PLoS ONE: PKG II Estää EGF /EGFR aiheuttama Migration mahasyöpä- Cells

tiivistelmä

Background

Aiemmat tutkimustulokset osoittivat, että tyypin II cGMP riippuvaisen proteiinikinaasin (PKG II) voisivat estää aktivoitumisen kasvutekijän reseptorin (EGFR) ja näin ollen inhiboimaan ja siihen liittyvän MAPK /ERK-välitteiseen signaalin siirtoon mahasyövän solulinjan BGC-823, mikä viittaa siihen, että PKG II saattaisi estää muita EGFR laukaisema signaalintransduktioreitteihin ja niihin liittyviä biologisia vaikutuksia mahalaukun syöpäsoluja. Tämä paperi suunniteltiin tutkimaan mahdollisia esto PKG II EGF /EGFR aiheuttaman muuttoliikkeen toiminnan ja siihen liittyvien signaalitransduktioreaktioteiden.

Menetelmät /Principal Havainnot

mahasyövän solulinjassa AGS, ilmaisun ja aktiivisuus PKG II lisättiin infektoimalla solut adenoviruksen, joka koodaa PKG II cDNA (Ad-PKG II) ja käsittelemällä soluja cGMP analogi 8-pCPT-cGMP. Proteiinien fosforylaatio havaittiin Western blotting -tekniikalla ja aktiivisen pienen G-proteiinin Ras ja Rac1 mitattiin "Pull-down" -menetelmällä. Solumigraation aktiivisuutta havaittiin laajuisten hyvin laitteet. Sitovat välillä PKG II ja EGFR havaittiin Co-IP. Tulokset osoittivat EGF stimuloi kulkeutumista AGS solun ja vaikutus liittyi PLCγ1 ja ERK-välitteinen signaalintransduktioreitteihin. PKG II esti EGF aiheuttaman muuttoliikkeen aktiivisuutta ja estää EGF-aloittanut signaalitransduktioon PLCγ1 ja MAPK /ERK-välitteinen polkuja estää EGF aiheuttaman Tyr 992 ja Tyr 1068 fosforylaatiota EGFR. PKG II sidottu EGFR ja aiheutti treoniinifosforylaatio sitä.

Päätelmä /merkitys

tulokset systeemisesti vahvistaa esto PKG II EGF aiheuttaman muuttoliikkeen ja siihen liittyvien signaalitransduktioon PLCγ1 ja MAPK /ERK-välitteinen reittejä, mikä osoittaa, että PKG II on fargoing estoa EGF /EGFR liittyvät signaalitransduktion sekä biologisen toiminnan mahalaukun syövän soluihin fosforyloimaan EGFR ja aktivaation salpaamiseksi sitä.

Citation: Jiang L, Lan T Chen Y, Sang J, Li Y, Wu M, et al. (2013) PKG II Estää EGF /EGFR-johtuva muuttoliike mahasyövän Cells. PLoS ONE 8 (4): e61674. doi: 10,1371 /journal.pone.0061674

Editor: Vladislav V. Glinskii, University of Missouri-Columbia, Yhdysvallat

vastaanotettu: 30 syyskuu 2012; Hyväksytty: 12 maaliskuu 2013; Julkaistu: 16 huhtikuu 2013

Copyright: © 2013 Jiang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat National Natural Science Foundation of China, No.81272755, No.31040002, No.81001100 ja No.31100974; Innovaatio Grant Jiangsu University. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Tyyppi II cGMP-riippuvaisen proteiinikinaasien (PKG II) on seriini /treoniini-kinaasi ja kertynyt tutkimustieto osoitti, että tämä kinaasi oli tärkeä rooli säätelyssä solussa biologisia vaikutuksia, kuten leviämisen estämiseen ja apoptoosin, erityisesti kasvainsoluissa . Vuonna 2004 Cook et al
havaittu, että PKG II voivat aiheuttaa apoptoosin ihmisen viljeltyjen eturauhasen stromasoluja [1]. Vuonna 2009, Swartling et ai
todettu, että PKG II esti proliferaatiota ihmisen neuroglioomasoluihin ja inhibitio liittyi lasku ilmentymisen transkriptiotekijän Sox9 ja fosforylaation Akt [2]. Vuonna 2011, Fallahian et ai
havaittu, että cGMP voivat aiheuttaa apoptoosin rintasyövän solujen ja tämä vaikutus liittyi PKG II [3]. Aikana tutkimus, huomasimme, että ilmaisun ja toiminnan PKG II ihmisen mahasyövän solulinjat olivat huomattavasti alhaisemmat kuin normaali mahan limakalvon soluista [4]. Lisätutkimuksia laboratoriossamme osoittivat, että PKG II voi estää leviämisen mahasyövän solulinjojen ja lohko EGF aiheuttama signaalin siirtoon MAPK /ERK-välitteinen reitin kautta estää aktivoitumisen EGFR EGF [5], [6]. Koska aktivointi EGFR voi aloittaa useita signaalintransduktioreitteihin lukien MAPK /ERK, PI3K /Akt, JAK /STAT ja PLCγ1-välitteisen reittejä [7], [8], estovaikutus PKG II aktivointi EGFR viittaa siihen, että tämä entsyymi voi olla laaja-estävä vaikutus signaalin siirtoon ja siihen liittyvän biologista aktiivisuutta mahalaukun syöpäsoluja. Tämä paperi on suunniteltu vahvistamaan tämän laaja-estävää vaikutusta PKG II kautta tutkivat eston PKG II EGF aiheuttaman muuttoliikkeen toimintaa ja siihen liittyvä signaalitransduktion mahalaukun syöpäsoluja.

Tulokset

PKG II Estää EGF aiheuttamaa Cell Migration joka liittyy signaaliin transduktio PLCγ1 ja MAPK /ERK-välitteinen Pathways

Cell maahanmuutto on tärkeä normaalissa fysiologian ja taudin. Migraatio kyky syöpäsolujen on ominaisuus, joka vaikuttaa leviämiseen etäpesäkekasvainten solujen kaukaisiin elimiin. Viimeaikaiset tiedot osoittivat, että EGF voi stimuloida muuttoa syöpäsoluja. Mekanismi, jonka kautta EGF stimuloi solujen vaeltamiseen ei ole selvä, mutta jotkut tulokset osoittivat, että EGF voi tehdä tätä kautta aloittamista signaalitransduktioon PLCγ1 ja MAPK /ERK-välitteinen reittejä. Tässä kokeessa havaitsimme siirtyminen stimuloiva vaikutus EGF AGS soluissa ja käytetty estäjä keskeisten komponenttien signaalin polkuja tutkimaan mahdollisia signaalitransduktion liittyvä vaikutus. Tulokset osoittivat, että EGF käsittely lisäsi muuttoa aktiivisuutta AGS solujen ja molemmat MEK (avaintekijä MAPK /ERK-välitteinen reitti) estäjä U0126 ja PLCγ1 estäjä U73122 esti EGF muuttoliike, mikä osoittaa, että EGF stimuloi solumigraatiota aktiivisuuden kautta aktivoimalla molemmat MAPK /ERK ja PLCγ1 välittämän signaalintransduktioreitteihin (Fig. 1).

PKG II Blocks EGF aiheuttama Tyr 992 ja Tyr 1068 fosforylaatio EGFR

Kun EGF sitoutuu EGFR, se aiheuttaa auto- fosforylaatio reseptori. On olemassa useita auto-fosforylaatiopaikkaa, joka on kytketty eri signaalitransduktioreitin. Tyrosiini 992 ja tyrosiini 1068 ovat auto-fosforylaatiokohtaa EGFR ja liittyy PLCγ1-välitteisen ja MAPK /ERK-välitteistä signalointia vastaavasti. Tässä kokeessa olemme tutkineet estävää vaikutusta PKG II tyrosiinin 992 ja tyrosiini 1068 fosforylaatio EGFR eri käsiteltiin AGS-soluista käyttämällä Western-blottauksella. Tulokset osoittivat, että EGF-hoito aiheutti 14 taittuu kasvua tyrosiini 992 ja 8 taittuu kasvua tyrosiini 1068 fosforylaation EGFR. Infektoiduissa soluissa Ad-PKG II ja stimuloidaan cGMP, fosforylaatio oli vähentynyt merkittävästi (kuvio. 2, 3). Tämä osoitti, että PKG II voisi estää EGF aiheuttama tyrosiini 992 ja Tyrosiini 1068 fosforylaatioon EGFR ja siten estävät PLCγ1 välittämää ja MAPK /ERK-välitteinen signalointi.

PKG II Estää EGF laukaisema Main tapahtumia PLCγ1 välittämän Signal Transduction Pathway

(1) PLCγ1 aktivointi.

PLCγ on alavirtaan komponenttia reseptorityrosiinikinaasien (RTK: t). Siinä on kaksi isoformia: PLCγ1 kaikkialla läsnä jaetaan ja PLCγ2 saadaan pääasiassa hematopoieettisten solujen. Aktivointi PLCγ1 vaatii palvelukseenotostaan ​​kalvon ja yhdistyksen kautta SH2 domain, aktivoidulla RTK kuten EGFR. Tämä yhteys johtaa fosforylaatioon PLCγ1 tyrosiini tähteitä, erityisesti tyrosiini 783, ja lisää sen entsymaattinen aktiivisuus. Käytimme IP menetelmä eristää PLCγ1 ja sitten käytetään Western blot -menetelmällä havaita fosforylaatiota PLCγ1. Tulokset osoittivat, että EGF hoito aiheutti selvää kasvua Tyr783 fosforylaation PLCγ1 ja kasvu PKG II toiminnan kautta infektoimalla solut Ad-PKG II ja stimuloimalla soluja cGMP tehokkaasti esti EGF aiheuttamaa fosforylaatiota PLCγ1 (Fig. 4 ).

(2) DAG muodostumista.

Kun se on aktivoitu, PLCγ1 voi katalysoida hydrolyysiä fosfatidyyli 4,5-bisphos-fosfaatti (PI-4,5P _{2) osaksi inositoli 1,4,5-trisfosfaattia (IP 3) ja diasyyliglyseroliksi (DAG), kaksi molekyyliä, jotka säätelevät liikkeelle solunsisäisen Ca ^{2+ ja proteiinikinaasi C: n aktiivisuus vastaavasti. Jos haluat tarkkailla vaikutuksia EGR ja PKG II muodostumista DAG, ELISA-menetelmää käytettiin havaitsemaan DAG pitoisuus AGS soluissa. Tulokset osoittivat, että EGF stimuloi AGS soluja, taso DAG kasvoi selvästi ja ennalta infektio Ad-PKG II ja hoito 8p-CPT-cGMP esti muodostumista DAG aiheuttama stimulaatio EGF (Fig. 5).}}

(3) Ca ^{2 + vapauttava.}

IP3 ja DAG ovat toinen sanansaattajia PLCγ1-välitteiseen signaalin siirtoon kautta. IP3 tiedetään stimuloivan vapauttamaan kalsiumia sisäisistä myymälöissä. Käytimme kalsium ilmaisin fluo-3 /AM havaita kalsiumia sytoplasmassa. Tulokset osoittivat, että EGF käsittely lisäsi vapautumista Ca ^{2 + alkaen Endoplasmakalvosto (ER) sytoplasmaan ja korkea ilmaisun ja toimintaa PKG II estivät merkittävästi julkaisu, käännetään EGF hoidon (Fig. 6).}

(4) aktivointi PKC-a.

PKC-a, isoformia proteiinikinaasi C, on keskeinen osa PLCγ1-välitteisen signaalireitin ja voi aktivoida Ca ^{2+ ja DAG . Aktivoidaan, PKC-a translokoituu mistä sytosolista kalvon solujen. Niin, määrä PKC-a-kalvolla edustaa aktivointi PKC-a. Tässä kokeessa olemme tutkineet estävää vaikutusta PKG II aktivaation PKC-a on eri käsiteltiin AGS-soluista käyttämällä Western-blottauksella. Tulokset osoittivat, että viiden minuutin kuluessa lisäämisen EGR viljelyalustaan, translokaatio PKC-a välillä sytosolin membraanille lisääntynyt dramaattisesti ja translokaation estyi esi-infektoimalla solut Ad-PKG II ja hoito 8-pCPT-cGMP ( kuva 7).}

(5) aktivoiminen CaMKIIα.

Tutkimukset sääntelystä Ca ^{2 + /kalmoduliini (CAM) -riippuvaista kinaasi II alfa (CaMKIIα), joka on ensisijainen isoformin CaMKII, ovat ehdottaneet, että kun Ca 2 + /CaM sitoutuu CaMKIIα, molekyylin sisäiseen autofosforylaation tapahtuu ja fosforylaatio ylläpitää jatkuva aktivointi entsyymin. Vasta-aine fosfo-CaMKIIα (Thr286) sovellettiin Western blotting havaita fosforylaatiota CaMKIIα. Tulokset osoittivat, että AGS käsitelty solu EGF, Thr286 fosforylaatiota CaMKIIα lisääntyivät lähes 2,5 taittuu ja infektio Ad-PKG II ja hoito 8-pCPT-cGMP esti kasvua fosforylaation aiheuttama EGF (Fig. 8).}

PKG II Estää EGF aiheuttama aktivointi Tärkeimmät komponentit MAPK /ERK -välitteisen signaalinvälitysreitin

(1) MAPK /ERK.

MAPK /ERK on keskeinen osa MAPK /ERK-välitteinen reitin. Fosforylaatio sekä treoniini 202 ja tyrosiinin 204 jäämiä ERK1 ja treoniinin 185 ja tyrosiinin 187 jäämiä ERK2 tarvitaan täyden entsymaattisen aktivointia. Vasta-aine vastaan ​​p-ERK1 /2 (Thr 202 /Tyr 204) sovellettiin Western blottauksella havaita kaksi fosforylaatiota ERK. Tulokset osoittivat, että viiden minuutin kuluessa lisätään EGR soluviljelyväliaineeseen fosforylaatiota ERK1 /2 AGS-solujen määrä nousi jyrkästi (10 taittuu) ja fosforylaatio estyi esi-infektoimalla solut Ad-PKG II ja aktivoimalla entsyymin kanssa 8-pCPT-cGMP (Fig. 9).

(2) aktivointi ras.

Pieni G-proteiini Ras on toinen avaintekijä MAPK /ERK-välitteisen signaalireitin. Siinä on kaksi muotoja soluissa: GTP-sidottu aktiivinen muoto ja BKT-sidottu aktiivinen muoto. Kun Ras on GTP-sitoutunut muoto, se voi sitoa ja aktivoida Raf-1 ja aloittaa seurauksena aktivointien seriini /treoniini kinaasien signaalireitin. Käytimme "pull-down" -menetelmällä havaitsemiseksi aktivoitua Ras. Tulos osoitti, että sen jälkeen kun EGR viljelyalustaan, aktiivinen Ras AGS-solujen määrä nousi selvästi viiden minuutin kuluessa. Infektoimalla solut Ad-PKG II ja stimuloimalla niitä 8-pCPT-cGMP ennen lisäämistä EGF merkittävästi esti EGF-indusoidun Ras aktivointi (Fig. 10).

PKG II Estää EGF aiheuttama aktivointi Rac1

Pieni G-proteiinin Rac1 on tärkein jäsen Rho perhe, joka on tärkeä rooli säätelyssä kulkeutumista syöpäsoluja. Sekä PLCγ1 ja MAPK /ERK välitteiseen signaalin siirtoon voi aktivoida Rac1 ja sen jälkeen stimuloivat solujen vaeltamiseen. Edelleen vahvistavat estävää vaikutusta PKG II EGF /EGFR-indusoitu signaali, joka liittyy maahanmuuttoon, "Pull-down" menetelmää sovellettiin havaitsemiseksi eston PKG II aktivointi Rac1. Tulos osoitti, että EGF hoito aiheutti selvää lisäystä aktiivisten Rac1 ja korkea aktiivisuus PKG II tehokkaasti esti aktivoinnin Rac1 (Fig. 11). Tämä lisätodisteita eston PKG II EGF aiheuttamaa kulkeutumista mahan syöpäsoluja.

PKGII vuorovaikutuksessa EGFR ja syyt Thr-phoshporylation reseptorin

mekanismi, jonka avulla PKGII lohkojen EGF-indusoitu aktivaatio EGFR alustavasti tutkittu tässä kokeessa. Samanaikainen immunosaostus levitettiin havaita vuorovaikutusta PKGII ja EGFR. Western blotting, jossa pannulla anti fosforylaatiota treoniini vasta-ainetta käytetään havaitsemaan Treoniini fosforylaatio EGFR aiheuttama PKGII. Tulokset samanaikainen immunosaostus osoitti, että AGS soluissa tartunnan Ad-PKG II ja stimuloidaan 8-CPT-cGMP, suoran sitoutumisen välillä PKG II ja EGFR havaittiin (Fig. 12, paneeli A). Tulokset Western blotting osoitti, että aktivointi PKG II aiheutti treoniinifosforylaatio EGFR (Fig. 12, paneeli B). Tämä osoitti, että PKG II esti aktivointi EGFR sitoutumalla reseptoriin ja aiheuttaa fosforylaatio se.

Keskustelu

Tällä hetkellä kaksi cGMP-riippuvaisen proteiinikinaasit (PKG), PKG I ja PKG II , on havaittu nisäkässoluissa [10], [11]. PKG I laajalti kehossa ja koska sen estävä vaikutus kasvaimen kasvuun ja invasiivisuus ja indusoiva vaikutus kasvainsolujen apoptoosin, se on tunnistettu tuumorisuppressori [12]. Ilmaus PKG II on enemmän kudosta rajoitettu [13]. Jo pitkään, toisin kuin hyvin osoittautui antituumorivaikutus PKG I, mitään tutkittua tietoa selvästi antitumor rooli PKG II ja tämä kinaasi vasta osallisena useissa fysiologisia toimintoja kuten suolen eritystä, luun kasvua ja oppimista sekä muistin [14]. Kuitenkin tutkimus kiinnostusta PKG II lisääntyy ja uusia toimintoja PKG II on löydetty viime aikoina, johon kuuluu myös PKG II säätelyyn epiteelin natriumkanava- ja mekaanis-signaalitransduktion [15] - [17]. Vielä tärkeämpää on, varaamiseen tutkimustiedon osoitti, että PKG II liittyi lisääntymistä ja apoptoosin joissakin soluissa, erityisesti kasvainsoluissa, mikä viittaa vahvasti siihen mahdollista roolia tämän entsyymin säätelyssä biologisia vaikutuksia syöpäsolujen [1] - [6].

EGFR olemassa pinnalla kaikkien solujen. Jonka molekyylipaino on 170KD, EGFR on solunulkoinen domeeni, rajat kalvon domeeni ja solunsisäinen domeeni. Solunsisäisen domeenin EGFR on 542 aminohappotähdettä ja voidaan jakaa arvioitu kalvoon aliverkkotunnus, tyrosiinikinaasin aliverkkotunnus, ja C-terminaali sub-domain [18]. Aktivoivan prosessin EGFR kuuluu tyrosiinifosforylaatiolle sen solunsisäisen domeenin ja eri fosforylaatio sivustoja verkkotunnuksen liittyvät eri signaalien kulkureiteillä. Kun EGFR on aktivoitu, se voi rekrytoida efektoriproteiinit sen fosforyloidun C-terminaalista sub-domain ja aloittaa efektoriproteiini välittämää reittejä [19], [20]. Niistä fosforylaatiopaikkaa, tyrosiini 1068 ja 1086 liittyvät MAPK /ERK-välitteinen reitin ja tyrosiini 992 ja 1173 liittyvät PLCγ-välitteisen signaalireitin [7], [8]. Aikaisemmat tulokset osoittivat, että PKG II voi estää EGF aiheuttamaa tyrosiinin 1068 fosforylaatiota EGFR mahasyövän solulinjassa BGC-823 [6], kysyen, onko PKG II voi estää fosforylaatiota muiden tyrosiinin sivustoja EGF /EGFR ja sen jälkeen on laaja-estoa EGF /EGFR-indusoidun signaalin transductions ja niihin liittyviä biologisia vaikutuksia mahalaukun syöpäsoluja.

tässä artikkelissa tutkimme toiminnan PKG II EGF aiheuttama muuttoliike aktiivisuutta mahasyövän solulinjan AGS. Tulos osoitti, että PKG II oli merkittävää estoa migraatiota aiheuttama EGF. Tämä antaa lisänäyttöä paljastaen kasvainta estävä vaikutus PKG II. Tutkimustiedot ovat osoittaneet, että yksi EGF /EGFR aloitetaan signaalitransduktioreaktioteitä, PLCγ1 ja MAPK /ERK välittämän signaalintransduktioreitteihin liittyvät maahanmuuttoon toimintaa [21], [22]. Tämän vahvistaa mahalaukun syöpäsoluissa, käytimme estäjä signaalitransduktion komponentin tunnistamiseksi osallistumisen MAPK /ERK ja PLCγ1 välittämä reittejä prosessissa. Tulokset osoittivat, että MEK estäjä U0126 ja PLCγ1 estäjä U73122 osittain tukossa EGF /EGFR-johtuva muuttoliike aktiivisuutta AGS soluja, mikä osoittaa, että molemmat signaalintransduktioreitteihin osallistui säätö- prosessissa. Valaisemiseksi mahdollisia estovaikutuksen PKG II seuraavilla signaalitransduktioreaktioteitä, ensin tutkitaan estävää vaikutusta PKG II EGF aloitettiin PLCγ1-välitteiseen signaalin siirtoon kautta. Tulokset osoittivat, että PKG II esti kaikki tärkeimmät tapahtumat tähän signaalinvälitysreitin, kuten Tyr 992 fosforylaatio /aktivointi EGFR, fosforylaatiota /aktivointi PLCγ1, muodostumista toisiolähetti- DAG, vapautuminen kalsiumin sytoplasmaan, ja PKC: n aktivaation ja CaMK IIα. Inhiboimiseksi PKG II EGF /EGFR indusoi MAPK /ERK-välitteinen signaalinvälitysreitin, aiemmat työt ovat osoittaneet, että PKG II estää aktivoinnin kaikkien keskeisten komponenttien reitin aiheuttama EGF mahasyövän solulinjassa BGC-823 [ ,,,0],6]. Tässä artikkelissa tutkimme estävää vaikutusta PKG II EGF /EGFR-indusoidun aktivoitumisen keskeisten komponenttien tämän reitin. Tulokset vahvistivat, että PKG II inhiboi EGF-indusoidun aktivaation Ras-proteiinin ja MAPK /ERK in AGS-soluissa, mikä viittaa siihen, että PKG II esti myös EGF /EGFR-indusoidun signaalin transduktion MAPK /ERK-välitteinen reitin tämän tasyöpäsolulinja. Nämä tulokset systemaattisesti paljastivat, että PKG II esti EGF aiheuttamaa kulkeutumista mahan syöpäsolujen kautta estämällä EGF /EGFR aloitti signaalitransduktioon PLCγ1 ja MAP /ERK-välitteinen reittejä.

signaalitransduktion Sekä PLCγ1 ja MAP /ERK -välitteisen polkuja voi aktivoida pieniä G-proteiinin Rac1, joka on keskeinen osa säätelyssä solujen vaeltamiseen [23], [24]. Vahvista eston PKG II tämän tärkeän tapahtuman EGF aiheuttamaa kulkeutumista GAS-solujen, haimme "pull-down" -menetelmällä tarkistaa aktiivisuuden Rac1 vuonna eri tavoin käsiteltyjen AGS soluja. Tulokset osoittivat, että aikana EGF muuttoliike, Rac1 aktivoitiin ja aktivointi liittyi sekä PLCγ1 ja MAP /ERK-välitteinen signalointi. Lisäksi PKG II esti EGF-indusoidun aktivoitumisen Rac 1. Tämä vahvistettiin lisäksi estävää vaikutusta muihin PKG II EGF /EGFR aloitti solujen vaeltamiseen.

EGFR liittyy läheisesti tumorigenensis. Yli ilmaisun ja mutaatio EGFR usein tapahtuu useimmat syövät. Tutkimus tiedot osoittivat, että yli 50% -70% keuhkosyöpä, paksusuolen syöpä ja rintasyöpä on korkea ilmentyminen EGFR [25]. Lisäksi syövän potilaille, joilla on yli-ilmentyminen EGFR yleensä huonoon ennusteeseen. Esimerkiksi EGFR yli-ilmentyminen havaittiin 60% ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) potilailla ja ennusteen potilaista olivat huonot, ja selviytyminen 4-5 kuukautta vain [26]. In vitro
kokeet vahvistivat, että yli-ilmentyminen EGFR aiheuttanut muutosta NIH-3T3, Rat-1 ja NRK-soluissa ja estää EGFR: n aktivoinnin inhiboi proliferaatiota noin kasvainsolujen [27]. Näin ollen, EGFR on ensimmäinen kasvutekijän reseptori otetaan syöpähoidon kohde. Useita menetelmiä EGFR ja siihen liittyvän signaalin siirtoon, mukaan lukien erityiset vasta-aineita EGFR ja inhibiittorit EGFR, sai intensiivisen tutkimuksen [28] - [30]. Uusia ja tehokkaampia menetelmiä estää EGFR-välitteiseen signaalin siirtoon on hyötyä syövän hoidossa. Siksi havainto, että PKG II voi estää aktivointi EGFR ja siitä johtuva signaalitransduktio on tärkeä merkitys. Se viittaa vahvasti siihen, että PKG II on potentiaalinen endogeeninen EGFR estäjä ja antaa uusia vihjeen siitä strategiasta syövän hoidossa.

Tutkimus osoittivat, että jotkut proteiinikinaaseiksi voi aiheuttaa fosforylaatio EGFR ja vaikuttaa sen aktivointia ja /tai määränpään. Esimerkiksi, proteiinikinaasi C (PKC) voi aiheuttaa fosforylaatiota treoniini 654 EGFR ja säätelee reseptorin sitoutumisen ja sisäistämisen [31]. Seriini 1046/1047 (Ser1046 /1047) fosforylaatiokohdan tarvitaan EGFR siedätyshoito in EGF-käsitellyissä soluissa [32] .Vuonna meidän kokeita, havaitsimme fosforylaatiota Thr654 ja Ser1046 /1047 EGFR ja totesi, että PKG II ei aiheuttanut fosforylaatio näistä fosforylaatiokohdat. Kuitenkin meidän tulokset osoittivat, että oli olemassa suora vuorovaikutus PKG II ja EGFR ja PKG II aiheutti treoniinifosforylaatio EGFR. Tämä osoitti, että PKG II estänyt aktivointi EGFR sitoutumalla kanssa ja fosforylaatioreagenssin reseptorin. Tarkka fosforylaatio sivusto on seuraava tutkimus tavoite.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Line ja reagenssit

Ihmisen mahalaukun syövän solulinja AGS saatiin Institute of Cell Biology (Shanghai, Kiina). Adenovirusvektoreita koodaavat β-galaktosidaasi (kerros-LacZ) ja PKG II (kerros-PKG II) oli ystävällinen lahja tri Gerry Boss ja Dr. Renate Pilz University of California, San Diego, USA Dulbeccon modifioitu Eaglen Media (DMEM) ja naudan sikiön seerumia (FBS) saatiin GIBCO (Grand Island, NY). Vasta-aine PKG II oli peräisin ABGENT Biotechnology (San Diego, CA). Vuohen anti-β-aktiini, hiiren anti-pan-Ras, ja hiiren anti-PLCγ1 vasta-aineet olivat Santa Cruz (Santa Cruz, CA). Kanin anti-p-EGFR (Tyr1068), kanin anti-p-EGFR (Tyr992), kanin anti-EGFR, hiiren anti-p-ERK (Thr 202 /Tyr 204), kanin anti-ERK ja kanin anti-p-PLCγ1 (Tyr783) vasta-aineet olivat peräisin Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Kanin anti-PKC-a ja kanin anti-p-CaMK IIα (Thr286) olivat Bioworld Technology (St. Louis Park, MN). Kanin anti-p-Thr-vasta-aine oli peräisin Abcam (MA, USA) .Horseradish peroksidaasi (HRP) konjugoitua sekundääriset vasta-aineet olivat Jackson Immuno Research Laboratories (West Grove, PA). Solu läpäisevä cGMP analogi 8-pCPT-cGMP oli Calbiochem (San Diego, CA). EGF, U73122 ja U0126 olivat Sigma (St. Louis, MO). Elektrokemiluminesenssin (ECL) reagenssit olivat Milliporesta (Billerica, MA). Ca ^{2+ ilmaisin Fluo-3 /AM ja Membrane ja sytosolin Protein Extraction Kit olivat Beyotime (Jiangsu, Kiina). Ihmisen diasyyliglyserolin (DAG /PO) ELISA Kit oli kotoisin Cusabio Biotech Co., Ltd. (Newark, DE). Kaikki muut käytetyt reagenssit olivat analyyttistä laatua.}

valmistaminen adenovirusvektoreiden

293A-solut transfektoitiin adenovirusvektori, joka koodaa LacZ ja PKG II vastaavasti ja viljeltiin enintään kymmenen päivää, kunnes CPE havaittiin. Solut ja viljelyväliaine otettiin talteen ja tehtiin kolme jäädytys-sulatus syklien. Supernatantti, joka sisälsi adenovirukset (Ad-LacZ ja Ad-PKG II) käytettiin infektoimaan uusia 293A solujen täydentää adenoviruksia. Monistettu adenoviruksen valmisteet titrattiin ja pfu /ml määritettiin, ja säilytetään -80 ° C: ssa käyttöön asti.

Soluviljelmä ja infektio adenovirusvektoreiden

AGS-soluja viljeltiin DMEM: ssä mukana 10% FBS ja pidettiin 37 ° C: ssa kosteutetussa inkubaattorissa 95% ilmaa ja 5% CO _{2. Elatusaine vaihdettiin joka toinen päivä, ja solut olivat osa-viljeltiin konfluenssiin. Päivänä ennen infektiota solut tuoreeltaan istutetaan 70-80% yhtymäkohdassa, ja infektio Ad-LacZ ja Ad-PKG II suoritettiin.}

Western-blottaus

Proteiini näytteet altistettiin SDS-PAGE (8-12%), geeliä mukaan molekyylikoon kohdeproteiinin, ja elektroforeesi ja kalvon siirto suoritettiin noudattamalla valmistajan protokollan (Bio-Rad, Hercules, CA). Primaaristen vasta-aineiden inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa TBS-T: n (2% Tween-20), ja vastaavat sekundääriset vasta-aineet, inkuboitiin 1 tunnin ajan RT: TBS-T: n (2% Tween-20), jossa on kolme pesua jokaisen inkuboinnin jälkeen. ECL reagensseja käytettiin osoittamaan positiivista bändejä kalvolle. Suorittamaan densitometrian analyysi, digitaalisia kuvia positiivisen bändit saatiin Chemidoc XRS ja analysoitiin kuva-analyysin ohjelma Määrä One (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Tulokset osoittivat suhdetta kohdeproteiinin /latauskontrollina.

"Pull-down" analyysi Active Small G-proteiinin Ras ja Rac1

aktiivisuus Ras havaittiin Alasvetoköysi menetelmä, kuten on kuvattu aiemmin [9]. Lyhyesti, solut kasvavat 100 mm: n viljelymaljoille levy pestiin kolme kertaa kylmällä PBS: llä ja lyysattiin lisäämällä 400 ui lyysipuskuria (25 mM HEPES, pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% NP40: tä, 10% glyserolia, 25 mM NaF , 10 mM MgCl _{2, 0,25% natriumdeoksikolaatti, 1 mM EDTA, 1 mM Na 3Vo 4, 10 ug /ml aprotiniinia, ja 10 ug /ml leupeptiiniä). Näyte kerättiin ja sentrifugoitiin (14000 g, 4 ° C, 10 min) päästä eroon roskat. Supernatantti inkuboitiin glutationi-Sepharose-helmiä ja glutationi S
-transferase-Ras-RBD (GST-RBD) 4 ° C: ssa 1 h. Helmet pestiin 3 kertaa hajotuspuskurilla ja kuumennettiin keitettyä vettä vapauttavat proteiineja. Proteiininäytteet (jotka sisältävät aktiivisia Ras) analysoitiin Western blotting -tekniikalla, jossa vasta-ainetta pan-Ras. Aktiivinen Rac1 havaittiin samanlaisia ​​menetelmällä mutta GST-PAK1 proteiinia sitovan domeenin (GST-PBD) ja vasta-aine Rac1.}

Immunosaostaminen

Solut kasvavat 100 mm kulttuuri levy pestiin kaksi kertaa kylmällä PBS: llä ja hajotettiin lisäämällä 1 ml RIPA-puskuria (50 mM Tris-HCI, pH 7,4, 1% Triton X-100, 1 mM EDTA, 1 mM leupeptiini, 1 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia, 10 mM NaF, 1 mM Na _{3Vo 4) maljaa kohti. Vasta-aineet PLCγ1 ja p-PLCγ1 käytettiin immunosaostukseen. Sakat koetettiin vasta-aineiden kohde proteiineja.}

Analyysi Kalsium sytoplasmaan

Voit seurata EGF ja PKG II EGF aiheuttamaa kalsiumin vapautumista, AGS solut ladattiin 5 uM membraanin läpäisevän kalsiumin indikaattorina fluo-3-asetoksimetyyli (AM) esterin 30 min 37 ° C: ssa DMEM: ssä. Sen jälkeen, kun lastaus, solut pestiin PBS: llä ja suspendoitiin DMEM. Fluoresenssimittaukset suoritettiin käyttämällä Olympus Fluoview-500 konfokaali järjestelmä. Fluo-3 viritettiin argon laser valoa 488 nm ja fluoresenssi mitattiin aallonpituuksilla 515 nm.

ELISA-määritys DAG

DAG pitoisuudet mitattiin ELISA: lla, mukaan valmistajan ohjeiden . Tämä määritys käyttää määrällinen sandwich entsyymi immunomääritys tekniikkaa. Spesifistä vasta DAG on valmiiksi päällystetty mikro-levy. Standardit ja näytteet pipetoidaan kaivoihin ja kaikki DAG esillä sitoo immobilisoidun vasta-aineen. Poistamisen jälkeen kaiken sitoutumattoman aineet, biotiini-konjugoitu vasta-aine, joka on spesifinen DAG lisätään kuoppiin. Pesun jälkeen avidiini konjugoitu piparjuuriperoksidaasiin (HRP) lisätään kuoppiin. Sen jälkeen kun pesu poistaa sitoutumattoman avidiini-entsyymin reagenssi, substraattiliuosta lisätään kuoppiin ja värin kehittyy suhteessa määrään DAG sidottu ensimmäisen vaiheen. Värin kehittyminen pysäytetään ja värin intensiteetti mitataan.

Solunosafraktiointi

Solunosafraktiointi sytosoliin ja membraanifraktioiden suoritettiin käyttämällä kalvon ja sytosolin Protein Extraction Kit, mukaan valmistajan ohje. Yksikerrosviljelmiä pestiin kolme kertaa jääkylmällä PBS-liuosta ja kaavittiin kylmään homogenisointipuskurissa (HB), joka sisälsi 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 4 mM EDTA, 2 mM EGTA, 10% glyseroli, 10 g /ml leupeptiiniä, ja 1 mM PMSF. Solut lyysattiin sonikoimalla kanssa 4-15 s välein, ja täydellinen lyysi seurattiin mikroskooppisesti. Homogenaattia ultrasentrifugoitiin 86000 g 45 minuutin ajan 4 ° C: ssa, ja supernatantti nimettiin sytosolifraktion. Pelletti suspendoitiin uudelleen HB, joka sisälsi 1% Triton X-100 ja inkuboitiin jäillä 30 min. Sitten näytteitä sentrifugoitiin 14000 g: ssä 20 minuutin ajan 4 ° C: ssa, ja supernatantti nimettiin membraanifraktion. Kaikki näytteet keitettiin ja kirkastettiin sentrifugoimalla.

Cell migraatiokokeessa

Migration aktiivisuutta AGS solujen havaittiin transwell järjestelmän (BD BioCoatTM Ohjaus 8,0 mm PET Kalvo 24-kuoppaisen Soluviljely insertit, BD Biosciences). Sen jälkeen Trypsinisaation, 5 * 10 ^{4cells ympättiin ylempään kammioon, joka sisältää viljelyalustan ilman FBS: ää. Solun siirtymistä alapuolen kalvo saatiin aikaan, joka sisälsi 10% FBS: ää alemmassa kammiossa 12 tuntia 37 ° C: ssa kudosviljelyinkubaattorissa. Siirtynyt solujen alapuolen kalvon kiinnitettiin 40%: paraformaldehydillä liuoksessa 30 minuutin ajan, värjättiin Giemsa liuokseen 10 min ajan, ja sen jälkeen huuhdeltiin vedellä. Värjätyt solut tutkitaan mikroskooppisesti valomikroskoopilla. Siirtyneet solut laskettiin 5 satunnaisesti valitun kentät per insert, ja arvoista otettiin keskiarvo. Kaikki kokeet suoritettiin kolme rinnakkaista kunkin muuttoliike kunnossa.}

Tilastollinen analyysi

Tiedot ilmaistiin keskiarvoina ± keskihajonta (SD). Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen kaksisuuntaista ANOVA SPSS-tilasto-ohjelmalla. P
-arvo alle 0,05 pidettiin merkittävänä.

Kiitokset

Kiitämme tohtori Gerry Boss ja Dr. Renate Pilz, University of California, San Diego, USA sellaista lahjoja Adenoviraaliset konstruktioita.

• PLoS ONE: sosiodemografisiin ja maantieteelliset tekijät ruokatorven ja mahalaukun syövän kuolleisuus Sweden
• PLoS ONE: n yli-ilmentyminen CD151 ennustaa Prognoosi potilailla, joilla resektoitiin Mahalaukun Cancer