PLoS ONE: PKG II Sprječava EGF /EGFR-inducirane migracije želučanog raka Cells

Sažetak pregled

Pozadina pregled

Naši rezultati prethodnih istraživanja pokazali su da Tip II cGMP ovisne protein kinaze (PKG II) može zaustavljaju aktivaciju receptora epidermnog čimbenika rasta (eGFR) i stoga inhibiraju proliferaciju i srodne MAPK /ERK prijenos signala želučanog raka stanične linije BGC-823, što sugerira da PKG II može spriječiti druga eGFR-aktiviranih signalnih transdukcijskih ciklusa i srodni biološke aktivnosti želučane stanica karcinoma. Ovaj članak je osmišljen kako bi istražili potencijal inhibicije PKG II na EGF /migracijske aktivnosti EGFR-inducirana i povezanim puteva prijenosa signala. Pregled

Metodologija /glavne nalaze

U želučanog raka stanične linije AGS, ekspresija i aktivnost PKG II povećani su za zarazu stanice s adenovirusni konstrukt koji kodira PKG II cDNA (Ad-PKG II) i tretirane s cGMP analognog 8-pCPT-cGMP. Fosforilacija proteina je otkriven Western hibridizacija i aktivnim malim G proteina Ras i Rac1 mjerena je metodom "pull-down". migracija stanica aktivnost otkrivena je u trans-dobro opreme. Vezivanje između PKG II i EGFR je otkrivena s Co-IP-a. Rezultati su pokazali EGF stimulira migraciju AGS stanice i učinak odnosi na PLCγ1 i ERK-posredovane puteve prijenosa signala. PKG II inhibira EGF-inducirane migracije aktivnost i blokirani EGF-inicirao prijenosu signala od PLCγ1 i MAPK /ERK-posredovane puteve kroz sprečavanje EGF-inducirane Tyr 992 i tir 1068 fosforilaciju EGFR. PKG II vezani uz EGFR i izazvao treonin fosforilaciju njega. Pregled

Zaključak /Značaj pregled

Naši rezultati sustavno potvrđuje inhibiciju PKG II na EGF-inducirane migracije i srodnih prijenosu signala PLCγ1 i MAPK /ERK-posredovanih puteva, što ukazuje da PKG II ima fargoing inhibicije na EGF /povezan s EGFR prijenosa signala i bioloških aktivnosti želučane stanica raka kroz fosforilaciju EGFR i blokira aktivaciju toga pregled

Izvor. Jiang L, T Lan , Chen Y, Sang J, Li Y, Wu M, et al. (2013) PKG II Sprječava EGF /EGFR-inducirane migracije želučane stanica raka. PLoS ONE 8 (4): e61674. doi: 10,1371 /journal.pone.0061674 pregled

urednik: Vladislav V. Glinskii Sveučilišta Missouri-Columbia u Sjedinjenim Američkim Državama Netlogu

Primljeno: 30. rujna 2012; Prihvaćeno: 12. ožujka 2013. godine; Objavljeno: 16. travanj 2013 pregled

Copyright: © 2013 Jiang i sur. Ovo je otvorenog pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan

financiranja. Ova studija je podržan od strane Nacionalne zaklade prirodoslovni Kine, No.81272755, No.31040002, No.81001100 i No.31100974; Inovacije Grant sa Sveučilišta Jiangsu. U financijeri nisu imali ulogu u studiju dizajna, prikupljanja i analize podataka, Odluka o objavi, ili pripremu rukopisa pregled

U konkurenciji interese.. Autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi pregled

Uvod pregled

Tip II cGMP-ovisne protein kinaze (PKG II) serin /treonin kinaze i gomilaju podaci istraživanje je pokazalo da je ova kinaza imao važnu ulogu u reguliranju stanične biološke aktivnosti kao što su proliferacija i apoptoze, osobito u stanicama tumora , U 2004, Cook i sur pregled je utvrdio da PKG II može izazvati apoptozu ljudskih kulturi prostate stanica strome [1]. U 2009. godini, Swartling i sur pregled izvijestili da PKG II inhibira proliferaciju ljudskih neurogliom stanica i inhibicije bio je vezan na smanjenje ekspresije faktora transkripcije Sox9 i fosforilacije Akt [2]. U 2011. godini, Fallahian i sur pregled je utvrdio da cGMP može izazvati apoptozu stanica raka dojke, a taj je učinak bio povezan s PKG II [3]. Tijekom našeg istraživanja otkrili smo da je ekspresija i aktivnost PKG II u ljudskim staničnim linijama karcinoma želuca bila je značajno niža od one u normalnoj sluznici stanicama želuca [4]. Daljnje istraživanje u našem laboratoriju pokazao da PKG II mogu inhibirati proliferaciju želučanih staničnih linija raka i blok EGF transdukciju signala induciran MAPK /ERK-posredovane putanje kroz sprječava aktivaciju EGFR EGF [5], [6]. Budući da aktivacija EGFR može pokrenuti nekoliko puteva prijenosa signala, uključujući MAPK /ERK, PI3K /Akt, JAK /STAT i PLCγ1-posredovane puteve [7], [8] je blokirajući učinak PKG II aktivacije EGFR ukazuje da ovaj enzim može imati inhibicijski učinak širokog raspona na prijenosu signala i srodne biološke aktivnosti želučane stanice raka. Ovaj članak je osmišljen kako bi potvrdili ovu širokog raspona inhibitorni učinak PKG II kroz istražuje inhibiciju PKG II na migracijske aktivnosti potaknut EGF i srodne Prijenos signala u želučanih stanica raka. Pregled

Rezultati pregled

PKG II Sprječava EGF-inducirane stanične migracije koja je povezana s Prijenos signala PLCγ1 i MAPK /ERK posredovanih puteva pregled

migracija stanica je važan u uobičajenoj fiziologiji kao i u bolesti. Stjecanje migracijskog sposobnost stanicama raka je karakteristika koja doprinosi širenju metastatskih tumorskih stanica do udaljenih organa. Noviji podaci su pokazali da EGF mogu stimulirati migraciju stanica raka. Mehanizam putem kojeg EGF stimulira staničnu migraciju nije jasno, ali neki podaci pokazuju da EGF mogu to učiniti kroz iniciranje prijenosu signala od PLCγ1 i MAPK /ERK posredovane puteve. U ovom eksperimentu, otkrili smo učinak migracije stimulaciju EGF u AGS stanice i koristi inhibitor ključnih komponenti u signalnim putovima istražiti moguću transdukciju signala povezane s učinkom. Rezultati su pokazali da EGF tretman je povisio migracije aktivnost AGS stanica i oba MEK (ključnu komponentu MAPK /ERK-posredovane putanje) inhibitor U0126 i PLCγ1 inhibitor U73122 inhibira EGF-inducirane migracije, što ukazuje da EGF stimulira staničnu aktivnost migracija kroz aktiviranje oba MAPK /ERK i PLCγ1 signala Trandukcija putevi (Sl. 1). pregled

PKG II Blokovi EGF-inducirane Tyr 992 i Tyr 1068 fosforilaciju EGFR pregled

Kada EGF veže s EGFR, to uzrokuje auto- fosforilaciju receptora. Postoji nekoliko auto-fosforilacijska mjesta koje su povezane s različitim put prijenosa signala. Tirozin 992 i tirozin 1068 među auto-fosforilacijskih mjesta EGFR i povezani su s PLCγ1 posredovanih MAPK /ERK-posredovani prijenos signala redom. U ovom eksperimentu, ispitivali smo inhibitorski učinak PKG II na fosforilaciju tirozina 992 i tirozina 1068 EGFR u različito tretiranih AGS stanica pomoću Western upijanja. Rezultati su pokazali da EGF tretman izazvao 14 naborima povećanje tirozina 992 i 8 naborima povećanje Tirozin 1068 fosforilacije EGFR. U stanicama inficiranim Ad-PKG II i stimulirane sa cGMP, fosforilacija je značajno smanjen (Sl. 2 i 3). To pokazuje da PKG II mogao spriječiti EGF-inducirane Tirozin 992 i Tirozin 1068 fosforilaciju EGFR i time spriječiti PLCγ1 posredovane i MAPK /ERK posredovane signalizacije. Pregled

PKG II Sprječava EGF-potaknuta Glavni događaji u PLCγ1 posredovane signalnog puta pregled

(1) aktivaciju PLCγ1. pregled

PLCγ je nizvodni dio receptora tirozin kinaza (RTK). Ona ima dvije izoforme: PLCγ1 posvuda se širi i PLCγ2 izražava se uglavnom u hematopoetskih stanica. Aktivacija PLCγ1 zahtijeva svoju zapošljavanje na membrani i udruge, putem svog SH2 domene, s aktivnim RTK kao što su EGFR. Ova povezanost će rezultirati fosforilaciju PLCγ1 na tirozinu, a posebno o tirozin 783, i povećanje njegove enzimske aktivnosti. Primijenili smo IP metodu za izoliranje PLCγ1 i zatim koristiti Western blot metodom za otkrivanje fosforilaciju PLCγ1. Rezultati su pokazali da EGF tretman izazvao očiti porast Tyr783 fosforilacije PLCγ1 i povećanje aktivnosti PKG II putem zaraze stanice sa Ad-PKG II i poticanja stanica s cGMP učinkovito spriječiti fosforilaciju EGF-inducirane od PLCγ1 (sl. 4 ). pregled

(2) DAG formacija. pregled

Nakon što je aktiviran, PLCγ1 može kataliziraju hidrolizu fosfatidilinozitol 4,5-mje-fosfata (PI-4,5P _{2) u inozitol 1,4,5-trifosfata (IP 3) i diacilglicerol (DAG), dvije molekule koje reguliraju mobilizaciju intracelularne Ca ^{2 + i protein kinaze C aktivnost pojedinačno. Promatrati učinke EGF-a i PKG II o formiranju DAG, ELISA metoda se koristi za otkrivanje koncentraciju dag u AGS stanica. Rezultati su pokazali da su u EGF stimulira AGS stanica, razina DAG povećava očito i prethodno infekcija Ad-PKG II i liječenje 8P-CPT-cGMP inhibira nastajanje DAG uzrokovana stimulacijom sa EGF (Sl. 5).}}

(3) Ca ^{2 + otpuštanja. pregled}

IP3 i DAG su drugi glasnici u PLCγ1 posredovanog put prijenosa signala. IP3 je poznato da potiče otpuštanje kalcija iz unutarnjih trgovinama. Koristili smo kalcija indikator fluo-3 /AM za otkrivanje kalcija u citoplazmi. Rezultati su pokazali da EGF tretman povećava otpuštanje Ca ^{2 + iz endoplazmin retikulum (ER) u citoplazmi i visoku ekspresiju i aktivnost PKG II značajno inhibira oslobađanje, unazad učinak EGF liječenja (Sl. 6).}

(4) Aktivacija PKCα. pregled

PKCα, izoforme protein kinaze C je ključna komponenta PLCγ1 posredovane signal put i mogu se aktivirati Ca ^{2 + i DAG , Aktivirana, PKCα premješta iz citosola u membranama stanice. Dakle, količina PKCα na membrani predstavlja aktivaciju PKCα. U ovom eksperimentu, ispitivali smo inhibitorski učinak PKG II u aktivaciji PKCα u različito tretiranih AGS stanica pomoću Western upijanja. Rezultati su pokazali da u roku od pet minuta nakon dodavanja EGF-a na medij za kulturu, translokacija PKCα od citosolu na membranu dramatično se povećao, a translokacija je inhibirana unaprijed zaraziti stanice s Ad-PKG II i liječenje sa 8-pCPT-cGMP ( Sl. 7). pregled}

(5) Aktivacija CaMKIIα. pregled

Studije o regulaciji Ca ^{2 + /kalmodulin (CAM) ovisne kinaze II alfa (CaMKIIα), koji primarni izoforma CaMKII, sugeriraju da kada Ca 2 + /CaM veže CaMKIIα, intra-molekularne autofosforilacija događa i fosforilacija održava trajnu aktivaciju enzima. Se protutijelo protiv fosfo-CaMKIIα (Thr286) se primjenjuju u Western blotting za otkrivanje fosforilaciju CaMKIIα. Rezultati su pokazali da je u AGS stanice tretirane s EGF, Thr286 fosforilacija CaMKIIα porasla je za gotovo 2,5 x i infekcije s Ad-PKG II i tretmana s 8-pCPT-cGMP inhibirana povećanje fosforilacije izazvane EGF (Sl. 8). pregled}

PKG II Sprječava EGF-inducirana aktivacija ključnih komponenti MAPK /ERK posredovano signalnog puta pregled

(1) aktivaciji MAPK /ERK. pregled

MAPK /ERK je ključna komponenta MAPK /ERK-posredovane putem. Fosforilacija na oba treonin i tirozin 202 204 ostataka ERK1 i treonin 185 i tirozinu 187 ostataka ERK2 je potrebna za potpuni enzimske aktivacije. Se protutijelo protiv p-ERK1 /2 (Thr 202 /Tyr 204) se primjenjuju u Western blotting za otkrivanje dvostruku fosforilaciju ERK. Rezultati su pokazali da od pet minuta nakon dodavanja EGF u medij stanične kulture, fosforilacija ERK1 /2 u AGS stanice dramatično (10 nabora) povećana, a fosforilacija je inhibirana prethodno infekcijom stanica sa Ad-PKG II i aktivaciju enzima sa 8-pCPT-cGMP (Sl. 9). pregled

(2) Aktivacija ras. pregled

Malo G proteina Ras je još jedna ključna komponenta u MAPK /signala put ERK posredovane. Ona ima dva oblika u stanicama: GTP-bound aktivni oblik i BDP-bound neaktivni oblik. Jednom Ras je GTP vezani obliku, može vezati i aktivirati Raf-1 i pokretanje nastale aktivacija serin /treonin kinaze u signalnom putu. Primijenili smo metodu "pull-down" za otkrivanje aktivirani Ras. Rezultati su pokazali da je nakon dodavanja EGF u mediju za kulturu, aktivni Ras u AGS stanica raste očito unutar pet minuta. Zaraze stanice sa Ad-PKG II i potičući ih sa 8-pCPT-cGMP prije dodavanja EGF značajno spriječio aktiviranje EGF-inducirane Ras (Sl. 10). Pregled

PKG II Sprječava EGF-inducirana aktivacija RAC1

Malo G protein RAC1 je glavni član obitelji Rho koji igraju važnu ulogu u reguliranju migraciju stanica raka. Oba PLCγ1 i MAPK /ERK Trandukcija signal može aktivirati RAC1, a nakon toga potiču migraciju stanica. Kako bi se dodatno potvrditi inhibitorni učinak PKG II na EGF /EGFR-inducirana signalizaciju koji se odnose na migracije, metoda "padajućih" primijenjena je detektirati inhibiciju PKG II na aktivaciju RAC1. Rezultat je pokazao da EGF liječenje uzrokuje očigledan porast aktivnog RAC1 i visoke aktivnosti PKG II učinkovito inhibira aktivaciju RAC1 (sl. 11). Time se dobiva još jedna potvrda inhibicije PKG II na EGF-inducirane migracije želučanih stanica raka. Pregled

PKGII interakciju s EGFR i uzroka Tbr-phoshporylation receptora Netlogu

mehanizam putem kojeg PKGII blokova EGF-inducirana aktivacija EGFR prethodno ispitan je u ovom eksperimentu. Co-Imunoprecipitacija primijeniti za otkrivanje interakciju između PKGII i EGFR. Western blot s pan anti fosforilacije treonin antitijela se koriste za detekciju fosforilaciju treoninom EGFR uzrokovane PKGII. Rezultati suradnju imunoprecipitaciju pokazala da je u AGS stanicama inficiranim s Ad-PKG II i stimulirane sa 8-CPT-cGMP, izravno vezanje između PKG II i EGFR je otkrivena (sl. 12, panel A). Rezultati Western blot-a pokazala je da aktivacija PKG II uzrokuje treonin fosforilacija EGFR (Sl. 12, ploča B). To pokazuje da PKG II blokiran aktivacijski EGFR kroz vezivanje sa receptorom i uzrokuje fosforilaciju njega. Pregled

Rasprava pregled

Trenutno, dva cGMP-ovisna protein kinaza (pkgs), PKG I i II PKG , identificirani u stanicama sisavaca [10], [11]. PKG I široko je rasprostranjena u tijelu, a zbog svog inhibicijski učinak na rast tumora i invazivnost i izaziva učinak na apoptozu tumorskih stanica, što je identificiran kao tumorski supresor [12]. Izraz PKG II je više tkiva ograničen [13]. Duže vrijeme, za razliku od dobro pokazala antitumorskog učinka PKG I, bez istraživanja podaci jasno pokazuju antitumorsko ulogu PKG II i to kinaza upleten samo nekoliko fizioloških funkcija, uključujući crijevne sekrecije, rast kosti, i učenje i memorije [14]. Međutim, istraživanja su oko PKG II je u porastu i neke nove funkcije PKG II pronađeni su u posljednje vrijeme, uključujući ulogu PKG II u regulaciji epitela natrijevih kanala i prijenosa Klipni-signal [15] - [17]. Još važnije, akumulira podatke istraživanja pokazuju da PKG II odnosi na proliferaciju i apoptozu u nekim stanicama, posebno u stanicama tumora, snažno ukazuje na moguću ulogu tog enzima u regulaciji biološke aktivnosti stanica tumora [1] -. [6]

EGFR postoji na površini svih stanica. Molekulske mase 170KD, EGFR ima izvanstaničnu domenu, a prelaz kroz membranu domene i intracelularne domene. Intracelularna domena EGFR ima 542 amino-kiselina ostataka i mogu se podijeliti na približan membrane pod-domene, tirozin kinaze pod-domenu, i C-terminalnog pod-domena [18]. Proces aktiviranja EGFR uključuje tirozin fosforilacija svoje unutarstanične domene i različitih mjesta fosforilacije na domenu povezane s različitim signalnim putovima. Kada se aktivira EGFR, može zaposliti izvršne proteine ​​svoje fosforilirani C-terminalnog pod-domena i inicira djelatna puta protein posredovane [19], [20]. Među fosforilacijskog mjesta, tirozina 1068 i 1086 su povezani s MAPK /ERK-posredovane putanje i tirozin 992 i 1173 su povezana s PLCγ posredovane signalnom putu [7], [8]. Naših prethodnih rezultati pokazuju da PKG II mogu inhibirati potaknut EGF tirozin 1068 fosforilacije EGFR u želučanom raka stanične linije BGC-823 [6], se postavlja pitanje da li PKG II može spriječiti fosforilaciju drugih tirozin stranica na EGF /EGFR i nakon toga se široki raspon inhibicija EGF /EGFR-inducirana trandukcija signala i povezanih bioloških aktivnosti želučane stanice raka. pregled

U ovom radu istraživali smo djelovanje PKG II na EGF-inducirane migracije aktivnost želučane raka stanične linije AGS. Rezultat je pokazao da PKG II imao značajna inhibicija na migraciju stanica uzrokovanu EGF-a. To daje dodatne dokaze za otkrivanje inhibitorni učinak tumorsku PKG II. Podaci istraživanja su pokazala da je među EGF /EGFR pokrenuo signalnim putovima, PLCγ1 i MAPK /ERK signalni Trandukcija putevi su vezane za migracije aktivnosti [21], [22]. Da biste to potvrdili u želučanim stanicama raka, koristili smo inhibitor prijenosa signala komponente za identifikaciju sudjelovanje MAPK /ERK i PLCγ1 posreduju putova u tom procesu. Rezultati su pokazali da inhibitor MEK U0126 i PLCγ1 inhibitor U73122 djelomično blokiran EGF /EGFR inducirane migracije aktivnost AGS stanica, što znači da oba putevima prijenosa signala koji sudjeluju u procesu reguliranje. Rasvijetiliti potencijalni inhibitorni djelovanje PKG II o tim signalnim putovima, prvo istraživali inhibicijski učinak PKG II na EGF pokreće PLCγ1 posredovane puteve prijenosa signala. Rezultati su pokazali da PKG II spriječiti sve glavne događaje u ovoj put prijenosa signala, uključujući i Tyr 992 fosforilacije /aktivacije EGFR, fosforilacije /aktivacije PLCγ1, formiranje drugog glasnika DAG, oslobađanje kalcija u citoplazmu, a aktivacija PKC i CAMK IIα. Za inhibiciju PKG II na EGF /EGFR inducirane MAPK /ERK transdukcije signala, našeg prethodnog rada pokazuju da PKG II inhibira aktivaciju svih ključnih komponenti u putu induciranog EGF-a u rak želuca stanična linija BGC-823 [ ,,,0],6]. U ovom radu istraživali smo inhibitorni učinak PKG II na EGF /EGFR-inducirana aktivacija ključnih komponenti u ovom putu. Rezultati su potvrdili da PKG II inhibira EGF-inducirane aktivacije Ras proteina i MAPK /ERK u stanicama AGS, sugerirajući da PKG II također inhibira EGF /EGFR inducirana transdukciju signala MAPK /ERK-posredovanih puteva u ovoj raka stanične linije. Ovi rezultati sustavno otkriva da PKG II inhibira EGF-inducirane migracije želučanih stanica raka kroz blokiranja EGF /EGFR pokrenuo prijenosu signala PLCγ1 i MAP /ERK-posredovane puteve. Pregled

Prijenos signala u oba PLCγ1 i MAP /ERK posredovano putevi mogu aktivirati mala G protein Rac1, koji je ključna komponenta u reguliranju stanične migracije [23], [24]. Za potvrdu inhibiciju PKG II o tom važnom događaju u EGF-inducirane migracije stanica plin, primijenili smo metodu "padajućih" provjeriti aktivnost Rac1 u različito tretirane AGS stanica. Rezultati su pokazali da je tijekom migracije EGF-inducirane, Rac1 se aktivira i aktivacija je povezana s obje PLCγ1 i MAP /ERK posredovanog signalizaciju. Nadalje, PKG II inhibira EGF-inducirane aktivacije Rac 1. Time se dodatno potvrdilo inhibicijski učinak PKG II na EGF /EFGR pokreće staničnu migraciju. Pregled

EGFR je usko povezana s tumorigenensis. Preko izražavanja i mutacija EGFR često događa u većini vrsta raka. Podaci istraživanja pokazali su da više od 50% -70% od raka pluća, raka debelog crijeva i raka dojke imaju visoku ekspresiju EGFR [25]. Nadalje, oboljeli od raka s više ekspresija EGFR obično imaju lošu prognozu. Na primjer, EGFR prekomjerna ekspresija detektiran je u 60% ne-malih stanica pluća (NSCLC) pacijenata, te prognozu pacijenata su siromašni s preživljenjem od samo 4-5 mjeseci [26]. In vitro
eksperimenti potvrdili su da prekomjerna ekspresija EGFR izazvao transformaciju NIH-3T3, Rat-1 i NRK stanice i blokira aktivaciju EGFR inhibirati proliferaciju nekih tumorskih stanica [27]. Prema tome, EGFR je prvi receptor faktora rasta uzima kao meta za terapiju raka. Nekoliko metoda za inhibiciju EGFR aktivnosti i srodnih prijenos signala, uključujući i specifičnih protutijela protiv EGFR i inhibitori EGFR, dobio intenzivna istraživanja [28] - [30]. Nove i učinkovitije metode za blokiranje EGFR-posredovane prijenosu signala će biti korisna u liječenju raka. Stoga, izum da su PKG II može inhibirati aktiviranje EGFR i posljedično transdukciju signala ima važno značenje. To je jasan pokazatelj da PKG II je potencijalni endogeni inhibitor EGFR i da će dati novi savjet o strategiji liječenja raka. Pregled

Podaci istraživanja pokazali su da su neke proteinske kinaze može uzrokovati fosforilaciju EGFR, te na aktivaciju i /ili odredište. Na primjer, protein kinaze C (PKC) može izazvati fosforiliranje treonin 654 EGFR i regulira vezanje receptora i internalizacija [31]. Serin 1046/1047 (Ser1046 /1047) za fosforilaciju je potreban za EGFR desenzibilizaciju u stanicama EGF-tretirana [32] .U našim pokusima, otkrili smo fosforilaciju Thr654 i Ser1046 /1047 od EGFR i utvrdili da PKG II nije uzrokovati fosforilacija tih fosforilacije stranica. Međutim, naši rezultati pokazuju da postoji direktna interakcija između PKG II i EGFR i PKG II izazvao treonin fosforilaciju EGFR. To pokazuje da PKG II blokira aktivaciju EGFR kroz vezivanje sa i fosforilacije receptora. Točno mjesto za fosforilaciju će biti naš sljedeći istraživački cilj. Pregled

materijali i postupci

Cell Line i reagensi pregled

Ljudski rak želuca stanične linije AGS dao je u Institutu za staničnu biologiju (Shanghai, Kina). Adenovirusni vektori koji kodiraju P-galaktozidaza (PAD-lacZ) i PKG II (PAD-PKG II) bili su ljubazni darovi od Dr. Gerry Boss i dr Renate Pilz u University of California, San Diego, SAD Dulbeccovom modificiranom Eagle medija (DMEM) i fetalnog goveđeg seruma (FBS) su od GIBCO (Grand Island, NY). Antitijelo protiv PKG II je iz ABGENT biotehnologiju (San Diego, CA). Kozji anti-β-aktin, mišji anti-pan-Ras, a mišji anti-PLCγ1 antitijela su od Santa Cruz (Santa Cruz, CA). Zečji anti-p-EGFR (Tyr1068), zečji anti-p-EGFR (Tyr992), zečji anti-EGFR, mišjim anti-p-ERK (Thr 202 /Tyr 204), zečji anti-ERKl i zečje anti-p-PLCγ1 (Tyr783) protutijela su iz Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Kunić protiv PKCα i zečja anti-p-CaMK IIα (Thr286) od Bioworld tehnologije (St. Louis Park, MN). Zec anti-p-Thr antitijela iz Abcam (MA, USA) .Horseradish peroksidaza (HRP) konjugirano sekundarnih antitijela su od Jackson Immuno Research Laboratories (West Grove, PA). Pokretnu propušta cGMP analogni 8-pCPT-cGMP je od Calbiochem (San Diego, CA). EGF, U73122 i U0126 su od Sigma (St. Louis, MO). Electrochemilummiscence (ECL), reagensi su od Millipore (Billerica, MA). Ca ^{2 + indikator Fluo-3 /AM i membrane i citosolu Protein Vađenje Kit su iz Beyotime (Jiangsu, Kina). Ljudski diacil glicerol (DAG /DG) ELISA kompleta je iz Cusabio Biotech Co, Ltd (Newark, DE). Svi ostali reagensi korišteni su analitičkog stupnja. Pregled}

Priprava adenovirusne vektore

293A stanice su transfektirane s adenoviralnim vektorom koji kodira lacZ i PKG II respektivno i kultivirane do deset dana, dok CPE vidljiva. Stanice i medij kulture prikupljeni su i podvrgnuti tri ciklusa zamrzavanja-odmrzavanja. Supernatant koji sadržava adenovirusi (Ad-lacZ i Ad-PKG II) koristi se za infekciju nove 293A stanice za naglašavaju adenoviruse. Amplificirani adenovirusni pripravci su titrirani i pfu /ml je određeno, i čuva na -80 ° C do upotrebe. Pregled

Stanična kultura i Infekcija adenovirusne vektore

AGS stanice su uzgojene u DMEM isporučuje sa 10% FBS i održava se na 37 ° C u vlažnom inkubatoru s 95% zraka i 5% CO _{2. Medij je promijenjen svakih dva dana, a stanice su sub-kultivirane na ušću. Na dan prije infekcije, stanice su svježe posađene na 70-80% spajanja, a izvedena je infekcija s Ad-lacZ i Ad-PKG II. Pregled}

Western blot-pregled

uzorci proteina su podvrgnuti SDS-PAGE (8-12%) gel prema veličini molekule ciljanog proteina i elektroforeza i membranu je provedena slijedeći protokol proizvođača (bio-Rad, Hercules, CA). Primarna antitijela su inkubirani preko noći na 4 ° C u TBS-T (2% Tween-20), kao i odgovarajući sekundarna antitijela, inkubirani su 1 sat na sobnoj temperaturi u TBS-T (2% Tween-20), s tri ispiranja nakon svake inkubacije. ECL reagensi su korišteni pokazati pozitivne trake na membrani. Za izvođenje denzitometrija analize, digitalne slike pozitivnih bendova dobiveni su s Chemidoc XRS i analizirani pomoću slika program za analizu Količina jedne (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Rezultati su pokazali kako je odnos ciljanog proteina /kontrolu punjenja. Pregled

"padajućih" Analiza Active Mali G proteina Ras i Rac1 Netlogu

Aktivnost Ras je otkrivena s padajućih Postupak kao što je prethodno opisano [9]. Ukratko, stanice koje su uzgajane u kulturi u ploči od 100 mm su isprane tri puta sa hladnim PBS i lizirane dodatkom 400 ul pufera za analizu (25 mM HEPES pH 7.5, 150 mM NaCl, 1% NP40, 10% glicerol, 25 mM NaF , 10 mM MgCl _{2, 0,25% natrij deoksikolat, 1 mM EDTA, 1 mM Na 3VO 4, 10 ug /ml aprotinina i 10 ug /ml leupeptina). Uzorak se sakupi i centrifugira (14000 g, 4 ° C, 10 min) da biste dobili osloboditi od krhotina. Supernatant inkubiran s glutation-Sepharose kuglica i glutation S pregled -transferase-Ras-RBD (GST-RBD) pri 4 ° C kroz 1 sat. Kuglice su isprane 3 puta s puferom za analizu i zagrijavana u kipuće vode za oslobađanje proteina. Uzorci proteina (koji sadrže aktivnu Ras) su analizirani Western blot metodom s antitijelima pan-Ras. Aktivni Rac1 je otkrivena sa sličnom metodom, ali s protein vezne domene GST-Pak1 (GST-PBD) i antitijela protiv Rac1. Pregled}

Imunoprecipitacija pregled

Stanice rastu na pločicu od 100 mm se ispiru dva puta sa hladnim PBS i lizirane dodatkom 1 ml RIPA pufera (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 1% Triton X-100, 1 mM EDTA, 1 mM leupeptina, 1 mM fenilmetilsulfonil fluorida, 10 mM NaF, 1 mM Na _{3VO 4) po ploči. Antitijela protiv PLCγ1 i p-PLCγ1 su korišteni za imunoprecipitaciju. Talog se istraživani s antitijelima protiv ciljnih proteina. Pregled}

Analiza kalcija u citoplazmu Netlogu

Kako pratiti učinak EGF-a i PKG II na EGF-inducirane oslobađanja kalcija, AGS stanice su napunjene sa 5 uM membranske propusnog indikatora kalcija fluo-3-acetoksietil (AM) estera za 30 minuta, na 37 ° C u DMEM. Nakon nanošenja, stanice su isprane s PBS-om i suspendirane u DMEM. Fluorescencijska mjerenja su provedena pomoću konfokalnog sustav Olympus Fluoview-500. Fluo-3 je pobude argona laserskog svjetla na 488 nm i mjerena je fluorescencija na valnoj dužini od 515 nm. Pregled

ELISA Test DAG

koncentracije DAG je mjerena ELISA testom, u skladu s uputama proizvođača , To ispitivanje koristi kvantitativno sendvič imuno testom tehnikom. Antitijela specifična za DAG je prethodno nanesen mikro ploče. Standardi i uzorci su pipetirani u jažice i svaki DAG Predmetni vezana na imobilizirano antitijelo. Nakon uklanjanja nevezanih tvari A protutijelo specifično biotin-konjugiranom za DAG je dodan u jažice. Nakon ispiranja, avidin konjugirani peroksidaza (HRP) doda se u jažice. Nakon ispiranja da se ukloni bilo koji nevezani avidin-enzim reagensa, otopina supstrata doda se u jažice i boja razvije proporcionalno količini vezane DAG u početnom stupnju. Razvoj boje je zaustavljen i intenzitet boje mjeri. pregled

subeelularnim frakcioniranja pregled

subeelularnim frakcioniranje u citosolne i membranskih frakcija provedena je pomoću membrane i citosolu Protein Extraction Kit, prema proizvođačeve instrukcije. Jednoslojne kulture su isprane tri puta s ledeno hladnim PBS otopine i sastružu u hladnom puferu za homogenizaciju (HB), koji sadrži 20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 4 mM EDTA, 2 mM EGTA, 10% glicerola, 10 g /ml leupeptin, i 1 mM PMSF. Stanice su lizirane kroz sonikacijom u intervalima 4-15 s i potpuna liza je praćena mikroskopski. Homogenat je ultracentrifugiran na 86.000 g tijekom 45 minuta na 4 ° C, i supernatant je označen kao citosolnu frakciju. Talog je ponovno suspendiran u HB sadrži 1% Triton X-100 i inkubira na ledu 30 minuta. Uzorci su zatim centrifugirani na 14.000 g tijekom 20 minuta na 4 ° C, i supernatant je označen kao frakciji membrane. Svi uzorci su kuhana i očišćeni centrifugiranjem. Pregled

Cell Migracija Test pregled

Migracija aktivnost AGS stanica detektira bunara sustava (BD BioCoatTM kontrole 8,0 mm PET membrana 24 i stanične kulture umetci, BD Biosciences). Nakon tipizacije, 5 * 10 ^{4cells su posađene u gornju komoru koja sadrži medij kulture bez FBS. migracija stanica na donjoj strani membrane, inducira mediju koji sadrži 10% FBS u donjoj komori za 12 sata na 37 ° C u inkubator tkivne kulture. Migrirale stanica na donjoj strani membrane se fiksiraju u 40% otopini paraformaldehida tijekom 30 minuta, obojena s Giemsa otopini tijekom 10 minuta, a zatim isprana vodom. Obojene stanice su podvrgnute mikroskopskog pregleda pod svjetlosnim mikroskopom. Premješten stanice su prebrojane u 5 slučajno odabranih polja po umetkom, a vrijednosti su prosječne. Svi pokusi su izvedeni u tri ponavljanja ispod migracije uvjetima. Pregled}

Statistička analiza pregled

Podaci su izraženi kao srednje vrijednosti ± standardna devijacija (SD). Statistička analiza izvedena je pomoću jednog dvo-repog ANOVA s SPSS statističkom programskom podrškom. P pregled-vrijednost manja od 0,05 smatrana značajnom. Pregled

Priznanja

Zahvaljujemo dr Gerry Boss i dr Renate Pilz, University of California, San Diego, SAD za vrste darova adenovirusni konstrukata. pregled