PLoS One: PKG II Gátolja EGF /EGFR által kiváltott migráció gyomorrák sejtek

absztrakt

háttér

korábbi kutatási eredmények azt mutatták, hogy a II típusú cGMP-függő protein-kináz (PKG II) blokkolhatják a aktiválását epidermális növekedési faktor receptor (EGFR), és ennek következtében gátolja a proliferációt és az ehhez kapcsolódó MAPK /ERK-mediált szignáltranszdukciós gyomorrák sejtvonal BGC-823, ami arra utal, hogy a PKG II gátolhatják más EGFR-kiváltott jelátviteli utak és a kapcsolódó biológiai aktivitása gyomor rákos sejteket. Ez a tanulmány célja az volt, hogy vizsgálja meg a lehetséges gátlásával PKG II EGF /EGFR által kiváltott migráció tevékenység és a kapcsolódó jelátviteli utak. Katalógusa

Módszertan /fő eredményei katalógusa

A gyomorrák sejtvonal AGS, expressziója és aktivitása a PKG II növelte megfertőzni a sejteket adenovírus kódoló konstrukcióval PKG II cDNS (Ad-PKG II) és kezeli a sejteket cGMP analóg 8-pCPT cGMP. Foszforilációja a fehérjék detektáltuk Western-blottal és aktív kis G-fehérje-Ras és Rac1 mértük "pull-down" módszerrel. A sejtmigrációt hatás kimutatható is a transz-jól berendezés. Közötti kötődést PKG II és az EGFR mutattuk Co-IP. Az eredmények azt mutatták, EGF stimulált migráció AGS cella és a hatás kapcsolatos PLCγ1 és ERK közvetítette jelátviteli utak. PKG II gátolja az EGF által kiváltott migráció aktivitás és blokkolt EGF által kezdeményezett jelátviteli PLCγ1 és MAPK /ERK-mediált útvonalakon keresztül megakadályozza az EGF által indukált Tyr 992 és Tyr 1068 foszforiláció EGFR. PKG II kötődik az EGFR és az okozott treonin foszforilációja is. Katalógusa

Következtetés /Jelentés katalógusa

Eredményeink rendszerszinten megerősíti gátlása PKG II EGF által kiváltott migráció és az ahhoz kapcsolódó jelátviteli PLCγ1 és MAPK /ERK-mediált útvonalakon, jelezve, hogy PKG II egy fargoing gátlás EGF /EGFR kapcsolódó jelátviteli és biológiai aktivitásának gyomorrák sejtek révén foszforiláló EGFR és blokkolja az aktiváló belőle. katalógusa

Citation: Jiang L, Lan T , Chen Y, Sang J, Li Y, Wu F, et al. (2013) PKG II Gátolja EGF /EGFR által kiváltott migráció gyomorrák sejtek. PLoS ONE 8 (4): e61674. doi: 10,1371 /journal.pone.0061674 katalógusa

Szerkesztő: Vladislav V. Glinskii, University of Missouri-Columbia, Amerikai Egyesült Államok katalógusa

Beérkezett: szeptember 30, 2012; Elfogadva: március 12, 2013; Megjelent: április 16, 2013 katalógusa

Copyright: © 2013 Jiang et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra. Katalógusa

Forrás: Ez a tanulmány támogatta a Nemzeti Természettudományi Alapítvány Kína, No.81272755, No.31040002, No.81001100 és No.31100974; Az innovációs Grant Jiangsu Egyetemen. A finanszírozók nem volt szerepe a tanulmány tervezés, adatgyűjtés és elemzés, döntés, hogy közzéteszi, vagy a készítmény a kézirat. Katalógusa

Érdekütközés: A szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. Katalógusa

Bevezető

II típusú cGMP-függő protein-kinázok (PKG II) egy szerin /treonin kináz, és összegyűjti a kutatási adatok jelezték, hogy ez kináz volt fontos szerepe szabályozásában sejtbiológiai tevékenységek, mint a proliferáció és az apoptózis, különösen tumorsejtekben . 2004-ben Cook és munkatársai
találták, hogy PKG II idézhet apoptózist a humán tenyésztett prosztata stromális sejtek [1]. 2009-ben, Swartling és munkatársai
számoltak be, hogy a PKG II gátolta proliferációját emberi neuroglioma sejtek és a gátlás volt kapcsolatos csökkenésének expressziójának transzkripciós faktor Sox9 és az Akt foszforiiáció [2]. 2011-ben, Fallahian és munkatársai megállapították, hogy katalógusa cGMP is apoptózist indukálnak a mellrák sejtek és ez a hatás kapcsolatos PKG II [3]. Kutatásaink során azt találtuk, hogy az expresszió és az aktivitás a PKG II humán gyomor rákos sejtvonalak szignifikánsan alacsonyabb volt, mint a normál gyomornyálkahártya-sejtek [4]. További tanulmányok laboratóriumunkban azt mutatta, hogy a PKG II gátolhatják a proliferációt a gyomor rákos sejtvonal és a blokk EGF által indukált jelátviteli MAPK /ERK-közvetített úton keresztül megakadályozzák az aktiválás az EGFR által EGF [5], [6]. Mivel az EGFR aktiválásának kezdeményezhet több jelátviteli utak, beleértve a MAPK /ERK, PI3K /Akt, JAK /STAT és PLCγ1 által közvetített útvonal [7], [8], a blokkoló hatását PKG II az EGFR aktiválásának azt sugallja, hogy ez az enzim lehet egy széleskörű gátló hatás jelátviteli, valamint a kapcsolódó biológiai aktivitása gyomor rákos sejteket. Ez a tanulmány célja az volt, hogy erősítse meg ezt széleskörű gátló hatását a PKG II keresztül vizsgálja a gátlása PKG II EGF által kiváltott migráció tevékenység és a hozzá kapcsolódó jelátviteli gyomorrákban sejtekben. Katalógusa

Eredmények katalógusa

PKG II Gátolja EGF-indukált sejtmigrációt amely kapcsolatban van jelátvitelében PLCγ1 és MAPK /ERK-mediálta Pathways

a sejtmigrációt fontos a normális fiziológiáját és betegség. Megszerzése vándorló képessége rákos sejtek által olyan jellemző, amely hozzájárul, hogy elterjedt a metasztázisos tumorsejtek távoli szervekbe. A legújabb adatok azt mutatták, hogy az EGF képes serkenteni a migráció a rákos sejtek. A mechanizmus, amelyen keresztül az EGF stimulálja a sejtek migrációját nem világos, de néhány adat azt mutatta, hogy EGF ezt át kezdeményező jelátviteli PLCγ1 és MAPK /ERK-mediált útvonalakon. Ebben a kísérletben kimutattuk a migráció stimuláló hatása EGF AGS sejtekben és használt inhibitor a komponenseket a szignál utak, hogy vizsgálja a lehetséges szignáltranszdukciós kapcsolódó hatást. Az eredmények azt mutatták, hogy az EGF kezelés növelte a migrációs aktivitásának AGS sejtek és mindkét MEK (kulcseleme MAPK /ERK-közvetített úton) gátló U0126 és PLCγ1 inhibitor U73122 gátolt EGF-indukálta migrációt, jelezve, hogy az EGF stimulálja a sejtek migrációját aktivitás aktiválásával mindkét MAPK /ERK és PLCγ1 közvetített jelátviteli útvonalak (1.). katalógusa

PKG II Blocks EGF-indukálta Tyr 992 és Tyr 1068 foszforilációja EGFR katalógusa

Amikor EGF kötődik az EGFR, ez okozza auto- foszforiláció a receptor. Számos automatikus foszforilációs helyek, amelyek kapcsolódnak a különböző jelátviteli útvonal. Tirozin 992 és tirozin 1068 között az auto-foszforilációs helyek EGFR és társított PLCγ1 közvetítette és MAPK /ERK jelátviteli volt. Ebben a kísérletben azt vizsgáltuk, a gátló hatását a PKG II a Tyrosine 992 és tirozin 1068 foszforilációját EGFR különbözőképpen kezelt AGS sejtek alkalmazásával Western-blottal. Az eredmények azt mutatták, hogy az EGF kezelés hatására 14 redők növekedése a tirozin 992, és egy 8 ráncok növekedése tirozin 1068 foszforilációját EGFR-t. A fertőzött sejtek Ad-PKG II és stimuláltunk cGMP, a foszforiláció szignifikánsan csökkent (ábra. 2, 3). Ez azt jelzi, hogy a PKG II megakadályozhatja EGF-indukálta tirozin 992 és tirozin foszforiláció 1068 EGFR és következésképpen gátolják PLCγ1 közvetítette és MAPK /ERK jelátviteli. Katalógusa

PKG II Megakadályozza EGF által kiváltott főbb eseményeit PLCγ1 közvetített szignáltranszdukciós útvonal

(1) PLCγ1 aktiválást.

PLCγ van a downstream komponense receptor tirozin kinázok (RTK-k). Ez két izoformája: PLCγ1 mindenhol általánosan elosztott és PLCγ2 fejezzük főleg a hematopoietikus sejtekben. Aktiválása PLCγ1 igényel felvételi a membránhoz és asszociációs révén SH2 domain, aktivált RTK-k, mint például az EGFR. Ez az összefüggés azt eredményezi, a foszforilációja PLCγ1 a tirozin maradékok, különösen a tirozin 783, és a növekedés annak enzimatikus aktivitását. Mi alkalmazott IP módszer izolálására PLCγ1 majd a használt Western blot módszerrel, hogy észleli a foszforilációja PLCγ1. Az eredmények azt mutatták, hogy az EGF kezelés okozta nyilvánvaló növekedését a Tyr783 foszforilációja PLCγ1 és a megnövekedett PKG II aktivitás révén megfertőzni a sejteket az Ad-PKG II és serkenti a sejtek cGMP hatékonyan megakadályozta az EGF-indukált foszforilációját PLCγ1 (ábra. 4 ).

(2) DAG kialakulását. katalógusa

Ha be van kapcsolva, akkor PLCγ1 hidrolízisét katalizálják foszfatidilinozitol 4,5-bisphos-foszfát (PI-4,5P _{2) figyelembe inozit-1,4,5-trifoszfát (IP 3) és diacil-glicerin (DAG), a két molekula, amelyek szabályozzák a mobilizálása intracelluláris Ca ^{2+ és a protein-kináz-C-aktivitás volt. Megfigyelni a hatások az EGF és PKG II kialakulását DAG, ELISA módszert alkalmaztunk kimutatására DAG koncentráció AGS sejtekben. Az eredmények azt mutatták, hogy az EGF-stimulált AGS sejtek, a szint a DAG fokozott nyilvánvalóan és pre-fertőzés Ad-PKG II és a kezelés 8P-CPT-cGMP gátolta az DAG stimulációja által okozott EGF (ábra. 5).}}

(3) Ca ^{2 + felszabadító. katalógusa}

IP3 és DAG vannak másodlagos hírvivők a PLCγ1 közvetítette jelátviteli útvonal. IP3 ismert módon stimulálja a kalcium felszabadulását a belső raktárakból. Mi használt kalcium indikátor fluo-3 /AM kimutatására kalcium a citoplazmában. Az eredmények azt mutatták, hogy az EGF kezelés növelte a kiadás Ca ^{2+ endoplazmás retikulum (ER) a citoplazmában és a magas expresszióját és aktivitását PKG II jelentősen gátolta a kiadás, megfordítva a hatása EGF kezelés (6.).}

(4) az aktiválás PKC. katalógusa

PKC, izoforma protein-kináz C, kulcsfontosságú eleme PLCγ1 közvetítette jelátviteli út és lehet aktiválni Ca ^{2+ és DAG . Aktiválnak, PKC transzlokálódik származó citoszolból membrán a sejtek. Tehát, az összeg a PKC-a membrán képviseli a aktiválását PKC. Ebben a kísérletben azt vizsgáltuk, a gátló hatását a PKG II aktiválását PKC-a különbözőképpen kezelt AGS sejtek alkalmazásával Western-blottal. Az eredmények azt mutatták, hogy öt percen belül hozzáadása után, hogy az EGF tápközegben, a transzlokációs PKC származó citoszol membrán drámaian megnőtt és a transzlokációs gátolta a pre-megfertőzni a sejteket az Ad-PKG II és a kezelés 8-pCPT-cGMP ( ábra. 7.). katalógusa}

(5) aktiválása CaMKIIα. katalógusa

Tanulmányok szabályozásában Ca ^{2 + /kalmodulin (CAM) függő kináz II-alfa (CaMKIIα), amely elsődleges izoformájának CaMKII, azt javasolták, hogy amikor a Ca 2 + /CAM kötődik CaMKIIα, intra-molekuláris autofoszforiláció fordul elő, és a foszforiláció fenntartja a tartós enzim aktiválásával. Elleni antitest foszforilált CaMKIIα (Thr286) vittük Western blot kimutatására foszforilációja CaMKIIα. Az eredmények azt mutatták, hogy az AGS sejt kezelt EGF, Thr286 foszforilációja CaMKIIα nőtt közel 2,5 redők és a fertőzés Ad-PKG II és a kezelés 8-pCPT-cGMP gátolta a növekedést a foszforiláció által indukált EGF (ábra. 8).}

PKG II Gátolja EGF-indukált aktiválása kulcsfontosságú összetevője az MAPK /ERK közvetített jelátviteli útvonalnak katalógusa

(1) MAPK /ERK. katalógusa

MAPK /ERK a legfontosabb eleme a MAPK /ERK-közvetített úton. Foszforiláció mind a treonin és tirozin 202 204 maradványainak ERK 1 és treonin és tirozin 185 187 maradéka ERK2 szükséges teljes enzimatikus aktiválás. Elleni antitest p-ERK1 /2 (Thr 202 /Tyr 204) vittük Western blot kimutatására kettős foszforilezése ERK. Az eredmények azt mutatták, hogy öt percen belül hozzáadása után EGF sejttenyésztő közegben, foszforilációja ERK1 /2 AGS sejtek drámai mértékben emelkedett (10 redők), és az foszforiláció gátolta a pre-megfertőzni a sejteket az Ad-PKG II és aktiválása az enzimet 8 pCPT-cGMP (9.). katalógusa

(2) aktiválása ras. katalógusa

a kis G-fehérje Ras egy másik kulcsfontosságú eleme MAPK /ERK-közvetített jelátviteli út. Két alakja sejtekben: GTP-kötött aktív formája és a GDP-kötött inaktív formában. Miután Ras GTP-kötött formában van, akkor képes kötődni, és aktiválja a Raf-1, és indítsa az ebből aktiválása szerin /treonin kinázok a jelátviteli út. Mi alkalmazott "pull-down" módszerrel észlelni az aktivált Ras. Az eredmény azt mutatta, hogy hozzáadása után EGF a táptalajhoz, az aktív Ras AGS sejtekben fokozott nyilvánvalóan öt percen belül. Megfertőzni Ad-PKG II és ösztönző számukra 8 pCPT-cGMP hozzáadása előtt EGF jelentősen akadályozta az EGF-indukálta Ras aktiválás (ábra. 10). Katalógusa

PKG II Gátolja EGF-indukált aktiválása RAC1

kis G fehérje RAC1 a fő tagja Rho család, amely fontos szerepet játszanak a szabályozásában migrációját rákos sejteket. Mindkét PLCγ1 és MAPK /ERK által közvetített jelátvitel aktiválhatja RAC1 és ezután stimulálja a sejtek migrációját. Annak további igazolására, a gátló hatását a PKG II EGF /EGFR-indukált jelátvitel, amely kapcsolódik a migráció, a "Pull-down" módszert alkalmazták, hogy észleli a gátlása PKG II aktiválás Rac1. Az eredmény azt mutatta, hogy EGF kezelés okozta nyilvánvaló növekedését az aktív RAC1 és nagy aktivitása PKG II hatékonyan gátolja az aktiválási Rac1 (ábra. 11). Ez újabb bizonyítéka a gátlása PKG II EGF által kiváltott migráció gyomorrák sejtek. Katalógusa

PKGII reakcióba lép az EGFR és okai Thr-phoshporylation a receptor katalógusa

Az a mechanizmus, amelyen keresztül PKGII blokkok az EGF-indukált aktiválását EGFR előzetesen vizsgáltuk ebben a kísérletben. Co-Immunoprecipitáció alkalmazták kimutatására közötti kölcsönhatás PKGII és EGFR. Western blot pan anti foszforilációját treonin ellenanyagot használtunk detektálására treonin foszforilezése az EGFR által okozott PKGII. Az eredmények a Co-Immunoprecipitáció azt mutatta, hogy az AGS fertőzött sejtek Ad-PKG II és stimuláljuk 8-CPT-cGMP, közvetlen kötődése között PKG II és EGFR volt kimutatható (12., A panel). A Western blot kimutatta, hogy aktiválását PKG II okozott treonin foszforiláció EGFR (12., B panel). Ez azt jelzi, hogy a PKG II blokkolta az aktiváló EGFR való kötődés és a receptor okozva foszforilációja is. Katalógusa

Vita katalógusa

Jelenleg két cGMP-függő protein kinázok (pkgs), PKG I. és II PKG , azonosították az emlős sejtekben [10], [11]. PKG I széles körben eloszlik a szervezetben, és miatt a gátló hatása a tumor növekedését és invazivitását és indukáló hatással tumorsejtek apoptózisát, azt már azonosították tumorszuppresszor [12]. A kifejezés a PKG II több tissue-korlátozott [13]. Hosszú ideig, szemben a jól bizonyult tumorellenes hatását PKG I, nincs kutatási adatok világosan jelezte, tumorellenes szerepét PKG II, és ez a kináz csak játszik több fiziológiás funkcióban, beleértve az intesztinális szekréciót, a csontnövekedést, és a tanulás és memória [14]. A kutatás azonban érdeklődés PKG II növekszik, és néhány új funkcióját PKG II találtak a közelmúltban, beleértve a szerepét PKG II szabályozásában epiteliális nátrium csatorna és mechanoallodiniára jelátviteli [15] - [17]. Ennél is fontosabb, felhalmozódó kutatási adatok azt mutatták, hogy a PKG II kapcsolódott proliferáció és apoptózis bizonyos sejtek, különösen tumorsejtekben, erősen arra utal, a lehetséges szerepét az enzim szabályozásában biológiai aktivitása a tumorsejtek [1] - [6].

EGFR a felszínen minden sejt. A molekulatömege 170KD, EGFR van egy extracelluláris domént, egy cross-membrán domén és egy intracelluláris domént. Az intracelluláris domén EGFR 542 aminosav-maradékok és osztható hozzávetőleges membrán al-domain, tirozin-kináz al-domain, és a C-terminális al-domain [18]. Az aktiváló eljárás az EGFR tartalmazza a tirozin foszforilációját és az intracelluláris domén és a különböző foszforilációs helyek az domén kapcsolódik a különböző jelátviteli utak. Az EGFR van kapcsolva, akkor toborozni effektor fehérjék annak foszforilált C-terminális al-domain és kezdeményezi az effektor fehérje-mediált útvonalakon [19], [20]. Között a foszforilációs helyek, tirozin 1068 és 1086 kapcsolódik MAPK /ERK-közvetített úton és a tirozin 992 és 1173 kapcsolódnak PLCγ által közvetített jelátviteli út [7], [8]. A korábbi eredmények azt mutatták, hogy a PKG II gátolhatják az EGF-indukált tirozin 1068 foszforilációját EGFR gyomorrák sejtvonalon BGC-823 [6], ami felveti azt a kérdést, hogy a PKG II képes gátolni a foszforilációja más tirozin-helyek EGF /EGFR, és azt követően van széles körű gátlást EGF /EGFR-indukált jel transductions és kapcsolódó biológiai aktivitását a gyomor rákos sejteket. katalógusa

Ebben a tanulmányban azt vizsgáltuk, az intézkedés a PKG II EGF által kiváltott migráció aktivitását gyomorrák sejtvonal AGS. Az eredmény azt mutatta, hogy a PKG II volt szignifikáns gátlást sejtvándorlásra okozta EGF. Ez még inkább alátámasztja, és felfedi a tumor gátló hatása PKG II. A kutatási adatok azt mutatják, hogy körében EGF /EGFR kezdeményezett jelátviteli utak, PLCγ1 és MAPK /ERK közvetített jelátviteli utak a migrációval kapcsolatos tevékenység [21], [22]. Megerősíti ezt a gyomor rákos sejtekben, használtuk inhibitor jelátviteli komponens azonosítására részvételével MAPK /ERK és PLCγ1-mediált utak a folyamatban. Az eredmények azt mutatták, hogy a MEK-inhibitor U0126 és PLCγ1 inhibitor U73122 részlegesen blokkolt EGF /EGFR-indukálta migrációt aktivitását AGS sejtek, jelezve, hogy mindkét jelátviteli utak részt a szabályozó folyamatban. Ahhoz, hogy vizsgálhassuk a potenciális gátló hatását PKG II a következő jelátviteli utak, először feltártuk a gátló hatását a PKG II EGF kezdeményezett PLCγ1 által közvetített jelátviteli útvonal. Az eredmények azt mutatták, hogy a PKG II megakadályozta az összes főbb események ebben jelátviteli útvonal, beleértve a Tyr 992 foszforiláció /EGFR aktiválásának foszforilációs /aktiválásával PLCγ1, a formáció második messenger DAG, a kalcium felszabadulását a citoplazmában, és aktiválását PKC és CAMK IIα. Gátlására PKG II EGF /EGFR által kiváltott MAPK /ERK-mediálta jelátviteli útvonal, a korábbi munka azt mutatták, hogy a PKG II gátolja aktiválását összes kulcsfontosságú komponensek a reakcióút által indukált EGF gyomorrák sejtvonalon BGC-823 [ ,,,0],6]. Ebben a tanulmányban azt vizsgáltuk gátló hatását a PKG II EGF /EGFR-indukált aktiválását kulcseleme ebben a folyamatban. Az eredmények megerősítették, hogy a PKG II gátolta az EGF-indukált aktiválását a Ras protein és a MAPK /ERK a AGS sejtekben, ami arra utal, hogy a PKG II szintén gátolta az EGF /EGFR-indukált jelátviteli MAPK /ERK-közvetített úton ebben a rákos sejtvonalban. Ezek az eredmények szisztematikusan feltárta, hogy a PKG II gátolta EGF által kiváltott migráció gyomorrák sejtek révén gátolja az EGF /EGFR kezdeményezett jelátviteli PLCγ1 és MAP /ERK-mediált útvonalakon. Katalógusa

A jelátviteli mindkét PLCγ1 és MAP /ERK közvetített utak aktiválhatja a kis G-fehérje Rac1, amely egy kulcsfontosságú összetevője szabályozásában sejtek migrációját [23], [24]. Annak igazolására, gátolja a PKG II e fontos esemény az EGF által indukált migrációját gázceiiákat alkalmaztunk "pull-down" módszerrel, hogy ellenőrizze a tevékenységét Rac1 a különbözőképpen kezelt AGS sejtekben. Az eredmények azt mutatták, hogy közben az EGF-indukált migráció, Rac1 aktiválódott, és aktivációt kapcsolódó mindkét PLCγ1 és a MAP /ERK jelátviteli. Továbbá, PKG II gátolta az EGF-indukált aktiválását Rac 1. Ez tovább erősíti a gátló hatását a PKG II EGF /EGFR kezdeményezett sejtek migrációját.

EGFR szorosan kapcsolódik a tumorigenensis. Több mint kifejezés és a mutáció az EGFR gyakran történik a legtöbb rák. A kutatási adatok azt mutatták, hogy több mint 50% -70% -a tüdőrák, vastagbélrák és az emlőrák magas az EGFR [25]. Továbbá, a rák betegek túlzott expressziója az EGFR általában rossz prognózist. Például, az EGFR túlzott mértékű expresszióját volt kimutatható 60% a nem-kissejtes tüdőrák (NSCLC) szenvedő betegek és a prognózis a betegek szegények voltak, a túlélés 4-5 hónap csak a [26]. In vitro
kísérletek megerősítették, hogy a túlzott expressziója EGFR okozott transzformáció NIH-3T3, Rat-1 és az NRK-sejtek, és blokkolja az EGFR aktiválását gátolta proliferációját bizonyos daganatsejtek [27]. Következésképpen, az EGFR az első növekedési faktor receptor venni, mint rákterápia cél. Számos módszer gátlására EGFR aktivitás és a kapcsolódó jelátviteli, beleértve a specifikus antitestek ellen EGFR és inhibitorai az EGFR, a kapott intenzív kutatás [28] - [30]. Új és hatékonyabb módszerek a blokkoló EGFR által közvetített jelátviteli hasznos lesz a rákterápiában. Ezért az a megállapítás, hogy a PKG II képes gátolni az aktiválási az EGFR és az ebből következő jelátviteli fontos jelentősége. Ez arra utal, hogy a PKG II egy potenciális endogén EGFR-gátló és egyben új tippet stratégiája rákterápia. Katalógusa

A kutatási adatok azt mutatták, hogy bizonyos protein kinázok okozhat foszforiláció EGFR és befolyásolják az aktiválás és /vagy rendeltetési hely. Például, a protein kináz C (PKC) is okozhat a foszforiláció a treonin 654 EGFR és szabályozza receptorkötő és internalizációs [31]. Szerin 1046/1047 (Ser1046 /1047) foszforilációs hely szükséges EGFR deszenzibilizáció az EGF-kezelt sejtekben [32] .A Kísérleteink során azt észlelte foszforilációja Thr654 és Ser1046 /1047 EGFR és megállapította, hogy a PKG II nem okozott foszforilációja ezek foszforilációs helyek. Eredményeink azonban azt mutatta, hogy nem volt közvetlen kölcsönhatás PKG II és az EGFR és PKG II okozott treonin foszforiláció EGFR. Ez azt jelezte, hogy a PKG II blokkolta az EGFR aktiválásának révén kötődni és foszforiláló a receptort. A pontos foszforilációs hely lesz a következő kutatási cél. Katalógusa

Anyagok és módszerek katalógusa

Cell Line és reagensek katalógusa

Az emberi gyomorrák sejtvonal AGS adta Intézet Sejt- (Sanghaj, Kína). Adenovírus vektorok kódoló β-galaktozidáz (PAD-LacZ) és PKG II (PAD-PKG II) volt kedves ajándéka Dr. Gerry Boss és Dr. Renate Pilz a University of California, San Diego, USA féle módosított Eagle Media (DMEM) és magzati marhaszérumot (FBS) adtunk a GIBCO (Grand Island, NY). Az antitest ellen PKG II származott ABGENT Biotechnology (San Diego, CA). Kecske anti-β-aktin, egér anti-pan-Ras, és egér anti-PLCγ1 antitestek voltak a Santa Cruz (Santa Cruz, CA). Nyúl anti-p-EGFR (Tyr1068), nyúl anti-p-EGFR (Tyr992) nyúl anti-EGFR, egér anti-p-ERK (Thr 202 /Tyr 204), nyúl anti-ERK és a nyúl anti-p-PLCγ1 (Tyr783) antitestek voltak a Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Nyúl anti-PKC és a nyúl anti-p-CaMK IIα (Thr286) voltak Bioworld Technology (St. Louis Park, MN). Nyúl anti-p-Thr antitest a ABCAM (MA, USA) .Horseradish peroxidázzal (HRP) konjugált szekunder ellenanyagokat a Jackson Immuno Research Laboratories (West Grove, PA). A sejtes áteresztő cGMP analóg 8-pCPT-cGMP a Calbiochemtől volt (San Diego, CA). EGF, U73122 és U0126 a Sigmától volt (St. Louis, MO). Elektrokemilumineszcenciás (ECL) reagenst a Millipore (Billerica, MA). Ca ^{2 + kijelző Fluo-3 /AM és membrán és citoszoija Protein Extraction Kit voltak Beyotime (Jiangsu, Kína). Emberi diacil-glicerin (DAG /DG) ELISA Kit származott Cusabio Biotech Co., Ltd. (Newark, DE). Az összes többi használt reagensek analitikai tisztaságú volt.}

előállítása adenovirális vektorok

293A sejteket transzfektáltunk adenovirális vektor kódoló LacZ és PKG illetve II és tenyésztettük legfeljebb tíz nap, amíg CPE volt látható. A sejteket és a tenyésztő tápközeget összegyűjtöttük, és ment három fagyasztás-felolvasztás ciklus. A felülúszót tartalmazó adenovírusok (Ad-LacZ és Ad-PKG II) alkalmaztunk fertőzésére új 293A-sejtek, hogy megerősítsék az adenovírusok. Az amplifikált adenovirális preparátumokat titráltuk, és a pfu /ml-ben határoztuk meg, és tartott -80 ° C között a felhasználásig.

Sejttenyésztés és fertőzés adenovirális vektorok

AGS sejteket tenyésztettünk DMEM mellékelt 10% FBS-sel és 37 ° C-on, nedvesített inkubátorban, 95% levegőt és 5% CO _{2. A táptalajt megváltozott minden második nap, és a sejteket szub-tenyésztettük konfluencia. Azon a napon, a fertőzés előtt a sejteket frissen ültetett 70-80% összefolyás, és a fertőzés Ad-LacZ és Ad-PKG II végeztünk.}

Western-blot

A protein mintákat vetettük alá, SDS-PAGE (8-12%) gélen szerint a molekuláris méretének célfehérje, és az elektroforézist és a membrán transzfer végeztük, a gyártó utasításai szerint (Bio-Rad, Hercules, CA). A primer antitesteket inkubáltuk egy éjszakán át 4 ° C-on TBS-T (2% Tween-20), és a megfelelő szekunder antitesteket inkubáltuk szobahőmérsékleten 1 órán TBS-T (2% Tween-20), három mosás minden inkubálás után. ECL reagenseket alkalmaztuk, hogy bemutassák a pozitív sávok a membránon. Végrehajtásához denzitometriás elemzés, digitális képek a pozitív sávok kaptunk Chemidoc XRS és analizáltuk a képelemző programot Quantity One (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Az eredmények azt mutatták, arra az arány a target fehérje /kontrollként. Katalógusa

"pull-down" Elemzés az aktív kis G-fehérje-Ras és Rac1 katalógusa

A tevékenység a Ras mutattuk Legördülő módszer a korábban ismertetett módon [9]. Röviden, a sejteket növekvő 100 mm-es tenyésztő lemezt háromszor mostuk hideg PBS-sel, és lizáltuk hozzáadásával 400 ul lízis pufferben (25 mM HEPES pH = 7,5, 150 mM NaCi, 1% NP40, 10% glicerin, 25 mM NaF , 10 mM MgCI _{2, 0,25% nátrium-dezoxikolát, 1 mM EDTA, 1 mM Na 3VO 4, 10 ng /ml aprotinin és 10 ng /ml leupeptin). A mintát összegyűjtjük és centrifugáljuk (14000 g, 4 ° C, 10 perc), hogy megszabaduljon a törmeléket. A felülúszót glutation-Sepharose gyöngyök és glutation S
-transferase-Ras-RBD (GST-RBD), 4 ° C-on 1 órán át. A gyöngyöket 3-szor mostuk lízispufferben, és melegítjük forralt vizet, hogy kiadja a fehérjék. A fehérje mintákat (amelyek aktív Ras) analizáltuk Western-blot antitest ellen pan-Ras. Az aktív Rac1 mutattuk hasonló módszerrel, de a GST-PAK1 fehérje kötő domén (GST-PBD) és elleni antitest Rac1. Katalógusa}

Immunoprecipitáció katalógusa

A sejteket növekvő 100 mm-es tenyésztő lemezt mostuk két alkalommal hideg PBS-sel, és lizáltuk, hogy 1 ml RIPA-pufferben (50 mM Tris-HCl, pH = 7,4, 1% Triton X-100, 1 mM EDTA-t, 1 mM leupeptin, 1 mM fenil-metil-fluorid, 10 mM NaF, 1 mM Na _{3VO 4) per lemez. Elleni antitestek PLCγ1 és p-PLCγ1 használtuk immunprecipitációs. A csapadékot próbaként elleni antitestek célfehérjék.}

Elemzés a kalcium citoplazmában

hatásának monitorozásához EGF és PKG II EGF-indukált kalciumfelszabadulás, AGS sejteket feltöltjük 5 uM a membrán áteresztő kalcium indikátor Fluo-3-acetoxi-metil (AM) észter 30 percen át 37 ° C-on DMEM-ben. Miután a rakodás, a sejteket PBS-sel mostuk, és szuszpendáljuk DMEM-ben. A fluoreszcens méréseket végeztünk egy Olympus Fluoview-500 konfokális rendszer. Fluo-3-gerjesztettük argon lézer fény 488 nm-en, és a fluoreszcenciát mértük hullámhosszon 515 nm-en.

ELISA assay DAG

DAG koncentrációkat ELISA-val mértük, szerint a gyártó utasításai . Ez assay mennyiségi szendvics enzim immunoassay módszerrel. Specifikus antitest DAG már előre felvitt mikro-lemez. Szabványok és mintákat fúrt lyukakba és minden DAG jelen köti az immobilizált ellenanyagot. Eltávolítása után a nem kötődő anyag, egy biotin-konjugált specifikus antitest DAG adunk a lyukakhoz. Mosás után avidin konjugált torma-peroxidáz (HRP) adunk a lyukakba. Mosás után, hogy eltávolítsa a nem kötött avidin-enzim reagens, egy szubsztrát oldatot adunk az üregekbe és a szín alakul arányában az összeg a DAG kötve a kezdeti lépés. A szín kifejlődését leállítjuk, és a szín intenzitása mérjük.

szubcelluláris frakcionálása

szubcelluláris frakcionálást a citoszol és a membrán frakciókban végeztük membránokat használva és citoszoija Protein Extraction Kit, a gyártó szerint a utasítás. Egyrétegű tenyészeteket háromszor mossuk jéghideg PBS-sel oldat és kaparjuk hideg homogenizációs pufferben (HB), amely 20 mM Tris-HCl-t (pH = 7,4), 4 mM EDTA-t, 2 mM EGTA, 10% glicerin, 10 g /ml leupeptin, és 1 mM PMSF. A sejteket lizáltuk keresztül ultrahanggal a 4-15 s időközönként és teljes lízis követtük mikroszkopikusan. A homogenizátumot ultracentrifugáltuk át 86,000 g 45 percen át 4 ° C-on, és a felülúszót jelölték a citoszol frakció. Az üledéket újra szuszpendáljuk HB, amely 1% Triton X-100, és jégen inkubáljuk 30 percen át. A mintákat ezután centrifugáltuk 14.000 g mellett 20 percig 4 ° C-on, és a felülúszót jelölték a membránfrakciót. Minden mintát felforraljuk, majd centrifugálással. Katalógusa

Cell Migration Analitika katalógusa

A migráció aktivitását AGS sejtet találtak a kamrarendszert (BD BioCoatTM Ellenőrző 8,0 mm PET membrán 24 lyukú Sejttenyésztés betétek, BD Biosciences). Miután tripszinizáció, 5 * 10 ^{4cells oltunk a felső kamrába tartalmazó táptalajon FBS nélküli. A sejtmigrációt, hogy az alsó oldalán a membrán által kiváltott közegben, amely 10% FBS-t az alsó kamrában 12 órán át 37 ° C-on egy szövettenyésztő inkubátorban. A migrált sejteket az alsó oldalán a membrán fixáltuk 40% -os paraformaldehid-oldattal 30 percig, megfestettük Giemsa oldattal 10 percig, majd vízzel leöblítettük. A megfestett sejteket vetettük alá mikroszkópos vizsgálatot fénymikroszkóp alatt. Migrált sejteket megszámoltuk 5 véletlenszerűen kiválasztott mező per betét, és az értékeket átlagoltuk. Minden kísérletet három ismétlésben az egyes migrációs állapotban.}

Statisztikai elemzés

Az adatokat átlag ± standard deviáció (SD). Statisztikai analízist két mintás ANOVA SPSS statisztikai szoftver. A P katalógusa -érték kisebb, mint 0,05 értéket tekintettük szignifikánsnak. Katalógusa

Köszönetnyilvánítás katalógusa

Köszönöm Dr. Gerry Boss és Dr. Renate Pilz, University of California, San Diego, USA-ban az ilyen ajándékokat adenovírus konstrukciók. katalógusa

• PLoS One: Társadalmi-demográfiai és földrajzi tényezők nyelőcső és a gyomorrák mortalitása Sweden
• PLoS One: túltermelése CD151 jósolja kórjóslatát kimetszett Gyomor Cancer