Background VerfÜgung
Eis virdrun Fuerschung Resultater weisen, datt Typ II cGMP ofhängeg FAQ kinase (Panda II) konnt Spär vun der Aktivatioun vun epidermal Wuesstem Faktor receptor (EGFR) an doduercher d'Verbreedung an de Logbicher MAPK /Erk-mediated Signal transduction vun gastric Kriibs Zell Linn BGC-823, inhibit suggeréiert datt Panda II aner EGFR-ausgeléist Signal transduction Weeër inhibit kéint an Zesummenhang biologesch Aktivitéite vun gastric Kriibs Zellen. Dëse Pabeier war entworf d'Potential inhibition vun Panda II op EGF /EGFR-entschlof Migratioun Aktivitéit an den entspriechende Logbicher Signal transduction Weeër. VerfÜgung
Methodik /Principal effektiv VerfÜgung
An gastric Kriibs Zell Linn AGS, ze ermëttelen Ausdrock an Aktivitéit vun Panda II zur Droberoderin d'Zellen mat adenoviral bauen Zeechesaatz Panda II cDNA (Ad-Panda II) an bestéet d'Zellen mat cGMP analog 8-pCPT-cGMP eropzesetzen. Phosphorylation vu Proteinen war vun Western Blotting erwëscht an aktiv klengen G FAQ Ras an Rac1 war gemoos "Pull-verwandelt" Method. Zell Migratioun Aktivitéit war mat Ziel-gutt Équipement fonnt. Verbindlech tëscht Panda II an EGFR war mat Co-IP fonnt. D'Resultater zougedréckt EGF Migratioun vun AGS Zell stimuléiert an den Effet war bis PLCγ1 an Erk-mediated Signal transduction Weeër ze dinn. Panda II inhibited EGF-entschlof Aktivitéit Migratioun a blockéiert EGF-Ausgangspunkt Signal transduction vun PLCγ1 an MAPK /Erk-mediated Weeër duerch Präventioun EGF-entschlof Tyr 992 an Tyr 1068 phosphorylation vun EGFR. Panda II annerem mat EGFR an ëmmer threonine phosphorylation vun et. VerfÜgung
Conclusioun /Grousses VerfÜgung
Eis Resultater dé systemesch d'inhibition vun Panda II op EGF-entschlof Wanderung an Zesummenhang Signal transduction vun PLCγ1 an MAPK /Erk-mediated Weeër, wat beweist, datt Panda II op EGF /EGFR Zesummenhang Signal transduction a biologescher Aktivitéite vun gastric Kriibs Zellen duerch phosphorylating EGFR engem fargoing inhibition huet a sech der Aktivatioun vun et VerfÜgung
Fro:. Jiang L, Lan T , Chen Y, Sang J, Li Y, Wu M, et al. (2013) Panda II bremst EGF /EGFR-entschlof Migratioun vun Gastric Cancer BTS. PLoS NËMMEN 8 (4): e61674. Doi: 10.1371 /journal.pone.0061674 VerfÜgung
Redakter: Vladislav V. Glinskii, Universitéit vun Missouri-Columbia, Vereenegt Staate vun Amerika VerfÜgung
Arnaque: 30. September 2012; Akzeptéiert: 12. Mäerz 2013; Publizéiert: April 16, 2013 VerfÜgung
Copyright: © 2013 Jiang et al. Dëst ass eng oppen-Zougang Artikel ënnert de Bedingunge vun der Lizenz BY Creative Commons verdeelt, déi bereet benotzen Genehmegungen, Distributioun, an Reproduktioun vun all mëttelgrouss, gëtt d'Original Auteur an d'Quell Kaiser sinn VerfÜgung
Funding:. Dës Etude gouf vun der National Natural Science Foundation vu China, No.81272755, No.31040002, No.81001100 an No.31100974 ënnerstëtzt; D'Innovation Grant vun Jiangsu Universitéit. D'funders hu keng Roll am Etude Design, Daten Kollektioun an Analyse, Décisioun, oder Virbereedung vun der mëttelalterlech Handschrëft ze publizéieren VerfÜgung
Wettsträit Interessen:.. D'Auteuren hunn deklaréiert, datt keng Competitioun Interessen existéieren VerfÜgung
Typ II cGMP-ofhängeg FAQ kinases (Panda II) ass eng serine /threonine kinase an aktueller Fuerschung Donnéen uginn, datt dat kinase zu Regulatioun Zell biologescher Aktivitéiten eng wichteg Roll hat wéi Prolifératioun an apoptosis, virun allem zu entholl Zellen . Am Joer 2004, Cook et al VerfÜgung fonnt dass Panda II apoptosis vum Mënsch cultured prostatic stromal Zellen induce kéint [1]. Am Joer 2009, Swartling et al VerfÜgung gemellt dass Panda II inhibited Prolifératioun vu mënschlechen neuroglioma Zellen an d'inhibition war fir de Verloscht vun den Ausdrock vun Transkriptiouns Faktor Sox9 an der phosphorylation vun Akt [2] dinn. Am Joer 2011, Fallahian et al VerfÜgung fonnt dass cGMP apoptosis vun Broscht Kriibs Zellen induce konnt an dëser Effekt war bis Panda II [3] dinn. Während eis Fuerschung, fonnt mir dass den Ausdrock an d'Aktivitéit vun Panda II zu Mënsch gastric Kriibs Zell goufe vill méi niddereg wéi dat vun normal gastric mucosa Zellen [4]. Weider studéieren an eis Labo zougedréckt datt Panda II d'Prolifératioun vu gastric Kriibs Zell Linnen an Spär EGF entschlof Signal transduction vun MAPK /Erk-mediated Passerelle duerch Präventioun der Aktivatioun vun EGFR vun EGF [5], [6] inhibit konnt. Zënter der Aktivatioun vun EGFR puer Signal transduction Weeër dorënner MAPK /Erk lancéieren kann, PI3K /Akt, Jak /aktuelle Wäert an PLCγ1-mediated Weeër [7], [8], seet de erauszesichen Effet vun Panda II op Aktivatioun vun EGFR dass dës Aktivitéit vläicht eng breet-Gamme inhibitory Effekt op Signal transduction an den entspriechende Logbicher biologescher Aktivitéite vun gastric Kriibs Zellen. Dëse Pabeier war entworf dës grouss-Gamme inhibitory Effet vun Panda II duerch enquêtéiert inhibition vun Panda II op EGF-entschlof Migratioun Aktivitéit an den entspriechende Logbicher Signal transduction zu gastric Kriibs Zellen ze confirméieren. VerfÜgung Panda II bremst EGF-entschlof Zell Migratioun déi mat Signal Transduction vun PLCγ1 an MAPK /Erk-mediated Weeër VerfÜgung Zell Migratioun ass wichteg an normal Physiologie an am Krankheet Associéierten ass. Acquisitioun vun Opbau ëmmer duerch Kriibs Zellen ass eng Charakteristik, déi vun metastatic entholl Zellen ze wäit Organer ze verbreet dréit. Rezent Donnéeë weisen datt EGF der Wanderung vun Kriibs Zellen stimuléieren konnt. De Mechanismus duerch deen EGF Zell Migratioun koum ass net kloer, mä e puer Donnéeën uginn dass EGF dat do kann Signal transduction vun PLCγ1 an MAPK /Erk-mediated Weeër duerch domat. An dësem Experiment, nogewise mir d'Migratioun-Spannend Effet vun EGF zu AGS Zellen a benotzt inhibitor vun Schlëssel Komponente vun der Signal Édouard de méiglech Signal transduction mat der Wierkung verbonne ze ermëttelen. D'Resultater weisen, datt EGF Behandlung der Migratioun Aktivitéit vun AGS Zellen a béid MEK (Schlësselelement vun MAPK /Erk-mediated Passerelle) inhibitor U0126 fräi an PLCγ1 inhibitor U73122 inhibited EGF-entschlof Migratioun, wat beweist, datt EGF duerch activating souwuel MAPK Zell Migratioun Aktivitéit stimuléiert /Erk an PLCγ1 mediated Signal transduction Édouard (Figebam. 1). VerfÜgung Panda II maer EGF-entschlof Tyr 992 an Tyr 1068 Phosphorylation vun EGFR VerfÜgung Wann EGF mat EGFR Photo'en, et bewierkt auto- phosphorylation vun der receptor. Et sinn e puer auto-phosphorylation Siten déi zu verschiddene Signal transduction Passerelle verbonne sinn. Tyrosine 992 an Tyrosine 1068 sinn ënnert dem auto-phosphorylation Siten vun EGFR a si verbonne mat PLCγ1-mediated an MAPK /Erk-mediated sécher bzw.. An dësem Experiment, ze propagéieren mir de inhibitory Effet vun Panda II op der Tyrosine 992 an Tyrosine 1068 phosphorylation vun EGFR an anescht AGS Zellen behandelt vun Western blotting benotzt. D'Resultater weisen, datt EGF Behandlung engem 14 klappt Erhéijung vun Tyrosine 992 an eng 8 klappt Erhéijung vun Tyrosine 1068 phosphorylation vun EGFR verursaacht. An Zellen mat Ad-Panda II Krankheet a stimuléiert mat cGMP, war d'phosphorylation vill rofgaang (Figebam. 2, 3). Dëst uginn dass Panda II konnt EGF-entschlof Tyrosine 992 an Tyrosine 1068 phosphorylation vun EGFR verhënneren an doduercher PLCγ1-mediated an MAPK /Erk-mediated sécher inhibit. VerfÜgung Panda II evitéiert EGF-ausgeléist Main Manifestatiounen vun PLCγ1-mediated Signal Transduction Passerelle VerfÜgung PLCγ ass d'afgerappt Komponent vun receptor tyrosine kinases (RTKs). Et huet zwee isoforms: PLCγ1 ass ubiquitously verdeelt an PLCγ2 ass haaptsächlech am hematopoietic Zellen ausgedréckt. Aktivatioun vun PLCγ1 verlaangt seng Recrutement fir d'Membran an Veräin, duerch seng SH2 Domän, mat ageschalt RTKs wéi EGFR. Dësen Veräin wäert am phosphorylation vun PLCγ1 op tyrosine Pestiziden, besonnesch op tyrosine 783, an eng Erhéijung vun hirer enzymatic Aktivitéit Resultat. Mir applizéiert IP Method PLCγ1 ze isoléieren an dann benotzt Western blot Method der phosphorylation vun PLCγ1 z'entdecken. D'Resultater weisen, datt EGF Behandlung eng kloer Erhéijung vun Tyr783 phosphorylation vun PLCγ1 an d'Erhéijung vun Panda II Aktivitéit ëmmer Zellen mat Ad-Panda II an Spannend d'Zellen mat cGMP effizient duerch Droberoderin der EGF-entschlof phosphorylation vun PLCγ1 (Lalumi verhënnert. 4 ). VerfÜgung Wann et ageschalt ass, kann PLCγ1 der hydrolysis vun phosphatidylinositol 4,5-bisphos-phate (PI-4,5P 2) Meat an inositol 1,4,5-trisphosphate (IP 3) an diacylglycerol (dag), zwee Molekülle dass d'Mobiliséierung vun intracellular Ca IP3 an dag sinn zweet Vermëttler am PLCγ1-mediated Signal transduction Passerelle. IP3 ass bekannt der Verëffentlechung vun Kalzium bannenzege Geschäfter ze stimuléieren. Mir benotzt Kalzium Luucht fluo-3 /AM Kalzium an der Zytoplasma z'entdecken. D'Resultater weisen, datt EGF Behandlung der Verëffentlechung vun Ca fräi PKCα, eng isoform vun FAQ kinase C, ass e Schlësselelement vun PLCγ1-mediated Signal Passerelle a kann duerch Ca Ënnersich op d'Regelung vun Ca Panda II bremst EGF-entschlof Activatiounscode vun der Key Komponenten vun MAPK /Erk -mediated Signal Transduction Passerelle VerfÜgung MAPK /Erk ass d'Schlësselelement vun MAPK /Erk-mediated Passerelle. Phosphorylation souwuel threonine 202 an tyrosine 204 Reschter vun ERK1 an threonine 185 an tyrosine 187 Reschter vun ERK2 ass fir all enzymatic Aktivéierung néideg. D'antibody géint p-ERK1 /2 (dëss 202 /Tyr 204) war am Western blotting applizéiert d'duebel phosphorylation vun Erk z'entdecken. D'Resultater weisen, datt bannent fënnef Minutten no EGF zu Zell Kultur mëttelfristeg, phosphorylation vun ERK1 /2 an AGS Zellen Schan ausgebaut (10 klappt) an der phosphorylation vun Pre-Droberoderin d'Zellen mat Ad-Panda II an activating der Aktivitéit inhibited war mat 8-pCPT-cGMP (Figebam. 9). VerfÜgung klenger G FAQ ras ass weider Schlësselelement vun MAPK /Erk-mediated Signal Passerelle. Et gouf zwou Forme vun Zellen: GTP-gebonnen aktiv Form an PIB-gebonnen Aarbechtslosegkeet Form. Eemol Ras zu GTP-gebonnen Form ass, kann et kruet an aktivéieren Raf-1 an d'konsequent activations vun serine /threonine kinases am Signal Passerelle ufänken. Mir applizéiert "banal-verwandelt" Method d'Noutbrems Ras z'entdecken. D'Resultat huet opgedeckt, datt no EGF un der Kultur mëttelfristeg Schan, aktiv Ras zu AGS Zellen bannent fënnef Minutte méi offensichtlech. Droberoderin d'Zellen mat Ad-Panda II an hinnen mat 8-pCPT-cGMP Spannend virun Schan EGF verhënnert bedeitend der EGF-entschlof Ras Aktivéierung (Figebam. 10). VerfÜgung Panda II bremst EGF-entschlof Activatiounscode vun RAC1 klenger G FAQ RAC1 ass den Haaptgrond Member vun Rho Famill déi an Regulatioun Migratioun vun Kriibs Zellen wichteg Roll spillen. Béid PLCγ1 an MAPK /Erk mediated Signal transduction kann RAC1 aktivéieren ausgezeechent Zell Migratioun stimuléieren. Fir weider der inhibitory Effet vun Panda II op EGF /EGFR-entschlof sécher confirméieren déi Migratioun Zesummenhang ass, "Pull-verwandelt" Method applizéiert d'inhibition vun Panda II op Aktivatioun vun RAC1 z'entdecken. D'Resultat huet opgedeckt, datt EGF Behandlung eng kloer Erhéijung vun aktiv RAC1 an héich Aktivitéit vun Panda II effizient ëmmer den Aktivéierungscode vu RAC1 (Figebam. 11) inhibited. Dëst gëtt weider Beweiser vun der inhibition vun Panda II op EGF-entschlof Migratioun vun gastric Kriibs Zellen. VerfÜgung PKGII openee mat EGFR an Erlaabt dëss-phoshporylation vun der Receptor VerfÜgung D'Mechanismus duerch deen PKGII Bléck der EGF-entschlof Aktivatioun vun EGFR war vun dësem Experiment preliminarily propagéieren. Co-Immunoprecipitation applizéiert der Interaktioun tëscht PKGII an EGFR z'entdecken. Western blotting mat Pan anti phosphorylation vun threonine antibody benotzt gouf de Threonine phosphorylation vun EGFR vun PKGII ëmmer ze entdecken. D'Resultater vum Co-Immunoprecipitation gewisen, datt am AGS Zellen mat Ad-Panda II Krankheet a stimuléiert mat 8-CPT-cGMP, direkt bindend tëscht Panda II an EGFR ass fonnt (Figebam. 12, erschéngt A). Resultater vun Western blotting zougedréckt datt Aktivatioun vun Panda II threonine phosphorylation vun EGFR (Figebam. 12, erschéngt B) verursaacht. Dëst uginn dass Panda II den Aktivéierungscode EGFR duerch verbindlech mat de receptor blockéiert an dauernd phosphorylation vun et. VerfÜgung Momentan, zwee cGMP-ofhängeg FAQ kinases (PKGs), Panda ech an Panda II , goufen zu mammalian Zellen [10], [11] identifizéiert. Panda ech ass verbreet am Kierper verdeelt an Wéint sengem inhibiting Effekt op entholl Wuesstem an invasiveness an Pinguin Effekt op apoptosis vun entholl Zellen, huet et als entholl suppressor identifizéiert ginn [12]. Den Ausdrock vun Panda II ass méi Otemschwieregkeeten-limitéiert [13]. Fir eng laang Zäit, am Géigesaz zu de gutt-bewisen anti-entholl Effet vun Panda I, II antitumor Roll vun Panda keng Daten Fuerschung kloer uginn an dëser kinase war nëmmen zu e puer gestallt Funktiounen dorënner intestinal secretion, Schanken Wuesstem agebonne, a Léieren an Erënnerung [14]. Allerdéngs, Fuerschung interesséieren iwwer Panda II ass waarden an e puer nei Funktiounen vun Panda II kuerzem fonnt goufen, dorënner d'Roll vun Panda II zu Regulatioun vun epithelial Natrium Kanal an mechano-Signal transduction [15] - [17]. Méi wichteg, uginn aktueller Fuerschung Donnéeën datt Panda II ze Prolifératioun an apoptosis zu puer Zellen besonnesch an entholl Zellen, staark d'Potential Roll vun dëser Aktivitéit am Regulatioun biologescher Aktivitéite vun entholl Zellen suggeréiert dinn huet, [1] -. [6] EGFR gëtt vun all Zellen op der Uewerfläch. Mat engem molekulare Gewiicht vun 170KD, huet EGFR eng extracellular Domän, e Kräiz-Membran Domain an eng intracellular Domän. D'intracellular Domän vun EGFR huet 542 Aminosaier-Seier Reschter a kann an geschätzte Membran sub-Domän, tyrosine kinase sub-Domän, an C-Uschloss sub-Domain [18] agedeelt ginn. D'activating Prozess vun EGFR ëmfaasst déi tyrosine phosphorylation vu sengem intracellular Domain an verschidden phosphorylation Siten op der Domain ze verschiddene Signal Weeër Zesummenhang sinn. Wann EGFR ageschalt ass, kann et effector Proteinen ze seng phosphorylated C-Uschloss sub-Domain an Initiaten den effector FAQ-mediated Weeër [19], [20] rekrutéieren. Ënnert der phosphorylation Siten, tyrosine 1068 an 1086 sinn am Zesummenhang mat MAPK /Erk-mediated Passerelle an tyrosine 992 an 1173 sinn am Zesummenhang mat PLCγ-mediated Signal Passerelle [7], [8]. Eis virdrun Resultater weisen, datt Panda II BGC-823 EGF-entschlof tyrosine 1068 phosphorylation vun EGFR zu Linn gastric Kriibs Zell inhibit kéint [6], andeems d'Fro ob Panda II de phosphorylation vun anere tyrosine Siten op EGF /EGFR inhibit kann ausgezeechent hunn Migratioun Aktivitéit vun gastric Kriibs Zell Linn eng grouss-Gamme inhibition op EGF /EGFR-entschlof Signal transductions an Zesummenhang mat der biologescher Aktivitéite vun gastric Kriibs Zellen. VerfÜgung an dësem Pabeier, ze propagéieren mir d'Aktioun vum Panda II op EGF-entschlof AGS. D'Resultat huet opgedeckt, datt Panda II vun EGF ëmmer wichteg inhibition op Zell Wanderung hat. Dëst stellt weider Beweiser fir d'entholl inhibitory Effet vun Panda II demaskéierte. Fuerschung Donnéeën hunn ënner der EGF /EGFR Ausgangspunkt Signal transduction Édouard PLCγ1 an MAPK /Erk mediated Signal transduction Weeër sinn ze Migratioun Aktivitéit Zesummenhang [21], gewisen, datt [22]. Fir dëst an gastric Kriibs Zellen confirméieren, déi mir inhibitor vun Signal transduction Bestanddeel fir d'Participatioun vun MAPK /Erk an PLCγ1-mediated Weeër an de Prozess z'identifizéieren. D'Resultater weisen, datt MEK inhibitor U0126 an PLCγ1 inhibitor U73122 deelweis Migratioun Blockéierung Aktivitéit vun AGS Zellen EGF /EGFR-entschlof, wat beweist, datt souwuel Signal transduction Weeër an d'Regulatioun Prozess deelgeholl. Fir d'Potential inhibitory Aktioun vun Panda II op dës Signal transduction Weeër entschlësselen, lant mir éischter der inhibitory Effet vun Panda II op EGF Ausgangspunkt Signal transduction Passerelle PLCγ1-mediated. D'Resultater weisen, datt Panda II all vun den Haapt Evenementer vun dëser Signal transduction Passerelle penibel, wéi den Tyr 992 phosphorylation /Aktivatioun vun EGFR, déi phosphorylation /Aktivatioun vun PLCγ1, d'Équipe vun zweet Messenger dag, d'Fräiloosse vu Kalzium an cytoplasma, an der Aktivatioun vun PKC an CAMK IIα. Fir d'inhibition vun Panda II op EGF /EGFR entschlof MAPK /Erk-mediated Signal transduction Passerelle, eis virdrun Aarbecht hunn gewisen, datt Panda II der Aktivatioun vun all Schlëssel Komponente vun der Passerelle vun EGF zu gastric Kriibs Zell Linn BGC-823 entschlof bremst [ ,,,0],6]. An dësem Pabeier, ze propagéieren mir de inhibitory Effet vun Panda II op EGF /EGFR-entschlof Aktivatioun vun Schlëssel Komponente vun dëser Passerelle. D'Resultater confirméiert datt Panda II EGF-entschlof Aktivatioun vun Ras inhibited FAQ a MAPK /Erk zu AGS Zellen, suggeréiert datt Panda II och EGF /EGFR-entschlof Signal transduction vun MAPK /Erk-mediated Passerelle an dëser Kriibs Zell Linn inhibited. Dës Resultater réischt systematesch datt Panda II inhibited EGF-entschlof Migratioun vun gastric Kriibs Zellen duerch erauszesichen EGF /EGFR Ausgangspunkt Signal transduction vun PLCγ1 an MAP /Erk-mediated Weeër. VerfÜgung D'Signal transduction souwuel PLCγ1 an MAP /Erk -mediated Weeër kënne kleng G FAQ Rac1, Aktivéiert déi zu Regulatioun Zell Migratioun e Schlësselelement ass [23], [24]. Fir d'inhibition vun Panda II op dëse wichtegen Evenement vun EGF-entschlof Migratioun vun Gas Zellen confirméieren, applizéiert mir "banal-verwandelt" Method d'Aktivitéit vun Rac1 an anescht behandelt AGS Zellen ze kontrolléieren. D'Resultater weisen, datt während EGF-entschlof Migratioun, war Rac1 ageschalt an Aktivéierung war fir béid PLCγ1 an MAP /Erk-mediated sécher dinn. Ausserdeem, inhibited Panda II de EGF-entschlof Aktivatioun vun Rac 1. Dat confirméiert weider der inhibitory Effet vun Panda II op EGF /EGFR Zell Migratioun ageleet. VerfÜgung EGFR ass enk mat tumorigenensis assoziéiert. Iwwer Ausdrock an stattfannen vun EGFR geschitt oft am meeschten Cancers. Fuerschung Donnéeë gewisen, datt iwwer 50% -70% vun haett Kriibs, Colon Kriibs an Broscht Kriibs hunn héich Ausdrock vun EGFR [25]. Ausserdeem, Kriibs Patienten mat iwwer-Ausdrock vun EGFR hunn normalerweis aarmséileg hätt. Zum Beispill, EGFR iwwer-Ausdrock war zu 60% vun den Net-kleng Zell haett Kriibs (NSCLC) Patienten an der Iwwregens hätt vun de Patienten fonnt goufen aarmséileg, mat engem Iwwerliewe vun 4-5 Méint nëmmen [26]. An kënschtlech VerfÜgung Experimenter bestätegt, dass iwwer-Ausdrock vun EGFR ëmmer Transformatioun vun NIH-3T3, sou-1 an NRK Zellen an erauszesichen EGFR Aktivéierung inhibited Prolifératioun vu puer entholl Zellen [27]. Folgléch ass EGFR d'éischt Wuesstem Faktor receptor Kriips Therapie Zilscheif geholl. Puer Methoden EGFR Aktivitéit an Zesummenhang Signal transduction vun inhibiting, dorënner speziell antibodies géint EGFR an inhibitors vun EGFR, scho intensiver Fuerschung [28] - [30]. Nei a méi efficace Methoden zu EGFR-mediated Signal transduction geblockt ginn zu Kriibs Therapie hëllefräich sinn. Dofir, huet d'Opklärung datt Panda II der Aktivatioun vun EGFR an der konsequent Signal transduction inhibit kann wichteg Bedeitung. Et mobiliséiert staark dass Panda II e Potential endogenous EGFR inhibitor ass a wäert nei Uspillung op Strategie vu Kriibs Therapie gëtt. VerfÜgung Research Donnéeë gewisen, datt e puer FAQ kinases phosphorylation vun EGFR verursaache kann an Afloss seng Aktivéierung an /oder Destinatioun. Zum Beispill, FAQ kinase C (PKC) kann de phosphorylation vun Threonine 654 vun EGFR Ursaach a reguléieren receptor bindend an internalization [31]. Serine 1046/1047 (Ser1046 /1047) phosphorylation Site ass fir EGFR desensitization zu EGF-behandelt Zellen néideg [32] .In eisem Experiment, nogewise mir de phosphorylation vun Thr654 an Ser1046 /1047 vun EGFR an fonnt dass Panda II Ursaach hutt net déi phosphorylation vun dësen phosphorylation Siten. Mä, huet eis Resultater, datt et eng direkt Interaktioun tëscht Panda II an EGFR an Panda II phosphorylation vun EGFR ëmmer Threonine war. Dëst uginn dass Panda II der Aktivatioun vun EGFR duerch verbindlech mat an phosphorylating der receptor gespaart. Déi genau phosphorylation Site wäerten eis nächst Fuerschung Zil ginn. VerfÜgung Zell Linn an Reagents VerfÜgung Mënscherechter AGS gastric Kriibs Zell Linn vum Institut vun Zell Biologie gëtt war (Shanghai, China). Adenoviral vectors Zeechesaatz β-galactosidase (Heft-LacZ) an Panda II (Heft-Panda II) waren Aart Spende vum Dr. Gerry Boss a Dr. Renate Pilz am University of California, San Diego, USA Dulbecco d'geännert Eagle d'Medien (DMEM) an an et Bovine serum (FBS) sech aus GIBCO (Grand Island, NY). D'antibody géint Panda II gouf aus ABGENT Déi (San Diego, CA). Geess anti-β-actin, Maus anti-Pan-Ras, a Maus anti-PLCγ1 antibodies sech vu Santa Cruz (Santa Cruz, CA). Kanéngchen anti-p-EGFR (Tyr1068), Kanéngchen anti-p-EGFR (Tyr992), Kanéngchen anti-EGFR, Maus anti-p-Erk (dëss 202 /Tyr 204), Kanéngchen anti-Erk an Kanéngchen anti-p-PLCγ1 (Tyr783) antibodies sech aus Zell sécher Technology (Danvers, MA). Kanéngchen anti-PKCα an Kanéngchen anti-p-CaMK IIα (Thr286) sech aus Bioworld Technology (St. Louis Park, Punktzuel). Kanéngchen anti-p-dëss antibody war vun Abcam (MA, USA) .Horseradish peroxidase (HRP) -conjugated Secondaire antibodies sech aus Jackson Jonker Research Laboratoiren (West Grove, PA). D'bewosst permeable cGMP Analog 8-pCPT-cGMP war vun Calbiochem (San Diego, CA). EGF, U73122 an U0126 sech aus Fläch (St. Louis, MO). Electrochemiluminescence (ECL) reagents sech aus Millipore (Billerica, MA). Ca Virbereedunge Adenoviral Vectors VerfÜgung 293A Zellen transfected sech mat adenoviral Vecteure Zeechesaatz LacZ an Panda II respektiv an cultured fir bis zu zéng Deeg bis CPE gesi war. Déi Zellen an der Kultur mëttelfristeg sech gesammelt a mécht dräi dagsiwwer-thawing zouféieren. D'supernatant wouvun adenoviruses (Ad-LacZ an Ad-Panda II) waren benotzt nei 293A Zellen ze globalen adenoviruses zu Meenungsfreiheet nennt. Implikatioune adenoviral Preparatiounen sech titrated an der pfu /ml festleet, an huet zu -80 ° C bis benotzen. VerfÜgung Zell Kultur an Wonn mat Adenoviral Vectors VerfÜgung AGS Zellen sech cultured zu DMEM Pleséier mat 10% FBS a bei 37 ° C an enger humidified incubator mat 95% Loft a 5% CO 2 haten. Mëttelfristeg huet all zwee Deeg geännert an d'Zellen sech sub-cultured um Niewebaach. Op den Dag virun Wonn, goufen Zellen frësch bei 70-80% Niewebaach ugeplanzt, an d'Wonn mat Ad-LacZ an Ad-Panda II gesuergt huet. VerfÜgung Western Blotting VerfÜgung Protein Echantillon waren laut SDS-PAGE (8-12%) sinn ideal fir de molekulare Gréisst vun Zil- FAQ, an electrophoresis an Membran Transfermaart war folgenden Fabrikant d'Protokoll (Bio-Rad, Hercules, CA) gesuergt. Der Primärschoul antibodies sech bei 4 ° C an TBS-T (2% Tween-20) iwwer Nuecht incubated, an déi entspriechend Secondaire antibodies sech fir 1 h op RT an TBS-T (2% Tween-20), mat dräi Mëtten incubated no all incubation. ECL reagents sech benotzt de positive Bands op der dënner ze weisen. Fir densitometry Analyse, digital Biller vun de positiven Bands kritt huet mat Chemidoc XRS an analyséiert mat der Bild Analyse Programm ech sinn One (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) Leeschtunge. D'Resultater goufen wéi d'Verhältnis vun Zil- FAQ /Luede Kontroll huet. VerfÜgung "Pull-verwandelt" Analys vun den aktive klenger G FAQ Ras an Rac1 VerfÜgung D'Aktivitéiten vun Ras mat Pull-verwandelt nogewise gouf Method wéi virdru beschriwwen [9]. An dowéinst, wuessen Zellen op 100-mm Kultur Plack waren dräi mol mat kal PBS gewäsch a lysed vun 400 μl vun der lysis gefiermt Schan (25 mm HEPES pH 7.5, 150 mm NaCl, 1% NP40, 10% glycerol, 25 mm NaF , 10 mm MgCl 2, 0,25% Natrium deoxycholate, 1 mm héich, 1 mm Na 3VO 4, 10 μg /ml aprotinin, an 10 μg /ml leupeptin). D'Prouf war gesammelt an centrifuged (14000 g, 4 ° C, 10 min) vun de Protokoll ze kreien. D'supernatant war mat glutathione-Sepharose Glaspärelen incubated an glutathione S VerfÜgung -transferase-Ras-RBD (GST-RBD) bei 4 ° C fir 1 h. D'Glaspärelen waren 3 Mol mat lysis gefiermt gewäsch an am gekachten Waasser gehëtzter Proteinen ze verëffentlechen. D'FAQ Echantillon (mat aktiver Ras) waren déi Western Blotting mat antibody géint Pan-Ras analyséiert. Déi aktiv Rac1 war mat ähnlechen Method fonnt, mee mat GST-Pak1 FAQ bindend public (GST-PBD) an antibody géint Rac1. VerfÜgung Immunoprecipitation VerfÜgung D'Zellen op 100-mm Kultur zappen wuessen sech zou zwee Mol mam kal PBS an lysed vun Schan 1 ml Ripa Prellbock (50 mm Tris-HCl pH 7.4, 1% Triton X-100, 1 mm héich, 1 mm leupeptin, 1 mm phenylmethylsulfonyl fluoride, 10 mm NaF, 1 mm Na 3VO 4) pro zappen. Antibodies géint PLCγ1 a p-PLCγ1 sech fir immunoprecipitation benotzt. D'precipitates sech mat antibodies géint Zil- Proteinen Komedie. VerfÜgung Analys vun Kalzium an Cytoplasma VerfÜgung den Effet vun EGF an Panda II op EGF-entschlof Kalzium release ze kontrolléieren, huet AGS Zellen iwwerlaascht mat 5 μM vun Membran permeable Kalzium Luucht fluo-3-acetoxymethyl (aM) Ester fir 30 min bei 37 ° C an DMEM. No der Luede, Zellen sech mat PBS an suspendéiert zu DMEM gewäsch. Fluorescence Miessungen huet mat enger Olympus Fluoview-500 confocal System gesuergt. Fluo-3 war op 488 nm vun Argon Laser Liicht opgereegt an fluorescence war bei Wellelängten vun 515 nm gemooss. VerfÜgung Elisa Assay vun dag VerfÜgung dag Konzentratioune sech duerch Elisa gemooss, laut der Uweisunge vum Fabrikant . Dëst assay beschäftegt déi grouss immunoassay Technik Sandwich Aktivitéit. Antibody spezifesch fir dag gouf op engem Mikro-Plack Pre-bedeckt. Standarden a Echantillon sinn an der Wells pipetted an all dag präsent ass vun der Sommet antibody gebonnen. No Stoppen ass all unbound Substanzen, engem biotin-conjugated antibody spezifesch fir dag fir de Wells notéiert. Nom Wäschen, ass avidin conjugated Horseradish Peroxidase (HRP) un de Wells notéiert. No engem wäschen ewechzehuelen all unbound avidin-Aktivitéit reagent, engem Realitéiten Léisung ass dobäi fir de Wells a Faarf entwéckelt an Undeel un der Quantitéit vun dag an der éischter Etapp gebonnen. D'Faarf Entwécklung ass gestoppt an d'Intensitéit vun der Faarf gemooss gëtt. VerfÜgung Subcellular Zersteckelung VerfÜgung Subcellular Zersteckelung an Zytosol an Membran ufale war andems Membran an Zytosol Protein Extraktioun Kit gesuergt, no den Hiersteller d' opfuerderen. Monolayer Kulturen huet dräimol mat Äis-kal PBS Léisung gewäsch a knappen war kal homogenization Prellbock (HB) mat 20 mm Tris-HCl (pH 7,4), 4 mm héich, 2 mm EGTA, 10% glycerol, 10 g /l leupeptin, an 1 mm PMSF. D'Zellen sech via sonication lysed mat 4-15 den Intervalle a komplett lysis war microscopically iwwerwaacht. D'homogenate war um 86.000 g fir 45 min bei 4 ° C ultracentrifuged, an der supernatant war den cytosolic Ëmwandlung designéierte. D'PELLET war fir 30 min zu HB mat 1% Triton X-100 an incubated op Äis resuspended. D'Echantillon waren dunn op 14.000 g fir 20 min bei 4 ° C centrifuged, an der supernatant war den Membran Ëmwandlung designéierte. All Echantillon sech duerch centrifugation gekachten a geschëppt. VerfÜgung Zell Migratioun Assay VerfÜgung Migratioun Aktivitéit vun AGS Zellen vun transwell System (BD BioCoatTM Control 8.0 mm PET Membran 24-gutt Zell Kultur Text fonnt goufen, BD Biosciences). No trypsinization, 5 * 10 statistique Analys VerfÜgung D'Donnéeën ausgedréckt huet als Mëttel ± normale deviation (Fils). Statistesch Analyse war eng zwee-tailed ANOVA mat SPSS statistesch Software gesuergt. A P VerfÜgung -value vu manner wéi 0,05 war bedeitendst considéréiert. VerfÜgung Mir Merci Dr. Gerry Boss a Dr. Renate Pilz, Universitéit vu Kalifornien, San Diego, USA fir d'Aart Spende vun Adenoviral gesond. VerfÜgung
Resultater VerfÜgung
(1) PLCγ1 Aktivéierung. VerfÜgung
(2) dag Équipe. VerfÜgung
(3) Ca
(4) Activatiounscode vun PKCα. VerfÜgung
(5) Activatiounscode vun CaMKIIα. VerfÜgung
(1) Activatiounscode vun MAPK /Erk. VerfÜgung
(2) Activatiounscode vun ras. VerfÜgung
Diskussioun VerfÜgung
spontan a Methode VerfÜgung
Arbeschterlidder VerfÜgung
Fuerscher benotzen Phagtherapie fir erfollegräich alkoholesch Liewerkrankheet ze behandelen
Rotavirus Impfung net verbonne mam Typ 1 Diabetis mellitus Risiko
Den Neil Bell ernannt als Chief Development Officer vun Avacta Life Sciences
Neie Prozess weist verbessert Iwwerliewe fir Patienten mat fortgeschrattem kolorektalen BRAF-mutanten Kriibs
Botzprodukter kënnen de Risiko fir Asthma vun der Kandheet fanne fënnt Studie
Detailléiert Kaart vum mënschlechen Zongmikrobiom
Nei Fuerschung identifizéiert e Link tëscht dem Darmmikrobiom a Strokes
Eng rezent Studie, déi an der Cleveland Klinik gemaach gouf, weist den Impakt vun Diäten, déi héich an Cholin sinn, déi dacks a grousse Quantitéite a rout Fleesch an Eegiel fonnt gëtt, an Trimethylami
DeNovix annoncéiert Gewënner vum Platin DS11 FX+ Spektrofotometer / Fluorometer
DeNovix Inc. ass frou de Gewënner vum Concours matzedeelen fir en Don vun engem eenzegaartegen, platinfarben DS11 FX+ Spektrofotometer / Fluorometer. Zoufälleg aus Dausende vun Entréen ausgewielt, de
Migratioun beaflosst Darmmikrobiota déi ofwiesselnd d'Gesondheet fënnt Fuerscher
De mënschlechen Darm enthält Billiounen hëllefräich a frëndlech Bakterien, déi de Mikrobiom ausmaachen. Dës Mikroben gi fonnt datt se staark beaflosst vu mënschleche Bedéngungen abegraff allgemeng Ges