PLOS ONE: PKG II inhibitions EGF /EGFR induite par la migration de cancer gastrique Cells

Résumé

Contexte

Les résultats de nos recherches antérieures ont montré que la protéine kinase dépendante de type II GMPc (PKG II) pourrait bloquer l'activation du récepteur épidermique de facteur de croissance épidermique (EGFR) et par conséquent inhiber la prolifération et de la MAPK /ERK médiée par la transduction du signal apparenté de l'estomac lignée cellulaire de cancer BGC-823, suggérant que la PKG II pourrait inhiber d'autres voies de signalisation de l'EGFR déclenchée et est associée activités biologiques des cellules de cancer gastrique. Ce document a été conçu pour étudier l'inhibition potentielle de PKG II sur EGF /activité de migration induite par l'EGFR et les voies de transduction du signal liées.

Constatations Méthodologie /Principales

Dans la lignée cellulaire de cancer gastrique AGS, l'expression et l'activité de PKG II ont été augmentées en infectant les cellules avec adenoviral codant pour la PKG II construction d'ADNc (Ad-PKG II) et le traitement des cellules avec du GMPc analogique-8 Pcpt-GMPc. Phosphorylation de protéines a été détectée par Western blot et de petites G Ras protéine active et Rac1 a été mesurée par la méthode "pull-down". l'activité de migration cellulaire a été détectée avec un équipement trans-bien. Reliure entre PKG II et EGFR a été détectée avec Co-IP. Les résultats ont montré EGF stimulé la migration des cellules AGS et l'effet était lié à PLCγ1 et les voies de transduction du signal ERK-médiée. PKG II activité de migration et inhibée induite par l'EGF bloqué EGF-initié la transduction du signal de PLCγ1 et MAPK /ERK voies de médiation en empêchant Tyr 992 induite par l'EGF et Tyr 1068 phosphorylation de l'EGFR. PKG II lié avec l'EGFR et a causé la thréonine phosphorylation de celui-ci.

Conclusion /Importance

Nos résultats confirment systématiquement l'inhibition de la PKG II sur la migration induite par l'EGF et la transduction du signal connexe de PLCγ1 et MAPK /les voies ERK médiée, ce qui indique que la PKG II a une inhibition de fargoing sur EGF /EGFR liés à la transduction du signal et les activités biologiques des cellules de cancer gastrique à travers phosphorylant EGFR et bloquant l'activation de celui-ci

. Référence: Jiang l, Lan T , Chen Y, Sang J, Li Y, Wu M, et al. (2013) PKG II inhibitions EGF /EGFR induite par la migration des cellules de cancer gastrique. PLoS ONE 8 (4): e61674. doi: 10.1371 /journal.pone.0061674

Editeur: Vladislav V. Glinskii, Université de Missouri-Columbia, États-Unis d'Amérique

Reçu: 30 Septembre 2012; Accepté 12 Mars 2013; Publié le 16 Avril, 2013 |

Droit d'auteur: © 2013 Jiang et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Financement:. Cette étude a été soutenu par la national science Foundation naturel de la Chine, No.81272755, No.31040002, No.81001100 et No.31100974; La subvention de l'innovation de l'Université du Jiangsu. Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Introduction

type protéines kinases II dépendante du GMPc (PKG II) est une sérine /thréonine kinase et des données de recherche d'accumulation indiqué que cette kinase a un rôle important dans la régulation de l'activité des cellules biologiques telles que la prolifération et l'apoptose, en particulier dans les cellules tumorales . En 2004, Cook et al
trouvé que PKG II pourrait induire l'apoptose des cellules humaines stromales prostatiques culture [1]. En 2009, Swartling et al
a rapporté que la PKG II a inhibé la prolifération des cellules de neurogliome humain et l'inhibition est liée à la diminution de l'expression du facteur de transcription Sox9 et la phosphorylation de Akt [2]. En 2011, Fallahian et al, a trouvé que le GMPc pourrait induire l'apoptose des cellules cancéreuses du sein et cet effet était lié à PKG II [3]. Au cours de nos recherches, nous avons découvert que l'expression et l'activité de PKG II dans des lignées cellulaires de cancer gastrique humain était significativement plus faible que celle des cellules de muqueuse gastrique normale [4]. Une étude plus approfondie dans notre laboratoire ont montré que la PKG II pourrait inhiber la prolifération de lignées cellulaires de cancer gastrique et le bloc EGF signal induit une transduction de MAPK /ERK médiée par la prévention de l'activation de l'EGFR par l'EGF [5], [6]. Depuis l'activation de l'EGFR peut initier plusieurs voies de transduction du signal dont MAPK /ERK, PI3K /Akt, JAK /STAT et voies PLCγ1 médiation [7], [8], l'effet de blocage des PKG II sur l'activation de l'EGFR suggère que cette enzyme peut avoir un effet inhibiteur large gamme sur la transduction du signal et les activités biologiques connexes de cellules de cancer gastrique. Ce document a été conçu pour confirmer cet effet inhibiteur large gamme de PKG II à enquêter sur l'inhibition de la PKG II sur l'activité de la migration induite par l'EGF et la transduction du signal lié dans les cellules de cancer gastrique.

Résultats

PKG II inhibitions EGF induit la migration des cellules qui est associée à la transduction du signal PLCγ1 et MAPK /ERK-médiée

la migration des cellules de Pathways est important dans la physiologie normale et dans la maladie. L'acquisition de la capacité migratoire de cellules cancéreuses est une caractéristique qui contribue à la propagation des cellules tumorales métastatiques aux organes distants. Des données récentes ont montré que l'EGF pourrait stimuler la migration des cellules cancéreuses. Le mécanisme par lequel EGF stimule la migration des cellules ne sont pas claires, mais certaines données indiquent que l'EGF peut le faire en lançant la transduction du signal PLCγ1 et MAPK /ERK voies de médiation. Dans cette expérience, nous avons détecté l'effet de la migration de stimulation de l'EGF dans les cellules AGS et utilisé inhibiteur des composants clés dans les voies de signalisation pour enquêter sur la possible transduction de signal associé à l'effet. Les résultats ont montré que le traitement EGF augmente l'activité de migration des cellules AGS et les deux MEK (composante clé de MAPK /ERK médiée) inhibiteur U0126 et PLCγ1 inhibiteur U73122 inhibition induite par l'EGF de migration, ce qui indique que l'EGF stimule l'activité de migration cellulaire par l'activation à la fois MAPK /ERK et PLCγ1 signaux médiée par les voies de transduction (Fig. 1).

PKG II Blocks EGF induit Tyr 992 et Tyr 1068 phosphorylation de l'EGFR

Lorsque EGF se lie avec l'EGFR, il provoque auto- la phosphorylation du récepteur. Il existe plusieurs sites d'auto-phosphorylation qui sont reliés à différents voie de transduction du signal. Tyrosine 992 et 1.068 Tyrosine sont parmi les sites d'auto-phosphorylation de l'EGFR et sont associés à médiation par PLCγ1 et de signalisation MAPK /ERK médiée respectivement. Dans cette expérience, nous avons étudié l'effet inhibiteur de la PKG II sur la phosphorylation de la tyrosine 992 et 1.068 Tyrosine de l'EGFR dans les cellules AGS différemment traitées à l'aide de Western Blot. Les résultats ont montré que le traitement EGF a provoqué une augmentation de 14 plis de la Tyrosine 992 et une augmentation de 8 plis de la Tyrosine 1068 phosphorylation de l'EGFR. Dans les cellules infectées avec Ad-PKG II et stimulées par le GMPc, la phosphorylation a été diminué de manière significative (fig. 2, 3). Ceci indique que PKG II pourrait empêcher Tyrosine 992 induite par l'EGF et Tyrosine 1068 phosphorylation de l'EGFR et inhibent par conséquent PLCγ1-médiée et MAPK /ERK-médiée.

PKG II Prévient EGF déclenché par les événements principaux de PLCγ1 médiée

(1) activation PLCγ1 de transduction de signal Pathway.

PLCy est le composant en aval de tyrosine kinases de récepteur (RTK). Il dispose de deux isoformes: PLCγ1 est ubiquitaire distribué et PLCγ2 est exprimé principalement dans les cellules hématopoïétiques. L'activation de PLCγ1 nécessite son recrutement à la membrane et d'association, par son domaine SH2 avec activé RTK tels que EGFR. Cette association entraîne la phosphorylation de PLCγ1 sur les résidus de tyrosine, en particulier sur la tyrosine 783, et une augmentation de son activité enzymatique. Nous avons appliqué la méthode IP pour isoler PLCγ1 et ensuite utilisé la méthode de Western blot pour détecter la phosphorylation de PLCγ1. Les résultats ont montré que le traitement EGF a provoqué une augmentation évidente de Tyr783 phosphorylation de PLCγ1 et l'augmentation de l'activité PKG II à infecter les cellules avec Ad-PKG II et la stimulation des cellules avec du GMPc efficacement empêché la phosphorylation induite par l'EGF de PLCγ1 (Fig. 4 ).

(2) la formation DAG.

Une fois qu'il est activé, PLCγ1 peut catalyser l'hydrolyse du phosphatidylinositol 4,5-BISPHOS-phate (PI-4,5P _{2) dans l'inositol 1,4,5-triphosphate (IP 3) et diacylglycérol (DAG), deux molécules qui régulent la mobilisation intracellulaire de Ca ^{2+ et l'activité de la protéine kinase C, respectivement. Pour observer les effets de l'EGF et PKG II sur la formation de DAG, la méthode ELISA a été utilisé pour détecter la concentration DAG dans les cellules AGS. Les résultats ont montré que l'EGF stimule les cellules AGS, le taux de DAG augmente évidemment et avant l'infection par Ad-PKG II et traitement par 8p-CPT-GMPc a inhibé la formation de DAG provoquée par une stimulation par l'EGF (Fig. 5).}}

(3) Ca ^{2+ libérant.}

IP3 et DAG sont des seconds messagers dans la voie de transduction du signal PLCγ1 médiée. IP3 est connu pour stimuler la libération de calcium des réserves internes. Nous avons utilisé le calcium indicateur de Fluo-3 /AM pour détecter le calcium dans le cytoplasme. Les résultats ont montré que le traitement EGF a augmenté la libération de Ca ^{2+ du réticulum endoplasmique (RE) au cytoplasme et une expression élevée et l'activité de PKG II inhibe de manière significative la libération, en inversant l'effet du traitement à l'EGF (Fig. 6).}

(4) l'activation de PKCa.

PKCa, une isoforme de la protéine kinase C, est un élément clé de la voie de signalisation médiée par PLCγ1 et peut être activé par Ca ^{2+ et DAG . Être activé, PKCa translocation du cytosol vers la membrane des cellules. Ainsi, la quantité de PKCa sur la membrane représente l'activation de PKCa. Dans cette expérience, nous avons étudié l'effet inhibiteur de la PKG II sur l'activation de la PKCa dans les cellules AGS différemment traitées à l'aide de Western Blot. Les résultats montrent que dans les cinq minutes après l'addition du EGF au milieu de culture, la translocation de PKCa du cytosol à la membrane a augmenté de façon spectaculaire et la translocation a été inhibée par pré-infecter les cellules avec Ad-PKG II, ainsi que le traitement avec 8 Pcpt-GMPc ( Fig. 7).}

(5) activation de CaMKIIα.

les études sur la régulation de Ca ^{2 + /calmoduline (CaM) dépendante kinase II alpha (CaMKIIα), qui est une isoforme primaire de CaMKII, ont suggéré que lorsque Ca 2 + /CaM se lie avec CaMKIIα, autophosphorylation intra-moléculaire se produit et la phosphorylation maintient l'activation persistante de l'enzyme. L'anticorps contre la phospho-CaMKIIα (Thr286) a été appliqué dans un Western blot pour détecter la phosphorylation de CaMKIIα. Les résultats ont montré que, dans cellules AGS traitées avec l'EGF, Thr286 phosphorylation de CaMKIIα a augmenté de près de 2,5 plis et l'infection par Ad-PKG II, ainsi que le traitement avec 8 Pcpt-GMPc a inhibé l'augmentation de la phosphorylation induite par l'EGF (Fig. 8).}

activation PKG II inhibitions EGF-induite des éléments clés de MAPK /ERK médiée

(1) activation de transduction de signal Pathway de MAPK /ERK.

MAPK /ERK est l'élément clé de la voie MAPK /ERK-médiée. Phosphorylation à la fois des résidus de ERK1 et thréonine 185 et la tyrosine 187 résidus de ERK2 thréonine 202 et la tyrosine 204 est requise pour l'activation enzymatique complète. L'anticorps dirigé contre p-ERK1 /2 (Thr 202 /Tyr 204) a été appliqué dans un Western blot pour détecter la double phosphorylation de ERK. Les résultats montrent que dans les cinq minutes après l'ajout de l'EGF dans un milieu de culture cellulaire, la phosphorylation de ERK1 /2 dans les cellules AGS a augmenté de façon spectaculaire (10 plis), et la phosphorylation a été inhibée par pré-infecter les cellules avec Ad-PKG II et l'activation de l'enzyme avec 8-PCPT-cGMP (Fig. 9).

(2) L'activation de ras.

Petite protéine G Ras est un autre élément clé dans MAPK /ERK voie de signalisation médiée. Il a deux formes dans les cellules: forme active liée au GTP et forme inactive PIB lié. Une fois que Ras est sous forme de GTP, il peut lier et activer Raf-1 et commencer les activations consécutives de sérine /thréonine kinases dans la voie de signal. Nous avons appliqué la méthode "pull-down" pour détecter la Ras activée. Le résultat a montré que l'ajout d'après l'EGF dans le milieu de culture, Ras active dans les cellules AGS a augmenté visiblement en cinq minutes. Infectant les cellules avec Ad-PKG II et les stimulant avec 8-PCPT-cGMP avant d'ajouter de manière significative EGF a empêché l'activation Ras induite par l'EGF (Fig. 10).

Activation PKG II inhibitions EGF-induite de RAC1

petite protéine G RAC1 est l'élément principal de la famille Rho qui jouent un rôle important dans la régulation de la migration des cellules cancéreuses. Les deux PLCγ1 et MAPK /ERK la transduction du signal peut activer RAC1 et stimuler ensuite la migration cellulaire. Pour confirmer davantage l'effet inhibiteur de la PKG II signalisation EGF /EGFR induite qui est liée à la migration, la méthode «pull-down» a été appliqué pour détecter l'inhibition de la PKG II lors de l'activation RAC1. Le résultat a montré que le traitement EGF a provoqué une augmentation évidente de RAC1 active et une forte activité de PKG II efficacement inhibé l'activation de RAC1 (Fig. 11). Cette condition une preuve supplémentaire de l'inhibition de la PKG II sur la migration induite par l'EGF de cellules de cancer de l'estomac.

PKGII Interagir avec EGFR et Causes Thr-phoshporylation du récepteur

Le mécanisme par lequel les blocs PKGII l'activation induite par l'EGF de l'EGFR a été étudiée de façon préliminaire dans cette expérience. La co-immunoprécipitation a été appliquée à la détection de l'interaction entre PKGII et EGFR. buvardage de Western avec des anticorps anti phosphorylation de l'anticorps pan thréonine a été utilisé pour détecter la phosphorylation de l'EGFR thréonine provoquée par PKGII. Les résultats de Co-immunoprécipitation ont montré que dans les cellules AGS infectées par Ad-PKG II et stimulées avec 8-CPT-cGMP, la liaison directe entre PKG II et EGFR a été détectée (Fig. 12, partie A). Les résultats de Western blot ont montré que l'activation de PKG II a causé la thréonine phosphorylation de l'EGFR (Fig. 12, panneau B). Ceci indique que la PKG II a bloqué l'activation de l'EGFR en se liant avec le récepteur et provoquant la phosphorylation de celui-ci.

Discussion

Actuellement, deux protéines kinases dépendant du cGMP (PKGs), PKG I et II PKG , ont été identifiés dans des cellules de mammifères [10], [11]. PKG I est largement distribué dans le corps et en raison de son effet inhibiteur sur la croissance tumorale et l'invasivité et effet inducteur sur l'apoptose des cellules tumorales, il a été identifié comme un suppresseur de tumeur [12]. L'expression de PKG II est plus de tissu restreint [13]. Pendant longtemps, contrairement à l'effet anti-tumeur bien prouvé de PKG I, aucune donnée de recherche clairement indiqué rôle antitumorale de PKG II et cette kinase a été seulement impliqué dans plusieurs fonctions physiologiques, y compris la sécrétion intestinale, la croissance osseuse, et l'apprentissage et mémoire [14]. Cependant, l'intérêt de la recherche sur les PKG II augmente et quelques nouvelles fonctions de PKG II ont été trouvés récemment, y compris le rôle de PKG II dans la régulation du canal sodique épithélial et mécano-transduction du signal [15] - [17]. Plus important encore, les données de recherche d'accumulation a indiqué que la PKG II est liée à la prolifération et de l'apoptose dans certaines cellules, en particulier dans les cellules tumorales, ce qui suggère fortement le rôle potentiel de cette enzyme dans la régulation des activités biologiques des cellules tumorales [1] - [6].

EGFR existe sur la surface de toutes les cellules. Avec un poids moléculaire de 170KD, EGFR a un domaine extracellulaire, un domaine inter-membranaire et un domaine intracellulaire. Le domaine intracellulaire de l'EGFR a 542 résidus d'acides aminés et peut être divisé en sous-domaine membranaire approximative, la tyrosine sous-domaine kinase, et sous-domaine C-terminal [18]. Le processus d'activation de l'EGFR comprend la phosphorylation de la tyrosine de son domaine intracellulaire et différents sites de phosphorylation sur le domaine sont liés à différentes voies de signalisation. Lorsque l'EGFR est activé, il peut recruter des protéines effectrices à son sous-domaine phosphorylée C-terminal et déclenche les voies de protéines effectrices à médiation par [19], [20]. Parmi les sites de phosphorylation de la tyrosine 1068 et 1086 sont liées à la MAPK /ERK médiée et de la tyrosine 992 et 1173 sont liées à la voie de signal à médiation par PLCy [7], [8]. Nos résultats précédents ont montré que PKG II pourrait inhiber induite EGF-tyrosine 1068 phosphorylation de l'EGFR dans la lignée cellulaire de cancer gastrique BGC-823 [6], ce qui soulève la question de savoir si PKG II peut inhiber la phosphorylation d'autres sites de tyrosine sur EGF /EGFR et par la suite ont une large gamme d'inhibition sur EGF /induite par l'EGFR transductions de signaux et des activités biologiques connexes de cellules de cancer gastrique.

Dans cet article, nous avons étudié l'action de PKG II sur l'activité de la migration induite par l'EGF de la lignée cellulaire de cancer gastrique AGS. Le résultat a montré que PKG II avait une inhibition significative de la migration cellulaire provoquée par l'EGF. Cela fournit une preuve supplémentaire pour révéler l'effet inhibiteur de la tumeur de PKG II. Les données de recherche ont montré que parmi les /EGFR lancé des voies de transduction du signal EGF, PLCγ1 et MAPK /ERK signaux médiée par les voies de transduction sont liées à l'activité de migration [21], [22]. Pour confirmer cela, dans des cellules de cancer gastrique, nous avons utilisé un inhibiteur du composant de transduction du signal pour déterminer la participation des MAPK /ERK et les voies médiées par PLCγ1 dans le processus. Les résultats ont montré que l'inhibiteur de MEK et U0126 PLCγ1 inhibiteur U73122 partiellement bloqué par le EGF /EGFR induite par l'activité de migration des cellules AGS, ce qui indique que les deux voies de transduction de signal ont participé au processus de régulation. Pour élucider l'action inhibitrice potentielle de PKG II sur ces voies de transduction du signal, nous avons exploré d'abord l'effet inhibiteur de la PKG II sur EGF initié PLCγ1 médiée voie de transduction du signal. Les résultats ont montré que PKG II a empêché tous les principaux événements de cette voie de transduction du signal, y compris la Tyr 992 phosphorylation /activation de l'EGFR, la phosphorylation /activation de PLCγ1, la formation de second messager DAG, la libération du calcium dans cytoplasme, et l'activation de la PKC et CAMK IIa. Pour l'inhibition de la PKG II sur EGF /EGFR induite par MAPK /voie de transduction ERK-médiée, nos travaux antérieurs ont montré que PKG II inhibe l'activation de tous les composants clés dans la voie induite par l'EGF dans la lignée cellulaire de cancer gastrique BGC-823 [ ,,,0],6]. Dans cet article, nous avons étudié l'effet inhibiteur de la PKG II sur EGF activation /induite par l'EGFR de composants clés dans cette voie. Les résultats ont confirmé que la PKG II a inhibé l'activation induite par EGF de la protéine Ras et MAPK /ERK dans les cellules AGS, suggérant que la PKG II a également inhibé EGF /induite par l'EGFR transduction du signal de MAPK /ERK médiée dans cette lignée de cellules cancéreuses. Ces résultats systématiquement révélé que PKG II a inhibé la migration induite par EGF de cellules de cancer de l'estomac en bloquant EGF /EGFR lancé la transduction du signal PLCγ1 et MAP /voies ERK-médiées.

La transduction du signal des deux PLCγ1 et MAP /ERK voies médiées peuvent activer petite protéine G Rac1, qui est un élément clé dans la régulation de la migration cellulaire [23], [24]. Pour confirmer l'inhibition de la PKG II sur cet événement important dans la migration induite par l'EGF de cellules de gaz, nous avons appliqué la méthode "pull-down" pour vérifier l'activité de Rac1 dans les cellules AGS traités différemment. Les résultats ont montré que lors de la migration induite par l'EGF, Rac1 a été activé et l'activation est liée à la fois PLCγ1 et MAP /ERK signalisation médiée. En outre, PKG II inhibe l'activation induite par l'EGF de Rac 1. Cela confirme en outre l'effet inhibiteur de la PKG II sur EGF /EGFR initié la migration cellulaire.

EGFR est étroitement associée à tumorigenensis. Au cours de l'expression et la mutation de l'EGFR se produire souvent dans la plupart des cancers. Les données de recherche ont montré que plus de 50% -70% des cancers du poumon, le cancer du côlon et le cancer du sein ont une forte expression de l'EGFR [25]. En outre, les patients cancéreux présentant une surexpression de l'EGFR ont en général un mauvais pronostic. Par exemple, EGFR sur-expression a été détectée dans 60% des non-petit cancer du poumon à petites cellules (CPNPC) et le pronostic des patients étaient pauvres, avec une survie de 4-5 mois seulement [26]. in vitro
expériences ont confirmé que la surexpression de l'EGFR a provoqué la transformation du NIH-3T3, Rat-1 et les cellules NRK et en bloquant l'activation de l'EGFR a inhibé la prolifération de certaines cellules tumorales [27]. Par conséquent, l'EGFR est le premier récepteur du facteur de croissance pris comme cible de traitement du cancer. Plusieurs méthodes d'activité de l'EGFR et l'inhibition de la transduction du signal associée, y compris des anticorps spécifiques contre l'EGFR et les inhibiteurs de l'EGFR, ont reçu une recherche intensive [28] - [30]. De nouvelles et plus efficaces méthodes de blocage EGFR médiée par la transduction du signal sera utile dans le traitement du cancer. Par conséquent, la conclusion selon laquelle PKG II peut inhiber l'activation de l'EGFR et la transduction du signal par conséquent a une signification importante. Il suggère fortement que PKG II est un inhibiteur potentiel de l'EGFR endogène et fournira une nouvelle indication sur la stratégie de la thérapie du cancer.

Les données de recherche ont montré que certaines protéines kinases peuvent provoquer la phosphorylation de l'EGFR et affecter son activation et /ou de destination. Par exemple, la protéine kinase C (PKC) peut provoquer la phosphorylation de la thréonine 654 de l'EGFR et régule la liaison du récepteur et l'internalisation [31]. Serine 1046/1047 (Ser1046 /1047) site de phosphorylation est nécessaire pour EGFR désensibilisation dans les cellules EGF traités [32] .Dans nos expériences, nous avons détecté la phosphorylation de Thr654 et Ser1046 /1047 de l'EGFR et a constaté que PKG II n'a pas causé la la phosphorylation de ces sites de phosphorylation. Cependant, nos résultats ont montré qu'il y avait une interaction directe entre PKG II et EGFR et PKG II a causé thréonine phosphorylation de l'EGFR. Ceci indique que la PKG II a bloqué l'activation de l'EGFR en se liant avec le récepteur et phosphorylant. Le site de phosphorylation exacte sera notre prochain objectif.

Cell Line Matériaux et méthodes et réactifs

lignée cellulaire de cancer gastrique humain AGS a été fourni par l'Institut de biologie cellulaire (Shangai, Chine). vecteurs adénoviraux codant β-galactosidase (pAd-LacZ) et PKG II (pAd-PKG II) étaient des cadeaux aimables du Dr Gerry Boss et le Dr Renate Pilz à l'Université de Californie, San Diego, Modifié médias de Eagle USA Dulbecco (DMEM) et sérum de veau fœtal (FBS) provenaient de GIBCO (grand Island, NY). L'anticorps contre PKG II était de Abgent Biotechnology (San Diego, CA). Goat anti-β-actine, souris anti-pan-Ras et de la souris des anticorps anti-PLCγ1 étaient de Santa Cruz (Santa Cruz, CA). De lapin anti-p-EGFR (Tyr1068), de lapin anti-p-EGFR (Tyr992), de lapin anti-EGFR, souris anti-P-ERK (Thr 202 /Tyr 204), de lapin anti-ERK et de lapin anti-p-PLCγ1 (Tyr783) anticorps étaient de Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Rabbit anti-PKCa et de lapin anti-p-CaMK IIa (Thr286) provenaient de Bioworld Technology (St. Louis Park, MN). Lapin anticorps anti-p-Thr était de Abcam (MA, USA) peroxydase .Horseradish (HRP) conjugué à des anticorps secondaires étaient de Jackson Immuno Research Laboratories (West Grove, PA). Le cellulaire cGMP perméable analogique 8-PCPT-cGMP était de Calbiochem (San Diego, CA). EGF, U73122 et U0126 étaient de Sigma (St. Louis, MO). Électrochimiluminescence (ECL) réactifs étaient de Millipore (Billerica, MA). Ca ^{2 + indicateur Fluo-3 /AM et Kit d'extraction de protéines de membrane et cytosol étaient de Beyotime (Jiangsu, Chine). diacylglycérol humain (DAG /DG) ELISA Kit était de Cusabio Biotech Co., Ltd (Newark, DE). Tous les autres réactifs utilisés sont de qualité analytique.}

Préparation des vecteurs adénoviraux

293A cellules ont été transfectées avec adénoviral LacZ vecteur codant pour et PKG II respectivement et cultivées pendant jusqu'à dix jours jusqu'à ce que le CPE a été vu. Les cellules et le milieu de culture ont été récoltés et soumis à trois cycles de congélation-décongélation. Le surnageant contenant les adenovirus (Ad-LacZ et Ad-PKG II) ont été utilisés pour infecter de nouvelles cellules 293A à amplifier adenovirus. Les préparations adénoviraux amplifiés ont été titrés et pfu /ml a été déterminée, et conservés dans -80 ° C jusqu'à utilisation.

Culture cellulaire et infection par

cellules AGS de vecteurs adénoviraux ont été cultivées dans du DMEM fournis avec 10% de FBS et on maintient à 37 ° C dans un incubateur humidifié avec 95% d'air et 5% de CO _{2. Le milieu a été changé tous les deux jours et les cellules ont été sous-cultivées à confluence. Le jour avant l'infection, les cellules ont été fraîchement plantés à 70-80% de confluence, et l'infection par Ad-LacZ et Ad-PKG II a été réalisée.}

Les échantillons de protéines de Western blot ont été soumis SDS-PAGE (8-12%) du gel en fonction de la taille moléculaire de la protéine cible, et une électrophorèse et une membrane de transfert a été réalisée en suivant le protocole du fabricant (Bio-Rad, Hercules, CA). Les anticorps primaires ont été mises en incubation pendant une nuit à 4 ° C dans du TBS-T (2% de Tween-20), et les anticorps secondaires correspondantes ont été mises en incubation pendant 1 h à température ambiante dans du TBS-T (2% de Tween-20), avec trois lavages après chaque incubation. réactifs ECL ont été utilisés pour montrer les bandes positives sur la membrane. Pour effectuer une analyse de densitométrie, des images numériques des bandes positives ont été obtenues avec ChemiDoc XRS et analysées en utilisant l'image programme d'analyse Quantité One (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Les résultats ont été montré que le rapport de la protéine cible /contrôle de chargement

"Pull-down" Analyse d'Active protéine Petit G Ras et Rac1

L'activité de Ras a été détectée avec Pull-down. procédé tel que décrit précédemment [9]. En bref, les cellules se développant sur 100 mm de plaque de culture ont été lavées trois fois avec du PBS froid et lysées par addition de 400 ul de tampon de lyse (HEPES 25 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, 1% de NP40, 10% de glycerol mM, NaF 25 , 10 mM MgCl _{2, désoxycholate de sodium, 0,25% d'EDTA 1 mM, 1 mM de Na 3VO 4, 10 pg /ml d'aprotinine et 10 pg /ml de leupeptine). L'échantillon a été recueilli et centrifugé (14000 g, 4 ° C, 10 min) pour se débarrasser des débris. Le surnageant a été incubé avec des perles et glutathion glutathion-Sepharose S
-transferase-Ras-RBD (TPS-RBD) à 4 ° C pendant 1 h. Les billes ont été lavées 3 fois avec du tampon de lyse et on a chauffé dans de l'eau bouillie pour libérer les protéines. Les échantillons de protéines (contenant Ras actif) ont été analysées par Western blot avec un anticorps contre pan-Ras. Le Rac1 actif a été détecté avec méthode similaire, mais avec le domaine de la TPS-Pak1 protéine de liaison (GST-PBD) et de l'anticorps contre Rac1.}

Immunoprécipitation

Les cellules en croissance sur 100 mm plaque de culture ont été lavées deux fois avec du PBS froid et lysées par addition de 1 ml de tampon RIPA (50 mM de Tris-HCl pH 7,4, 1% de Triton X-100, 1 mM d'EDTA mM, leupeptine 1, 1 mM de fluorure de phénylméthylsulfonyle mM, NaF 10, 1 mM de Na _{3VO 4) par plaque. Les anticorps dirigés contre PLCγ1 et p-PLCγ1 ont été utilisées pour immunoprécipitation. Les précipités ont été sondés avec des anticorps contre les protéines cibles.}

Analyse du calcium dans Cytoplasma

Pour contrôler l'effet de l'EGF et PKG II sur la libération de calcium induite par l'EGF, les cellules AGS ont été chargées avec 5 uM d'une membrane perméable à l'indicateur du calcium Fluo-3-acétoxyméthyl (AM), l'ester pendant 30 min à 37 ° C dans DMEM. Après le chargement, les cellules ont été lavées avec du PBS et mises en suspension dans du DMEM. Les mesures de fluorescence ont été effectuées en utilisant un système confocal Olympus Fluoview-500. Fluo-3 a été excité par la lumière laser d'argon à 488 nm et la fluorescence a été mesurée à des longueurs d'onde de 515 nm.

Test ELISA de DAG

concentrations DAG ont été mesurées par ELISA, selon les instructions du fabricant . Cet essai utilise la technique de dosage immunologique enzymatique en sandwich quantitatif. Un anticorps spécifique de DAG a été pré-revêtu sur une micro-plaque. Normes et échantillons sont pipetés dans les puits et tout DAG présent est lié par l'anticorps immobilisé. Après avoir enlevé toutes les substances non liées, une biotine conjuguée à un anticorps spécifique de DAG est ajouté aux puits. Après le lavage, l'avidine conjuguée à la peroxydase de raifort (HRP) est ajouté aux puits. Après un lavage pour éliminer tout réactif de type avidine-enzyme non lié, une solution de substrat est ajouté dans les puits et une couleur se développe proportionnellement à la quantité de DAG lié dans l'étape initiale. Le développement de la couleur est arrêtée et l'intensité de la couleur est mesurée.

fractionnement subcellulaire

fractionnement subcellulaire dans cytosoliques et membranaires des fractions a été réalisée en utilisant le kit d'extraction de protéines de membrane et de cytosol, selon le fabricant instruction. Des cultures monocouches ont été lavées trois fois avec une solution PBS glacée et grattées dans du tampon d'homogénéisation froid (HB) contenant 20 mM de Tris-HCl (pH 7,4), 4 mM d'EDTA, 2 mM d'EGTA, 10% de glycerol, 10 g /ml de leupeptine, et 1 mM de PMSF. Les cellules ont été lysées par sonication avec des intervalles de 4-15 et une lyse complète a été suivie au microscope. L'homogénat a été soumis à une ultracentrifugation à 86 000 g pendant 45 min à 4 ° C et le surnageant a été désignée comme la fraction cytosolique. Le culot a été remis en suspension dans HB contenant 1% de Triton X-100 et on l'incube sur de la glace pendant 30 minutes. Les échantillons ont ensuite été centrifugés à 14 000 g pendant 20 min à 4 ° C et le surnageant a été désignée comme étant la fraction de la membrane. Tous les échantillons ont été bouillis et clarifiés par centrifugation.

migration cellulaire Assay

L'activité de migration des cellules AGS ont été détectés par Transwell système (BD BioCoatTM Control 8.0 mm PET Membrane Les inserts de culture cellulaire de 24 puits, BD Biosciences). Après trypsinisation, 5 * 10 ^{4cells ont été ensemencées dans la chambre supérieure contenant un milieu de culture sans FBS. La migration des cellules sur la face inférieure de la membrane a été induite par un milieu contenant 10% de FBS dans la chambre inférieure pendant 12 h à 37 ° C dans un incubateur de culture tissulaire. les cellules migrées sur la face inférieure de la membrane ont été fixées dans une solution de paraformaldehyde à 40% pendant 30 minutes, colorées dans la solution de Giemsa pendant 10 minutes, puis on rince à l'eau. Les cellules colorées ont été soumises à un examen microscopique sous microscope optique. cellules migrées ont été comptés dans 5 champs choisis au hasard par insert, et les valeurs ont été en moyenne. Toutes les expériences ont été réalisées avec trois répétitions dans chaque condition de migration.}

Analyse statistique

Les données ont été exprimées en moyenne ± écart-type (SD). L'analyse statistique a été effectuée en utilisant un ANOVA bilatéral avec le logiciel statistique SPSS. A P
-value de moins de 0,05 a été considérée comme significative.

Remerciements

Nous remercions le Dr Gerry Boss et Dr. Renate Pilz, Université de Californie, San Diego, Etats-Unis pour les dons en nature des constructions adénoviraux.

• PLoS ONE: facteurs socio-démographiques et géographiques de la mortalité oesophagien et cancer gastrique en Suède
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