcera no infectadas. Los individuos con la exposición crónica al humo de segunda mano fueron excluidos del estudio. No se encontraron diferencias significativas en cuanto a edad, sexo, y la historia de una infección previa entre los grupos de estudio. Todos los sujetos fueron seguidos durante 5 años para el estado de desarrollo del cáncer. Todos los sujetos eran individuos no relacionados de la provincia de Henan y su región circundante. Los pacientes fueron reclutados entre Enero de 2008 y Dec 2013, desde la 155ª Hospital Central de PLA en China. Los controles fueron individuos libres de cáncer seleccionados al azar de un programa de cribado del cáncer de la comunidad para la detección precoz del cáncer llevado a cabo en las mismas regiones durante el mismo período los pacientes fueron reclutados. La tasa de respuesta para ambos casos y controles fue de 95%. Los criterios de selección de los controles sanos incluyen individuos libres de cáncer y frecuencia de juego a los casos por sexo y edad (± 5 años). Durante el reclutamiento, consentimiento informado por escrito se obtuvo de cada uno de los interesados y personales como el sexo, la edad, el peso, la altura y el consumo de tabaco fueron recogidos a través de un cuestionario. No se utilizaron muestras de todos los sujetos en todos los experimentos debido a la conformidad del paciente incompleta y células insuficientes en algunos pacientes. Este estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la 155ª Hospital Central de PLA.
se aislaron de preparación de muestras
Se aislaron células Célula de aislamiento
. pylori gratis (Sigma, Munich, Alemania) fueron utilizados para estimular las células. GolgiStop y GolgiPlug se añadieron 6 h antes de la cosecha celular para la tinción intracelular de IL-2, IL-17, IFN-g, TNF-a, y IL-10. FlowJo se utilizó para el análisis de citometría de flujo.
Luminex ensayo
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se añadieron a las células B, que se sembraron en la parte inferior de un pozo 96 transwell placa (Corning, Tewksbury, MA). Para la estimulación de células T, la parte inferior de la placa transwell se pre-incubaron con CD3 (OKT3 clon) anti-humana durante la noche y se lavó, después de lo cual se purificaron células T se transfirieron a la placa. perlas de anticuerpo de captura de citocinas humanas se añadieron a la cámara superior del pozo 96 transwell placa. Doce horas más tarde, se recogieron las perlas, se lavaron y se leen de acuerdo con el protocolo del fabricante.
El análisis estadístico
Resultados
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sujetos infectados habían alterado la composición de circulación de células B Opiniones
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la infección y la forma en que podría verse afectada por el tabaquismo y la obesidad, 15 sanos H
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no infectadas ( H
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no infectadas) voluntarios, 20 H
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infectados sujetos asintomáticos no fumadores no obesos (asintomáticos), 15 H
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infectados por fumar sujetos no obesos (fumadores), y 15 H
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infectado con no fumadores obesos (obesos) sujetos fueron reclutados para este estudio. Los datos demográficos y clínicos se resumen en la Tabla 1.
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sujetos infectados. células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) se tiñeron para la expresión de marcadores de superficie directamente ex vivo
(Fig 1A). Se encontró que en comparación con H
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no infectadas sujetos sanos, todos los H
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grupos infectados contenían porcentajes más bajos de IgD + CD27 - células B vírgenes (P < 0,001 para todos, la figura 1B y 1C). Los porcentajes de CD21 + CD27 + células B de memoria en reposo se redujeron en H
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sujetos infectados por fumadores y los obesos en comparación con sujetos sanos (P < 0,001 para ambos), y el porcentaje de CD21 + CD27 + células B en sujetos obesos se redujo en comparación con H
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infectados sujetos asintomáticos (P < 0,01). Curiosamente, los porcentajes de CD24 + CD38 + B células se variaron entre los diferentes grupos de H
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sujetos infectados. H
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infectados sujetos asintomáticos contenían mucho más altos porcentajes de CD24 + CD38 + B células que en los controles sanos (P < 0,001). El porcentaje de CD24 + CD38 + B células se redujo en sujetos fumadores en comparación con la de los sujetos asintomáticos (P < 0,05), pero sigue siendo superior a la de los sujetos sanos (P < 0,001). En los sujetos obesos, el porcentaje de CD24 + CD38 + células B no fue significativamente diferente de la observada en sujetos sanos, pero se redujo de que en sujetos asintomáticos (P < 0,001)
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sujetos infectados habían alterado B de citoquinas de células perfil de expresión
expresión de IL-2, IFN-g y TNF-a por células B se incrementaron en H
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infectado con sujetos fumadores y los obesos que en los sujetos sanos (Figura 2A). No se encontraron diferencias significativas en la expresión de TGF-b.
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grupos infectados (Figura 1C). Se examinó la expresión de citoquinas intracelulares por CD24 + CD38 B + células. Como se muestra en la figura 2B, la expresión de citoquinas de CD24 + CD38 + B células eran diferentes de los no-CD24 + CD38 + B (células B total menos el CD24 + CD38 + B) en las células que no producen altos niveles de IFN-g y TNF-a cuando son estimuladas con PMA /ionomicina, pero expresó niveles muy altos de IL-10, tanto en condiciones no estimuladas y estimuladas. Se comparó la producción de IL-10 de diferentes subconjuntos de células B y encontramos que CD24 + CD38 + B células en todos los grupos de estudio secretan mucho más altos de IL-10 que no CD24 + CD38 + células B, tanto en condiciones no estimuladas, así como las condiciones de PMA /ionomicina estimuladas (Fig 2C). Por tanto, consideramos la CD24 + CD38 + fracción como el subconjunto principal de IL-10 de producción de células B. Dentro de la H
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grupo infectado con, los sujetos asintomáticos tuvieron mayor porcentaje de células IL-10 que expresan CD24 en + CD38 + B células que los sujetos sanos, mientras que H
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infectados pacientes obesos tenían menores células IL-10 que expresan CD24 en + CD38 + B células de pacientes asintomáticos (Figura 2C). Luego multiplicamos la frecuencia de IL-10 + células en el CD24 + CD38 + B células con el porcentaje de CD24 + CD38 + células en el total de células B para obtener el "número" de las células IL-10 que expresan en las células B, y se encontró que ambos H
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infectados por sujetos asintomáticos y sujetos fumadores tenían niveles más altos de IL-10 + B células que los sujetos sanos (P < 0,001 y P < 0,01, respectivamente). Dentro de la H
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infectados grupo, el tabaquismo y la obesidad redujeron significativamente las frecuencias de IL-10 B + células (P < 0,001 para ambos).
de sujetos asintomáticos
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infectados sujetos asintomáticos. El tabaquismo y la obesidad reducen IL-10 expresión en CD24 + CD38 + B células.
H
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infectados por sujetos asintomáticos tenían más actividad tolerogénico mediada por CD24 + CD38 + B células que fumar y en obesos
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: infección. CD4 + T células co-cultivadas con autólogo CD24 + CD38 + - células B agotados habían elevado significativamente la producción de IL-2, IL-17, IFN-g y TNF-a, de CD4 + células T con las células B cocultured enteros, en H
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pacientes infectados asintomáticos (Figura 3A). En fumadores y los obesos, no se observó tal efecto. Del mismo modo, CD8 + células T de H
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infectados sujetos asintomáticos co-cultivadas con autólogo CD24 + CD38 + - células B agotamiento mejorado significativamente IFN-g y TNF-a la secreción de los co-cultivadas con células B enteros ( Fig 3B). Una vez más, este efecto no se observó en los sujetos fumadores y los obesos. La supresión de la expresión de citoquinas de células T parece estar mediado por CD24 + CD38 + células B, ya que la producción más baja de citoquinas se observó en las células CD4 + y CD8 + T células co-cultivadas con CD24 + CD38 + B células solas. En conjunto, estos datos demuestran que el CD24 + CD38 + B en células H
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sujetos infectados suprimen CD4 + T cell producción de citoquinas pro-inflamatorias + y CD8 en H
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infectados sujetos asintomáticos. El tabaquismo y la obesidad inhiben las acciones de regulación de CD24 + CD38 + B células.
IL-10 secreción de las células CD24 + CD38 + B cuando H
. estimulación pylori
en diferentes materias
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sujetos infectados. la producción de IL-10 es fundamental para la función de las células B reguladora [12,13]. señalización de los receptores Toll-like es un mecanismo de regulación positiva de IL-10 en las células B grandes, y se demostró que modulan la expresión de citoquinas en H
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