Ploche ONE: PKG II inhibuje EGF /EGFR vyvolaná migrácia na žalúdočné rakovinu Cells

abstraktné

Pozadie

Naše predchádzajúce výsledky výskumu ukázali, že Type II cGMP závislá na proteín kináza (PKG II) by mohol blokovať aktiváciu receptora epidermálneho rastového faktora (EGFR), a v dôsledku toho inhibujú proliferáciu a súvisiace MAPK /ERK sprostredkovanú signálnu transdukciu žalúdočné rakovina bunkové línie BGC-823, čo naznačuje, že PKG II by mohli inhibovať iné signálnych dráh EGFR-spustil a súvisiace biologickej aktivity buniek karcinómu žalúdka. Tento papier bol navrhnutý tak, aby preskúmala potenciálni inhibíciu PKG II o EGF /EGFR-indukovanej migrácie činnosti a súvisiacich signálnych dráh.

Metodika /hlavných zistení

v žalúdočnej rakovina bunkové línie AGS, expresie a aktivita PKG II boli zvýšené infekcií buniek s cDNA kódujúci adenovirový konštrukt PKG II (Ad-PKG II) a spracovanie buniek s cGMP analógové 8-pCPT-cGMP. Fosforylácie proteínov bola detekovaná Western Blot a aktívny malých proteínov Ras G a Rac1 bola meraná metódou "pull-down". Migrácia buniek aktivita bola detekovaná s trans-jamkové zariadení. Väzba medzi PKG II a EGFR bola detekovaná Co-IP. Výsledky ukázali, EGF stimulované migrácia AGS buniek a účinok bol v súvislosti s PLCγ1 a EQF sprostredkovaných signálnych dráh. PKG II potlačený EGF-indukovaná migrácia aktivita a blokované EGF-začatej signálne transdukcie PLCγ1 a MAPK /ERK sprostredkované dráh prostredníctvom prevencie fosforylácie EGF-indukovaná Tyr 992 a Tyr 1068 EGFR. PKG II viazaný EGFR a spôsobil treonín fosforylácii to.

Záver /Význam

Naše výsledky systémovo potvrdzuje inhibíciu PKG II o migrácii EGF-indukovaná a súvisiaceho prenosu signálu z PLCγ1 a MAPK /EKR sprostredkované dráhy, čo naznačuje, že PKG II má inhibícia fargoing na EGF /EGFR súvisiace transdukcia signálu a biologickej aktivity buniek karcinómu žalúdka cez fosforyláciu EGFR a blokuje aktiváciu to

Citácia :. Jiang L, T Lan , Chen Y, Sang J, Li Y, Wu M, et al. (2013) PKG II inhibuje EGF /EGFR-indukovanej migrácie žalúdočné rakovinové bunky. PLoS ONE 8 (4): e61674. doi: 10,1371 /journal.pone.0061674

Editor: Vladislav V. Glinskii, University of Missouri-Columbia, Spojené štáty |

prijatá: 30.Septembra 2012; Prijaté: 12.03.2013; Uverejnené: 16.apríla 2013

Copyright: © 2013 Jiang et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Financovanie :. Táto štúdia bol podporený národná prírodná Science Foundation Číny, No.81272755, No.31040002, No.81001100 a No.31100974; Inovácia Grant Jiangsu univerzity. Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu

Konkurenčné záujmy: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

Typ II cGMP-dependentný proteínkinázy (PKG II) je serín /treonín kinázy, ktoré sa usadzujú a výskumné dáta ukazujú, že táto kináza mala dôležitú úlohu v regulácii bunkovej biologickej aktivity, ako je proliferácia a apoptózy, a to najmä v nádorových bunkách , V roku 2004, Cook et al
zistené, že PKG II by mohlo vyvolať apoptózu u ľudských prostatických kultivovaných buniek strómy [1]. V roku 2009, Swartling et al
hlásené, že PKG II inhibujú proliferáciu ľudských neuroglioma buniek a inhibícia bola v súvislosti s poklesom expresie transkripčného faktoru Sox9 a fosforylácie Akt [2]. V roku 2011, Fallahian et al
zistené, že cGMP by mohlo vyvolať apoptózu buniek rakoviny prsníka, a tento účinok bol v súvislosti s PKG II [3]. Počas nášho výskumu sme zistili, že expresia a aktivita PKG II v ľudských nádorových bunkových línií žalúdka boli výrazne nižšie ako u normálnych buniek žalúdočnej sliznice [4]. Ďalšie štúdie v našom laboratóriu ukazujú, že PKG II môže inhibovať proliferáciu žalúdočných nádorových bunkových línií a blok EGF indukovaná signálna transdukcia MAPK /ERK-sprostredkované dráhe prostredníctvom prevencie aktiváciu EGFR EGF [5], [6]. Vzhľadom k tomu, aktivácia EGFR môže podať niekoľko signálnych dráh vrátane MAPK /ERK, PI3K /Akt, AKO /STAT a PLCγ1 sprostredkovaných dráh [7], [8], blokovacie účinok PKG II na aktiváciu EGFR naznačuje, že tento enzým môžu mať širokou škálou inhibičný účinok na prenos signálu a biologické aktivity buniek karcinómu žalúdka. Tento papier bol navrhnutý tak, aby potvrdenie tejto širokým rozsahom inhibičný účinok PKG II prostredníctvom skúmania inhibície PKG II na migračné aktivity EGF-indukovaná a súvisiace prenos signálu v rakovinových bunkách žalúdka.

Výsledky

PKG II inhibuje EGF-indukovanej migrácie buniek, ktorý je spojený so signálnou transdukcia z PLCγ1 a MAPK /ERK sprostredkované dráh

migrácie buniek je dôležitá pre normálne fyziológiu a ochorení. Akvizícia migračné schopnosti u rakovinových buniek je znakom, ktorý prispieva k šíreniu metastatických nádorových buniek do vzdialených orgánov. Nedávne údaje ukázali, že EGF by mohli stimulovať migráciu nádorových buniek. Mechanizmus, prostredníctvom ktorého EGF stimuluje migráciu buniek, nie je jasné, ale niektoré dáta naznačujú, že EGF môže to prostredníctvom iniciovať signálnu transdukciu PLCγ1 a MAPK /ERK sprostredkovanej dráhy. V tomto pokuse sme zistili, migrácia stimulujúci účinok EGF v AGS bunkách a použitý inhibítor kľúčových zložiek v signálnych dráh v šetrení možné prenos signálu spojeného s účinkom. Výsledky ukázali, že liečba EGF zvyšuje migračné aktivity AGS buniek a ako MEK (kľúčovú súčasť MAPK /ERK-sprostredkované dráhe) inhibítor U0126 a PLCγ1 inhibítor U73122 inhiboval EGF-indukovanej migrácie, čo ukazuje, že EGF stimulovanú migráciu aktivitu buniek prostredníctvom aktivácie ako MAPK /EKR a PLCγ1 sprostredkovaných signálnych dráh (obr. 1).

PKG II bloky EGF-indukovaná Tyr 992 a Tyr 1068 Fosforilácia EGFR

EGF sa viaže s EGFR, to spôsobí automatické fosforylácie receptora. Existuje niekoľko auto-fosforylačných miesta, ktoré sú pripojené k rôznym signálne transdukcie. Tyrozín 992 a tyrozín 1068 patrí medzi auto-fosforylácie miest EGFR a sú spojené s PLCγ1 sprostredkovanú a MAPK /ERK sprostredkovanú signalizáciu, resp. V tomto pokuse sme skúmali inhibičný účinok PKG II na fosforyláciu tyrozínu 992 a tyrozín 1068 EGFR v rôzne ošetrených AGS bunkách pomocou Western blotting. Výsledky ukázali, že liečba EGF spôsobila 14 záhybov zvýšenia tyrozínu 992 a 8 záhybov zvýšenie tyrozín 1068 fosforylácie EGFR. V bunkách infikovaných Ad-PKG II a cGMP stimulovanej fosforylácie bola významne znížila (obr. 2, 3). To ukazuje, že PKG II môže zabrániť fosforylácie EGF-indukovaná tyrozín 992 a tyrozín 1068 EGFR a následne inhibujú PLCγ1 sprostredkované a MAPK /ERK sprostredkovaná signalizácia.

PKG II Zabraňuje EGF-vyvolalo najvýznamnejších udalostí roka PLCγ1 sprostredkovanej transdukcia signálu dráhy

(1) aktivácia PLCγ1.

PLCγ je po prúde zložka receptorové tyrozínkinázy (RTK). To má dve izoformy: PLCγ1 je všadeprítomné distribuované a PLCγ2 je vyjadrená najmä v hematopoetických bunkách. Aktivácia PLCγ1 vyžaduje jeho náboru membránou a združenia prostredníctvom svojho SH2 doménu, s aktivovaným RTK ako je EGFR. Toto spojenie bude mať za následok fosforylácii PLCγ1 na tyrosinových zvyškov, najmä na tyrozínu 783, a zvýšenie jej enzymatickej aktivity. Použili sme metódu IP izolovať PLCγ1 a potom použitá metóda Western blotting na detekciu fosforylácie PLCγ1. Výsledky ukázali, že liečba EGF spôsobil zrejmý nárast Tyr783 fosforylácie PLCγ1 a zvýšenie aktivity PKG II cez infikovanie buniek Ad-PKG II a stimulácia buniek s cGMP účinne bráni fosforylácii EGF-indukovanej PLCγ1 (obr. 4 ).

(2) DAG formácie.

Akonáhle je aktivovaný, PLCγ1 môže katalyzovať hydrolýzu fosfatidylinozitol 4,5-bisphos-fosfátu (PI-4,5P _{2) do inositol 1,4,5-trisfosfatu (IP 3) a diacylglyceroly (DAG), dvoma molekulami, ktoré regulujú mobilizáciu intracelulárneho Ca ^{2+ a aktivita proteinkinasy C v tomto poradí. Pozorovať účinky EGF a PKG II na tvorbu DAG, metóda ELISA bola použitá na detekciu koncentrácie DAG v AGS bunkách. Výsledky ukázali, že v EGF stimulovaných AGS bunky, hladina DAG zvyšuje samozrejme aj pred infekcii Ad-PKG II a liečbe 8p-CPT-cGMP inhibuje tvorbu DAG spôsobené stimuláciou EGF (obr. 5).}}

(3) Ca ^{2+ uvoľnením.}

IP3 a DAG sú druhí poslovia v PLCγ1-sprostredkované signálne transdukcie. IP3 je známe, že stimuluje uvoľňovanie vápnika z vnútorných zásob. Použili sme vápnika indikátor fluo-3 /AM pre detekciu vápnika v cytoplazme. Výsledky ukázali, že liečba EGF zvýšené uvoľňovanie Ca ^{2+ z endoplasmatického retikula (ER) do cytoplazmy a vysokú expresiu a aktivitu PKG II významne inhibujú uvoľňovanie, odstráni efekt liečby EGF (obr. 6).}

(4) Aktivácia PKCα.

PKCα, izoformy proteín kinázy C, je kľúčovým prvkom PLCγ1-sprostredkované signálne dráhy a môže byť aktivovaný Ca ^{2+ a DAG , Aktivácia, PKCα premiestňuje z cytosolu do membrány buniek. Tak, množstvo PKCα na membráne predstavuje aktiváciu PKCα. V tomto pokuse sme skúmali inhibičný účinok PKG II o aktivácii PKCα v rôzne ošetrených AGS bunkách pomocou Western blotting. Výsledky ukázali, že počas piatich minút po pridaní EGF do kultivačného média, translokáciu PKCα z cytosolu do membránu zvyšuje dramaticky a translokácia bola inhibovaná vopred infikovanie buniek s Ad-PKG II a liečbu s 8-pCPT-cGMP ( obr. 7).}

(5) Aktivácia CaMKIIα.

Štúdium na reguláciu Ca ^{2 + /kalmodulin (CAM) -dependentní kináza II alfa (CaMKIIα), ktorý je primárna izoforma CaMKII, navrhli, že keď Ca 2 + /CaM viaže s CaMKIIα, autofosforyláciu intra-molekulárnej nastane a fosforylácie udržiava trvalé aktivácii enzýmu. Protilátka proti fosfo-CaMKIIα (Thr286) bol aplikovaný v Western blot pre detekciu fosforylácie CaMKIIα. Výsledky ukázali, že v AGS bunky ošetrené EGF, Thr286 fosforylácie CaMKIIα zvýšil o takmer 2,5 záhybov a infekcie s Ad-PKG II a liečbu s 8-pCPT-cGMP inhibuje zvýšenie fosforylácie indukovanej EGF (obr. 8).}

PKG II inhibuje EGF-indukovaná aktivácia kľúčových komponentov MAPK /ERK sprostredkovanej signálnej transdukčnej dráhy

(1) Aktivácia MAPK /ERK.

MAPK /ERK je kľúčovou súčasťou MAPK /ERK-sprostredkované dráhe. Fosforylácie na oboch treonín a tyrozín 202 204 zvyškov ERK1 a treonínu 185 a tyrozínu 187 zvyškov ERK2 je na plnú enzymatickú aktiváciu požadované. Protilátka proti p-ERK1 /2 (Thr 202 /Tyr 204) bola použitá Western blot pre detekciu dvojaký fosforylácii EQF. Výsledky ukázali, že počas piatich minút po pridaní EGF bunkového kultivačného média, fosforylácie ERK1 /2 v AGS bunkách dramaticky (10 záhybov) zvyšuje a fosforylácie bola inhibovaná vopred infikovanie buniek s Ad-PKG II a aktiváciu enzýmu s 8-pCPT-cGMP (viď obr. 9).

(2) Aktivácia rás.

Malé G proteín Ras je ďalším kľúčovým prvkom v MAPK /ERK-sprostredkovanej signálnej dráhy. To má dve formy v bunkách: GTP-viazaný aktívnu formu a GDP-viazanej neaktívnej forme. Potom, čo je v Ras GTP-viazanú formu, môže viazať a aktivovať Raf-1 a začať následným aktiváciou serín /treonín kináz v signálnej dráhe. Použili sme "pull-down" metóda detekcie aktivovaného Ras. Výsledok ukázal, že po pridaní EGF do kultivačného média, aktívny Ras v AGS bunkách zvyšuje samozrejme počas piatich minút. Infikovať bunky s Ad-PKG II a povzbudzujúce je s 8-pCPT-cGMP pred pridaním EGF významne zabránila aktiváciu EGF indukovanej Ras (obr. 10).

PKG II inhibuje EGF-indukovaná aktivácia Rac1

Malé G proteínom Rac1 je hlavným členom Rho rodiny, ktoré hrajú dôležitú úlohu pri regulácii migrácie nádorových buniek. Obaja PLCγ1 a MAPK /ERK sprostredkovaný prenos signálu môže aktivovať Rac1 a potom stimulovať bunkovú migráciu. Pre ďalšie potvrdenie inhibičný účinok PKG II na EGF /EGFR indukovanej signalizácie, ktorá je v súvislosti s migráciou, metóda "pull-down" bola použitá na detekciu inhibícia PKG II k aktivácii Rac1. Výsledok ukázal, že liečba EGF spôsobil zrejmý nárast aktívneho Rac1 a vysokou aktivitou PKG II účinne inhibuje aktiváciu Rac1 (obr. 11). To poskytlo ďalší dôkaz inhibícia PKG II o migrácii EGF-indukovaná rakovinových buniek žalúdka.

PKGII interaguje s EGFR a spôsobuje THR-phoshporylation receptora

mechanizmus, ktorý PKGII blokov aktivácia EGF-indukovaná EGFR bol predbežne skúmaná v tomto experimente. Co-Imunoprecipitácia bola použitá na detekciu interakcie medzi PKGII a EGFR. Western blotting s anti-pan fosforylácie treonínu protilátky bola použitá na detekciu fosforylácie treonínu EGFR spôsobené PKGII. Výsledky koimunoprecipitačními ukázali, že v AGS bunkách infikovaných Ad-PKG II a stimulovaných s 8-CPT-cGMP, priama väzba medzi PKG II a EGFR bol detekovaný (obr. 12, panel A). Výsledky Western blot ukazuje, že aktivácia PKG II spôsobil treonín fosforyláciu EGFR (obr. 12, panel B). To ukazuje, že PKG II zablokovala aktivačné EGFR väzbou s receptorom a spôsobuje fosforyláciu to.

Diskusia

V súčasnej dobe, dva cGMP závislé proteínkinázy (PKGS), PKG I a II PKG boli identifikované v cicavčích bunkách [10], [11]. PKG Aj je široko distribuovaný v tele, a v dôsledku svojej inhibičný účinok na rast nádoru a invazívnosti a indukčný účinok na apoptózu nádorových buniek, to bolo identifikovaný ako nádorový supresor [12]. Expresia PKG II je tkanivový obmedzená [13]. Po dlhú dobu, na rozdiel od osvedčeného protinádorového účinku PKG I, žiadny výskum údaje jasne uvedené protinádorovú úlohu PKG II, a to kinázy sa podieľa iba v niekoľkých fyziologických funkcií, vrátane intestinálnej sekrécie, rast kostí, a učenie a pamäť [14]. Avšak, výskum záujem o PKG II sa zvyšuje a niektoré nové funkcie PKG II boli nájdené v poslednom čase vrátane úlohy PKG II v regulácii epitelu kanáli sodného a mechanicko-prenos signálu [15] - [17]. Ešte dôležitejšie je, akumuláciu výskum dáta ukazujú, že PKG II súvisel s proliferácie a apoptózy v niektorých bunkách, najmä v nádorových bunkách, čo silne naznačuje potenciálnu úlohu tohto enzýmu v regulácii biologickej aktivity nádorových buniek [1] - [6].

EGFR existuje na povrchu všetkých buniek. S molekulovej hmotnosti 170KD, EGFR má extracelulárnej doménu, v priečnom membránovú doménu a intracelulárnu doménu. Intracelulárnu doménu EGFR má 542 zvyškov aminokyselín a môže byť rozdelená do približné membránové subdoménou, tyrozínkinázy sub-domény a C-terminálny sub-domény [18]. Aktivačný proces zahŕňa EGFR fosforylácie tyrozínu jeho intracelulárnu domény a rôznych fosforylačných miest na doméne sa týkajú rôznych signálnych dráh. Ak je aktivovaný EGFR, môže prijímať efektorové proteíny fosforylovanej na svojej C-terminálny sub-domény a iniciuje efektorové dráhy proteínu sprostredkovanej [19], [20]. Medzi fosforylačných miest, tyrozín 1068 a 1086 sú spojené s MAPK /ERK-sprostredkované dráhe a tyrozínu 992 a 1173 sú spojené s PLCγ-sprostredkovanej signálnej dráhy [7], [8]. Naše predchádzajúce výsledky ukázali, že PKG II môže inhibovať EGF-indukovaná tyrozín 1068 fosforyláciu EGFR v žalúdočnej rakovina bunkovej línii BGC-823 [6], čo vyvoláva otázku, či PKG II môže inhibovať fosforyláciu ďalších tyrozín miest na EGF /EGFR a potom sa inhibícia širokým rozsahom na EGF /EGFR indukovaná signálne transductions a súvisiace biologickej aktivity buniek karcinómu žalúdka.

V tomto článku sme skúmali účinok PKG II na EGF-indukovaná migračné aktivity žalúdočné rakovina bunkové línie AGS. Výsledok ukázal, že PKG II mal významnú inhibíciu na migráciu buniek spôsobenú EGF. To poskytuje ďalší dôkaz pre odhalenie nádorov inhibičný účinok PKG II. Výskumná dáta ukazujú, že medzi /EGFR zahájený signálnych dráh EGF, PLCγ1 a MAPK /ERK sprostredkované signálnych dráh súvisí s migráciou aktivite [21], [22]. Sa potvrdí túto buniek karcinómu žalúdka, bol použitý inhibítor signálu transdukcia zložky na identifikáciu účasť MAPK /ERK a PLCγ1 sprostredkovaných dráh v procese. Výsledky ukázali, že MEK inhibítor U0126 a PLCγ1 inhibítor U73122 čiastočne blokovaný EGF /EGFR-indukovanej migrácie aktivitu AGS buniek, čo ukazuje, že obe signálnych dráh zapojená do procesu regulačnej. K objasneniu potenciálny inhibičný účinok PKG II o týchto signálnych dráh, najprv skúmané inhibičný účinok PKG II na EGF zahájená PLCγ1 sprostredkovaná signálna transdukcia. Výsledky ukázali, že PKG II zabránené všetkých hlavných udalostí v tomto prenosu signálu dráhy, vrátane Tyr 992 fosforylácie /aktivácie EGFR fosforylácie /aktivácie PLCγ1, formovanie druhého posla DAG, uvoľňovanie vápnika do cytoplazme, a aktivácia PKC a CAMK IIα. Pre inhibíciu PKG II na EGF /EGFR indukovaná MAPK /ERK sprostredkovaná signálna transdukcia, naše predchádzajúce práce ukázali, že PKG II inhibuje aktiváciu všetkých kľúčových zložiek v dráhy indukovanej EGF v karcinómu žalúdka bunkové línie BGC-823 [ ,,,0],6]. V tomto článku sme skúmali inhibičný účinok PKG II o EGF /EGFR aktivácia indukované kľúčových komponentov v tejto dráhe. Výsledky potvrdili, že PKG II inhibuje EGF-indukovanú aktiváciu Ras proteínu a MAPK /ERK v bunkách AGS, čo naznačuje, že PKG II tiež inhibuje EGF /EGFR indukovanú signálnu transdukciu MAPK /ERK dráhy sprostredkované v tejto bunkovej línii karcinómu. Tieto výsledky odhalili, že systematicky PKG II inhibuje EGF-indukovanú migráciu buniek karcinómu žalúdka cez blokujúci EGF /EGFR začaté prenosu signálu z PLCγ1 a MAP /EQF sprostredkovaných dráh.

prenos signálu z oboch PLCγ1 a MAP /EKR sprostredkované dráhy môžu aktivovať malé G proteín Rac1, čo je kľúčovou zložkou pri regulácii migrácie buniek [23], [24]. K potvrdeniu inhibícia PKG II k tejto významnej udalosti migrácie EGF-indukovaná plynových buniek, sme aplikovali metódu "pull-down" pre kontrolu činnosti Rac1 v rôzne ošetrených AGS buniek. Výsledky ukázali, že počas migrácie EGF-indukovaná, Rac1 bol aktivovaný a aktivácia súvisela ako PLCγ1 a MAP /EQF sprostredkovanej signalizácie. Okrem toho, PKG II inhibuje aktiváciu EGF-indukovanej Rac 1. Tým sa ďalej potvrdzuje, že inhibičný účinok PKG II na EGF /EGFR zahájená migráciu buniek.

EGFR je úzko spojená s tumorigenensis. Nadmerná expresia a mutácie EGFR, sa často u väčšiny typov rakoviny. Dáta výskum ukázal, že viac ako 50% až 70% z rakoviny pľúc, rakoviny hrubého čreva a rakoviny prsníka majú vysokú expresiu EGFR [25]. Okrem toho, u pacientov s rakovinou s nadmernou expresiou EGFR zvyčajne majú zlú prognózu. Napríklad nadmerná expresia EGFR bola zistená u 60% non-malobunkovým karcinómom pľúc (NSCLC) u pacientov a prognóza pacientov boli chudobné, s prežitia iba 4-5 mesiacov [26]. In vitro
experimenty potvrdili, že nadmerná expresia EGFR spôsobil premenu NIH-3T3, Rat-1 a NRK buniek a blokovanie aktivácie EGFR inhibuje proliferáciu niektorých nádorových buniek [27]. V dôsledku toho, EGFR je prvý receptor rastového faktoru považovať za cieľ liečby rakoviny. Niekoľko spôsobov inhibícia EGFR aktivitu a spojený prenosu signálov, vrátane špecifických protilátok proti EGFR a inhibítory EGFR, obdržal intenzívny výskum [28] - [30]. Nové a účinnejšie metódy v blokovaní EGFR sprostredkovaná prenos signálu budú užitočné pri liečbe rakoviny. Preto je zistenie, že PKG II môžu inhibovať aktiváciu EGFR a následný prenos signálu má dôležitý význam. To naznačuje, že PKG II je potenciálny endogénne inhibítor EGFR a bude poskytovať nové narážku na stratégiu liečby rakoviny.

Dáta Výskum ukázal, že niektoré proteínové kinázy môže vyvolať fosforyláciu EGFR a ovplyvniť jeho aktivácie a /alebo miesta určenia. Napríklad, proteín kinázy C (PKC), môže spôsobiť, že fosforylácie treonínu 654 z EGFR a reguluje väzby na receptor a internalizácie [31]. Serín 1046/1047 (/1047 Ser1046) fosforylačných miesto je vyžadované pre EGFR desenzibilizácia v bunkách EGF ošetrených [32] .V našich pokusoch sme zistili fosforylácii Thr654 a Ser1046 /1047 EGFR a zistil, že PKG II nespôsobil fosforylácie týchto fosforylačných miest. Avšak, naše výsledky ukázali, že existuje priama interakcia medzi PKG II a EGFR a PKG II spôsobil treonín fosforyláciu EGFR. To ukazuje, že PKG II zablokovala aktiváciu EGFR prostredníctvom väzby s a fosforylovať vyššie receptor. Presný fosforylácie stránky budú naše ďalšie výskum cieľ.

materiáloch a metódach

bunkové línie a činidlá

rakovina žalúdka u ľudí bunkové línie AGS boli poskytnuté Institute of Cell Biology (Shanghai, Čína). Adenovirové vektory kódujúce beta-galaktozidázu (PAD-LacZ) a PKG II (PAD-PKG II) boli milí dary od Dr. Gerry Boss a Dr. Renate Pilz na University of California, San Diego, USA Dulbecco modifikovanom Eaglovho média (DMEM) a fetálny hovädzie sérum (FBS) boli od firmy GIBCO (Grand Island, NY). Protilátka proti PKG II bol od ABGENT Biotechnology (San Diego, CA). Kozí anti-β-aktínu, myší anti-pan-Ras a myší anti-PLCγ1 protilátky boli od Santa Cruz (Santa Cruz, CA). Králičie anti-p-EGFR (Tyr1068), králičie anti-p-EGFR (Tyr992), králičie anti-EGFR, myší anti-p-EKR (Thr 202 /Tyr 204), králičie anti-EKR a králičie anti-p-PLCγ1 (Tyr783) protilátky boli od Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Králičie anti-PKCα a králičie anti-p-CaMK IIα (Thr286) boli od BIOWORLD Technology (St. Louis Park, MN). Králičie anti-p-Thr protilátka bola od abca (MA, USA) .Horseradish peroxidáza (HRP) konjugovanou sekundárne protilátky boli z Jackson Immuno Research Laboratories (West Grove, PA). Bunková priepustná cGMP analógové 8-pCPT-cGMP bol od Calbiochem (San Diego, CA). EGF, U73122 a U0126 boli od firmy Sigma (St. Louis, MO). Elektrochemiluminiscenční (ECL) činidlá boli od Millipore (Billerica, MA). Ca ^{2 + indikátor Fluo-3 /AM a membrána a cytosolu Proteín Extraction Kit boli od Beyotime (Jiangsu, Čína). Ľudský diacyl glycerol (DAG /DG) ELISA Kit bol od Cusabio Biotech Co., Ltd. (Newark, DE). Všetky ostatné reagencie boli použité analytickej čistoty.}

Príprava adenovirových vektorov

293A bunky boli transfekovány adenovirovým vektorom kódujúcim LacZ a PKG II respektíve a kultivované po dobu až desať dní, kým CPE bol videný. Bunky a kultivačné médium boli zozbierané a podstúpil tri zmrazovania-rozmrazovania. Supernatant obsahujúci adenovírusy (Ad-LacZ a Ad-PKG II) boli použité k infekcii nových buniek 293A zosilniť adenovírusov. Amplifikovanej adenovirové prípravky bol titrovaný a PFU /ml bol stanovený, a uchovávané v -80 ° C až do použitia.

Bunková kultúra a infekcie s adenovirových vektorov

AGS bunky boli kultivované v DMEM dodávanej s 10% FBS a udržiavané na teplote 37 ° C vo zvlhčenom inkubátore s 95% vzduchu a 5% CO _{2. Médium bolo menené každé dva dni a bunky boli kultivované pri sub-sútoku. V deň pred infekcii boli bunky čerstvo vysadené na 70-80% zhlukovania, a bola vykonaná infekcia Ad-LacZ a Ad-PKG II.}

Western blotting

Proteínové vzorky boli podrobené SDS-PAGE (8-12%) gélu podľa veľkosti molekúl cieľového proteínu, a elektroforézu a membránou prenos bol vykonaný po protokolu výrobcu (Bio-Rad, Hercules, CA). Primárne protilátky boli inkubované cez noc pri 4 ° C v TBS-T (2% Tween-20), a zodpovedajúce sekundárne protilátky boli inkubované po dobu 1 hodiny pri teplote miestnosti v TBS-T (2% Tween-20), s tromi umýva po každej inkubácii. ECL reagencie boli použité pre zobrazenie pozitívnu skupiny na membráne. Na vykonanie analýzy denzitometria, digitálne obrazy pozitívnych pásov boli získané s Chemidoc XRS a analyzované za použitia programu analýzy obrazu Množstvo One (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Výsledky boli ukázali ako pomer cieľového proteínu /kontrola nanášania.
Analýza

"Pull-down" aktívnych Small G proteínom Ras a Rac1

Bola zistená aktivita Ras s roletovou spôsob, ako bolo opísané skôr [9]. V stručnosti, bunky rastúce na 100 mm kultivačné doštičky boli trikrát premyté studeným PBS a lyžovali pridaním 400 ul lyzačného pufra (25 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% NP40, 10% glycerol, 25 mM NaF , 10 mM MgCl _{2, 0,25% deoxycholát sodný, 1 mM EDTA, 1 mM Na 3VO 4, 10 ug /ml aprotinínu a 10 ug /ml leupeptinu). Vzorka bola odobratá a centrifugován (14000 g, 4 ° C, 10 min), aby sa zbaviť nečistôt. Supernatant bol inkubuje sa s ním s glutatión-Sepharose korálky a glutatiónu S
-transferase-Ras-RBD (GST-RBD) pri teplote 4 ° C po dobu 1 hodiny. Perličky boli premyté 3 krát s lyzačním pufra a zahrieva vo vriacej vody pre uvoľnenie proteínov. Vzorky proteínov (ktoré obsahujú aktívny Ras) boli analyzované metódou Western blot s protilátkou proti pan-Ras. Aktívne Rac1 bola detekovaná podobným spôsobom, ale s doménou proteínu GST-Pak1 viazanie (GST-PBD) a protilátkou proti Rac1.}

Imunoprecipitácia

Bunky rastúce na 100 mm kultivačné doštičky boli premyté dvakrát studeným PBS a lyžovali pridaním 1 ml pufru RIPA (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 1% Triton X-100, 1 mM EDTA, 1 mM leupeptinu, 1 mM fenylmetylsulfonyl fluorid, 10 mM NaF, 1 mM Na _{3VO 4) na dosku. Protilátky proti PLCγ1 a p-PLCγ1 boli použité pre imunoprecipitáciou. Zrazeniny boli testované s protilátkami proti cieľových proteínov.}

Analýza vápnika v cytoplazme

Ak chcete sledovať účinok EGF a PKG II na EGF-indukovanej uvoľňovanie vápnika, AGS buniek zavedie 5 uM membrány priepustnej indikátora vápnika fluo-3-acetoxymethyl (AM) kyseliny počas 30 minút pri teplote 37 ° C v DMEM. Po naložení, bunky boli premyté PBS a suspendované v DMEM. Meranie fluorescencie sa uskutočnilo za použitia konfokálního systému Olympus Fluoview-500. Fluo-3 bol budený argónu laserového svetla pri 488 nm a fluorescencie sa meria pri vlnovej dĺžke 515 nm.

ELISA Test DAG

koncentrácie DAG boli merané pomocou ELISA podľa inštrukcií výrobcu , Tento test využíva kvantitatívnu sendvičové enzymoimunoeseje techniku. Protilátka špecifická pre DAG bola vopred nanesená na mikro-dosky. Štandardy a vzorky sa napipetuje do jamiek a akejkoľvek prítomnej DAG je viazaný na imobilizované protilátku. Po odstránení všetkých nenaviazaných látok, je protilátka špecifická biotínom konjugovaná na DAG sa pridá do jamiek. Po premytí, avidín konjugovanou chrenovou peroxidázou (HRP) sa pridá do jamiek. Po premytí pre odstránenie akejkoľvek nenaviazané avidín-enzým činidla, roztok substrátu sa pridá do jamiek a zafarbenie, v pomere k množstvu DAG viazaného v počiatočnom kroku. Vývoj farby sa zastaví a meria sa intenzita farby.

subcelulárnu Frakcionácia

subcelulárnu frakcionácie do cytosolu a membránových frakcií sa vykonáva za použitia membránové a cytosolu Proteín Extraction Kit, podľa výrobcom inštrukcie. Jednovrstvové kultúry boli premyté trikrát ľadovo chladným PBS roztoku a poškriabaný do chladného homogenizačného pufra (HB), ktorý obsahuje 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 4 mM EDTA, 2 mM EGTA, 10% glycerolu, 10 g /ml leupeptinu, a 1 mM PMSF. Bunky boli lyžovanie sonikací s 4-15 s intervalmi a kompletné lýza bola sledovaná mikroskopicky. Homogenát bol ultracentrifugován pri 86.000 g počas 45 minút pri teplote 4 ° C a supernatant bol určený ako cytozolové frakcie. Peleta bola resuspendovaného v HB obsahujúcom 1% Triton X-100 a inkubuje sa s ním na ľade po dobu 30 min. Vzorky boli potom centrifugovány pri 14000 g počas 20 minút pri teplote 4 ° C a supernatant bol označený ako membránové frakcie. Všetky vzorky boli uvarené a vyčistený odstreďovaním.

Cell Migration Test

Migrácia aktivita AGS buniek boli detekované transwell systémom (BD BioCoatTM Control 8,0mm PET Membrane 24 jamiek na bunkových kultúrach vložky, BD Biosciences). Po trypsinizaci, 5 * 10 ^{4cells boli vrúbľovať do hornej komory obsahujúcej kultivačné médium bez FBS. Bunková migrácia na spodnú stranu membrány sa indukuje médiom obsahujúcim 10% FBS v dolnej komore po dobu 12 hodín pri teplote 37 ° C v inkubátore pre tkanivové kultúry. Migrované bunky na spodnú stranu membrány boli fixované v 40% roztoku paraformaldehydu po dobu 30 minút, zafarbené v roztoku Giemsa po dobu 10 minút, a potom sa prepláchne vodou. Zafarbený Bunky boli podrobené mikroskopické vyšetrenie pod svetelným mikroskopom. Migrované bunky boli počítané v 5 náhodne vybraných polí za vložkou, a hodnoty boli spriemerované. Všetky experimenty boli vykonané s tromi repliky za každé z podmienok migrácie.}

Štatistická analýza

Dáta bola vyjadrená ako priemer ± štandardná odchýlka (SD). Štatistická analýza bola vykonaná za použitia dvoch-sledoval ANOVA s SPSS štatistickým softvérom. A P
-hodnota menšia ako 0,05 bola považovaná za významnú.

Poďakovanie

Ďakujeme Dr. Gerry šéf a Dr. Renate Pilz, University of California v San Diegu, USA na druhu darčeky adenovirových konštruktov.

• PLoS ONE: sociodemografických a geografických faktorov v smrteľnosti pažeráka a žalúdka rakovinu vo Švédsku
• Ploche ONE: Zvýšená expresia CD151 predpovedá prognóza pacientov s resekciou rakoviny žalúdka