Abstrakt
Helicobacter pylori Henvisning:. Li G, Wulan H, Song Z, Paik PA, Tsao ML, Goodman GM, et al. (2015) om regulering B-celle funktion undertrykkes af rygning og fedme i H Redaktør: Masaru Katoh, National Cancer Center, JAPAN Modtaget: Februar 3, 2015; Accepteret: 13 Juli 2015; Udgivet: 30 Juli 2015 Copyright: © 2015 Li et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret finansiering:.. forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser Introduktion Helicobacter pylori (H For nylig rolle tolerance- inducerende B-celler er blevet karakteriseret i en række infektionssygdomme og autoimmune sygdomme [12]. Hos mus, CD1d hiCD5 er fundet + B celler til at hjælpe med at etablere toleranceudviklende miljø i væv og har en rolle i forebyggelsen af autoimmune induktion [13]. Hos mennesker, CD19 + CD24 hiCD38 hi B-celler har lignende tolerance-fremkaldende rolle i raske samt HBV-inficerede individer [14]; indtræden af autoimmun sygdom er korreleret med tab af regulatorisk funktion i denne B-celle delmængde [15]. IL-10 er et pleiotropisk immunregulerende cytokin der er i stand til at inhibere en række pro-inflammatoriske cytokiner, herunder IL-2, IL-17, IFN-g og TNF-a, og er vist at kraftigt undertrykke antigenpræsenterende kapacitet antigenpræsenterende celler [16]. Centralt for alle tolerancekrav-inducerende B-celle delmængder, IL-10-produktion er afgørende til B cellemedieret regulering til undertrykkelse T-cellemedieret inflammation [12,17]. Rolle B-celle-medieret regulering i H I denne undersøgelse analyserede vi profil B-celle sammensætning og cytokin udtryk i H Undersøgelse emner Primære perifere blodprøver blev opnået fra 55 H Perifere mononukleære blodceller (PBMC'er) blev isoleret fra perifere blodprøver med standard Ficoll-Hypaque procedure og straks nedfrosset ved -150 ° C indtil anvendelse eller anvendes til forsøg straks, hvis noteret. Regulært dyrkningsmedium er RPMI-1640 suppleret med 10% føtalt bovint serum, 5 ml 100 U penicillin /0,1 mg /ml streptomycin og 5 ml 2 mM L-glutamin. Celler blev dyrket i 5% CO 2 ved 37 ° C i den angivne periode. T og B-celler blev isoleret ved hjælp af human T-celle eller B-celle Negativ Selection Kit (StemCell, Vancouver, Canada), efter protokoller, som fabrikanten. De renheder på T- og B-celle isoleringer var større end 94% ved flowcytometri. For udtømning af CD24 + CD38 + B celler i nogle eksperimenter blev oprensede B-celler farvet med PE-anti-humant CD24 og APC anti-humant CD38 i 30 min. Cellerne blev derefter sendt til at leve cellesortering og CD24 + CD38 + celler blev depleteret. I B-celle-indstillingen helhed, blev de samlede B-celler sendt til at leve cellesortering uden antistofferne Flowcytometri Følgende anti-humane monoklonale antistoffer blev anvendt:. IL-10, TNF a (eBioscience, San Diego, CA, USA); CD3, CD4, CD19, CD20, CD21, CD24, CD27, CD38 (Biolegend, San Diego, CA, USA); IFN-g (BD Biosciences, San Jose, CA, USA); CD8 (Invitrogen, Grand Island, NY, USA). Oprenset humant IgG (Biolegend, San Diego, CA, USA) blev anvendt til at blokere Fc-receptorer, når farvning populationer indeholdende B-celler. Til nogle eksperimenter, phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA, Sigma), ionomycin (Sigma, Munchen, Tyskland), eller varmedræbt H IL-2, IL-17, IFN-g, TNF-a og IL-10 fra T-celler og B-celler blev kvantitativt målt ved multiplex Luminex assay efter protokoller, som producent med modifikationer (EMD Millipore, Etobicoke, Canada). I alt 2x10 5 T-celler og /eller B-celler blev udpladet i hver brønd af 96-brønds plade (Corning, Tewksbury, MA, USA). For B-celle stimulation, varme-dræbt H D'Agostino og Pearson omnibus normalitet test blev anvendt til at undersøge, om de data, der normalt blev uddelt. Envejs variansanalyse (ANOVA) blev anvendt til sammenligninger mellem flere grupper efterfulgt af Dunns test. Students t-test blev anvendt til sammenligninger mellem to grupper. Hvis datasæt væsentligt afveg fra normalfordeling blev parametriske tests anvendt. Alle statistiske analyser blev udført under anvendelse af Prism (GraphPad Software). P < 0,05 blev betragtet som signifikant. Resultaterne blev vist som gennemsnit ± standardfejl. H For at analysere de potentielle ændringer i rollen som B-celle responser i H Cirkulerende B-celler i det perifere blod hos raske forsøgspersoner er sammensat af primært IgD + CD27 - naive B-celler og CD21 + CD27 + hvilende B-hukommelsesceller, mens i kroniske infektioner, er der ofte et fald i naive B-celler og hvilende B-hukommelsesceller, og en stigning i CD21 lo aktiverede B-celler og CD24 + CD38 + B-celler [15,18]. Vi undersøgte først sammensætningen af cirkulerende B-celler i H Tidligere blev B-celler sig at forstærke eller undertrykke immunreaktioner gennem produktion af en række cytokiner med forskellige funktioner, herunder for- inflammatoriske cytokiner såsom IL-2, IL-4, IL-6, IL-12, IFN-g og TNF-a, samt IL-10 og transformerende vækstfaktor beta (TGF-b) som regulatoriske cytokiner [19] . Her undersøgte vi cytokin udtryk for B-celler i forsøgspersoner. Vi fandt, at ex vivo CD24 + CD38 + B celler har regulatoriske funktioner i andre undersøgelser og havde interessante ekspressionsniveauerne i forskellige H Alle sammen, disse data viste, at lovgivningsmæssige cytokin IL-10 primært er produceret af CD24 + CD38 + B-celler og forøges i H Regulatory B-celler var kendt for at hæmme T-celle responser i kroniske infektioner, såsom hepatitis B-infektion og human immundefekt virus-infektion [14,20], ved at etablere tolerogenisk miljø gennem IL-10 forud for induktion af inflammation [15,21]. Vi undersøgte, om IL-10-producerende CD24 + CD38 + B celler havde lignende regulerende virkninger i H Vi næste søgte at undersøge mekanismen af IL-10 opregulering i B-celler i H
infektion forekommer i mere end halvdelen af verdens befolkning og er den vigtigste årsag til gastrisk cancer. En række livsstil og ernæringsmæssige faktorer, såsom tobaksrygning og fedme, har vist sig at hæve risikoen for udvikling af kræft. I denne undersøgelse, vi søgte at bestemme de immunologiske aspekter under H
. pylori
infektion og mavekræft udvikling. Vi fandt, at B-celler fra H
. pylori
inficerede patienter præsenterede ændret sammensætning og funktion i forhold til ikke-inficerede patienter. IL-10-udtrykkende CD24 + CD38 + B celler blev opreguleret i H
. pylori
inficerede patienter, indeholdt potent regulatorisk aktivitet i hæmme T-celle pro-inflammatorisk cytokin sekretion, og reagerede direkte til H
. pylori
antigen stimulation. Interessant nok i H
. pylori
inficerede ryger fag og overvægtige personer, antallet af IL-10 + B celler og CD24 + CD38 + B-celler blev reduceret i forhold til H
. pylori
inficerede asymptomatiske forsøgspersoner. Regulatoriske funktioner medieret af CD24 + CD38 + B-celler blev også svækket. Desuden havde gastrisk cancer positive patienter reducerede IL-10-producerende B-celle frekvenser efter H
. pylori
-stimulation. Tilsammen antyder disse data at i H
. pylori
-Infektion, CD24 + CD38 + B-celle opreguleres og spiller en rolle i at undertrykke pro-inflammatoriske reaktioner, eventuelt gennem IL-10 produktion, en funktion, der ikke blev observeret i rygning og overvægtige patienter
. pylori
inficerede Fag og er korreleret med øget risiko for mavekræft. PLoS ONE 10 (7): e0134591. doi: 10,1371 /journal.pone.0134591
. pylori)
er en slags gramnegative patogene bakterier fundet i mere end halvdelen af verdens befolkning og fortrinsvis hæmmer den øvre mavetarmkanal, herunder maven epitel og duodenum tarmkanalen [1,2]. Selv om langt størstedelen (> 80%) af infektioner er asymptomatiske, vil 10-20% smittede forsøgspersoner udvikle mavesår, mens 1-2% vil få mavekræft [3]. Den præcise mekanisme for udvikling af kræft som følge af H
. pylori
infektion er ikke veldefineret, men kronisk ubehandlet betændelse i den øvre mavetarmkanal antages at bidrage til fortsat beskadigelse af maven epitel [4,5]. Specifikt inflammationsassocieret signalmolekyler, såsom tumornekrosefaktor-alfa (TNF-a), har vist sig at fremme gastrisk tumorgenese og opreguleres i H
. pylori
infektion [6]. Andre pro-inflammatoriske cytokiner, der udskilles af T-celler, inklusiv IL-2, IL-17 og interferon gamma (IFN-g), er også opreguleret i H
. pylori
infektion og er forbundet med øget risiko for gastrisk tumorigenese [7-10]. En række andre faktorer, såsom vedvarende udsættelse for tobaksrygning og fedme, er positivt korreleret med øget gastrisk kræftrisiko, selvom den underliggende mekanisme er uklar [3,11].
. pylori
infektion og efterfølgende induktion af mavekræft, blev dog ikke tidligere undersøgt.
. pylori
inficerede fag. Øget procentdele af CD24 + CD38 + B-celler og reducerede procentdele af naive B-celler og hvilende memory B-celler blev fundet i H
. pylor
i-smittede forsøgspersoner. Den CD24 + CD38 + B-celler i H
. pylori-inficerede forsøgspersoner havde
øget procentdel af IL-10 produktion, og havde undertrykt pro-inflammatorisk cytokin udtryk, når co-dyrket med autologe T-celler. H
. pylori-s
timulated CD24 + CD38 + B-celler fra H
. pylori
smittede forsøgspersoner potent udskilles IL-10. Interessant, H
. pylori-inficerede rygning
fag og overvægtige subects havde sænket niveauer af CD24 + CD38 + B-celler. Derudover CD24 + CD38 + regulatoriske B-celler i rygning og fede personer viste sig at udvise tab af undertrykkende funktion, når samdyrket med autologe T-celler og stimulerede reducerede niveauer af IL-10 efter direkte H
. pylori
stimulation. Endvidere i rygning og fede patienter, som senere udviklede mavecancer, hyppighederne af IL-10-secernerende B-celler blev yderligere reduceret, sammenlignet med de emner, som ikke udviklede mavecancer. Tilsammen viste disse data, at CD24 + CD38 + B celler blev opreguleret i H
. pylori
inficerede og havde funktionelt undertrykt T-celle inflammatorisk cytokin produktion. Den CD24 + CD38 + B-celler i rygning fag og overvægtige personer, dog var refraktære over for H
. pylori
-stimulation, produceret mindre IL-10, og manglede undertrykkende kapacitet.
Materialer og metoder
. pylori
inficerede sår-fri patienter, heraf 15 primære forbrugere af tobaksrøg og 15 klasse I fede (30 kg /m 2 < BMI < 35 kg /m 2 ) fag, samt 15 raske H
. pylori
-uninfected ulcus-fri individer. Personer med kronisk udsættelse for passiv rygning, blev udelukket fra undersøgelsen. Ingen signifikante forskelle med hensyn alder, køn og tidligere infektion historie mellem studiegrupper blev fundet. Alle emner blev fulgt i 5 år for status kræft udvikling. Alle emner var ubeslægtede individer fra Henan provinsen og dens omgivende region. Patienterne blev rekrutteret mellem Jan 2008 og Dec 2013 fra Den 155. Central Hospital PLA i Kina. Controls var kræft-fri individer tilfældigt udvalgte fra et fællesskab kræft-screening program for tidlig påvisning af kræft udført i de samme områder i samme periode patienterne blev rekrutteret. Svarprocenten for både kontroller og sager var 95%. Kriterierne for raske kontrolpersoner udvælgelse inkluderet kræft-fri individer og frekvens matching til tilfælde efter køn og alder (± 5 år). Ved rekruttering blev skriftligt informeret samtykke opnået fra hver underlagt og personlige data såsom køn, alder, vægt, højde og tobaksrygning blev indsamlet via et spørgeskema. Ikke alle forsøgspersonernes prøver blev anvendt i alle forsøg på grund af ufuldstændig patient compliance og utilstrækkelige celler hos nogle patienter. Denne undersøgelse blev godkendt af Institutional Review Board af The 155. Central Hospital i PLA.
Prøveforberedelse
Cell isolation
. pylori
(Sigma, München, Tyskland) blev anvendt til at stimulere cellerne. GolgiStop og GolgiPlug sattes 6h før cellehøst til intracellulær farvning af IL-2, IL-17, IFN-g, TNF-a, og IL-10. FlowJo blev anvendt til flowcytometrianalyse.
Luminex-assay
. pylori
blev tilsat til B-cellerne, som blev udpladet i bunden af en 96-brønds transwell plade (Corning, Tewksbury, MA). For T-celle stimulation, den nederste del af transwell pladen var præinkuberet med anti-human CD3 (klon OKT3) natten over og vasket, hvorefter renset T-celler blev overført til pladen. Humane cytokin indfangende antistof perler blev tilsat til det øvre kammer af 96-brønd Transwell plade. Tolv timer senere blev perlerne høstet, vasket og læses i overensstemmelse med producentens protokol.
Statistisk analyse
Resultater
. pylori
inficerede forsøgspersoner havde ændret cirkulerende B-celle sammensætning
. pylori
infektion, og hvordan det kan være påvirket af rygning og fedme, 15 raske H
. pylori
-uninfected ( H
. pylori
-uninfected) frivillige, 20 H
. pylori
inficerede asymptomatiske røgfri ikke-overvægtige (asymptomatisk) fag, 15 H
. pylori
inficerede rygning ikke-overvægtige (rygning) emner, og 15 H
. pylori
inficerede røgfri overvægtige (fede) forsøgspersoner blev rekrutteret til denne undersøgelse. De demografiske og kliniske data blev opsummeret i tabel 1.
. pylori
inficerede fag. Perifere mononukleære blodceller (PBMC'er) blev farvet for overflademarkør ekspression direkte ex vivo
(Fig 1A). Vi fandt, at sammenligne med H
. pylori
-uninfected raske forsøgspersoner, alle H
. pylori
inficerede grupper indeholdt lavere procentdele af IgD + CD27 - naive B-celler (P < 0,001 for alle, Fig 1B og 1C). De procentdele af CD21 + CD27 + hvilende B-celler hukommelse blev reduceret i H
. pylori
inficerede ryger fag og overvægtige sammenlignet med raske forsøgspersoner (P < 0,001 for begge), og procentdelen af CD21 + CD27 + B-celler i overvægtige personer blev reduceret i forhold til H
. pylori
inficerede asymptomatiske forsøgspersoner (P < 0,01). Interessant, de procentdele af CD24 + CD38 + B celler blev varieret mellem forskellige grupper af H
. pylori
inficerede fag. H
. pylori
inficerede asymptomatiske forsøgspersoner indeholdt meget højere procentdele af CD24 + CD38 + B celler end raske kontroller (P < 0,001). Procentdelen af CD24 + CD38 + B celler blev reduceret i rygere sammenlignet med i asymptomatiske forsøgspersoner (P < 0,05), men stadig højere end hos raske forsøgspersoner (P < 0,001). Hos overvægtige forsøgspersoner, procentdelen af CD24 + CD38 + B-celler var ikke signifikant forskellig fra den hos raske forsøgspersoner, men blev reduceret fra at i asymptomatiske forsøgspersoner (P < 0,001)
. pylori
inficerede forsøgspersoner havde ændret B-celle cytokin udtryk profil
ekspression af IL-2 blev IFN-g og TNF-a ved B-celler forøget i H
. pylori
-inficerede ryger fag og overvægtige end hos raske forsøgspersoner (Fig 2A). Ingen signifikante forskelle blev fundet i TGF-b udtryk.
. pylori
inficerede grupper (Fig 1C). Vi undersøgte den intracellulære cytokin udtryk af CD24 + CD38 + B-celler. Som vist i fig 2B, cytokin ekspression af CD24 + CD38 + B celler var forskellige fra ikke-CD24 + CD38 + B-celler (total B-celler minus CD24 + CD38 + B-celler) ved, at de ikke producere høje niveauer af IFN-g og TNF-a, når de stimuleres med PMA /ionomycin, men udtrykte meget høje niveauer af IL-10, både under ikke-stimulerede og stimulerede betingelser. Vi sammenlignede produktionen af IL-10 fra forskellige B-celle delmængder og fundet, at CD24 + CD38 + B-celler i alle studiegrupper secerneres meget højere IL-10 end ikke-CD24 + CD38 + B-celler, både under stimulerede forhold samt PMA /ionomycin stimulerede forhold (fig 2C). Vi betragter således den CD24 + CD38 + fraktion som den vigtigste IL-10-producerende B-celle delmængde. Inden for H
. pylori
inficerede gruppe, asymptomatiske forsøgspersoner havde højere procentdel af IL-10-udtrykkende celler i CD24 + CD38 + B-celler end raske forsøgspersoner, mens H
. pylori
inficerede overvægtige patienter havde lavere IL-10-udtrykkende celler i CD24 + CD38 + B celler end asymptomatiske patienter (Fig 2C). Vi multipliceret derefter frekvensen af IL-10 + -celler i CD24 + CD38 + B-celler med procentdelen af CD24 + CD38 + -celler i den samlede B-celler til opnåelse af den "nummer" af IL-10-udtrykkende celler i B-celler, og konstateret, at både H
. pylori
inficerede asymptomatiske forsøgspersoner og rygning fag havde højere niveauer af IL-10 + B-celler end raske forsøgspersoner (P < 0,001 og P < 0,01, henholdsvis). Inden for H
. pylori
inficerede gruppe, rygning og fedme markant sænket frekvenserne af IL-10 + B-celler (P < 0,001 for begge). fra asymptomatiske forsøgspersoner
. pylori
inficerede asymptomatiske forsøgspersoner. Rygning og fedme reducerede IL-10-ekspression i CD24 + CD38 + B celler.
H
. pylori
inficerede asymptomatiske forsøgspersoner havde mere tolerogenisk aktivitet medieret af CD24 + CD38 + B-celler end rygning og overvægtige
. pylori
-Infektion. CD4 + T-celler co-dyrket med autologe CD24 + CD38 + - fjerner B-celler havde signifikant forhøjede produktionen af IL-2, IL-17, IFN-g og TNF-a, end CD4 + T-celler dyrket sammen med hele B-celler, i H
. pylori
inficerede asymptomatiske patienter (Fig 3A). Hos rygere og overvægtige forsøgspersoner blev sådan virkning ikke observeret. Tilsvarende CD8 + T-celler fra H
. pylori
inficerede asymptomatiske forsøgspersoner co-dyrket med autologe CD24 + CD38 + - udtømte B-celler væsentligt forbedret IFN-g og TNF-a sekretion end co-dyrket med hele B-celler ( fig 3B). Igen blev sådan virkning ikke observeret i rygning fag og overvægtige patienter. Undertrykkelsen af T-celle cytokin-ekspression synes at være medieret af CD24 + CD38 + B-celler, idet der blev observeret laveste cytokinproduktion i CD4 + og CD8 + T-celler co-dyrket med CD24 + CD38 + B-celler alene. Tilsammen viste disse data, at CD24 + CD38 + B-celler i H
. pylori
inficerede emner undertrykt CD4 + og CD8 + T-celle pro-inflammatorisk cytokin produktion i H
. pylori
inficerede asymptomatiske forsøgspersoner. Rygning og fedme hæmmede reguleringsindgreb af CD24 + CD38 + B celler.
IL-10-sekretion af CD24 + CD38 + B-celler efter H
. pylori
stimulering i forskellige fag
. pylori
inficerede fag. IL-10 produktion er afgørende for regulatorisk B-celle funktion [12,13]. Toll-like receptor signalering er en større IL-10-opregulering mekanisme i B-celler, og blev vist at modulere cytokin-ekspression i H
. pylori