Plos ONE: PKG II zavira EGF /-EGFR povzročena Migracije želodca raka celic

Povzetek

Ozadje

Naši rezultati prejšnjih raziskav so pokazali, da Type II cGMP odvisna protein kinaza (PKG II) lahko blokirajo aktivacijo epidermalni rastni faktor receptor (EGFR) in s tem zavira proliferacijo in s tem povezane MAPK /-ERK posredovano signalov za raka celične linije želodca BGC-823, kar kaže, da PKG II lahko zavira drugih EGFR sproži prenos signalov poti in s tem povezanih biološke aktivnosti želodca rakavih celic. Ta dokument je bil zasnovan tako, da razišče morebitno inhibicijo PKG II o ESPG dejavnosti migracije /-EGFR povzroča in povezanih signalov poti.

Metodologija /glavnih ugotovitev

Pri raku celične linije želodca AGS, izražanja in aktivnost PKG II se je zvišala za inficiranje celic z Adenovirusni konstrukt kodira PKG II cDNA (Ad-PKG II) in obdelavo celic z cGMP analogno 8-pCPT-cGMP. Fosforilacija proteinov je bila odkrita z Western blot in aktivnih malih g beljakovin Ras in Rac1 smo merili z metodo "pull-down". Cell migracije dejavnost je bila odkrita s trans-dobro opremo. Vezavo med PKG II in EGFR je bila odkrita s Co-IP. Rezultati so pokazali ESPG spodbujati migracije AGS celice in učinek je bil povezan z PLCγ1 in-ERK posreduje prenos signalov poti. PKG II zaviral aktivnost migracije-ESPG inducirane in blokiran ESPG, ki se je začel prenos signala od PLCγ1 in MAPK /-ERK posredovano poti s preprečevanjem-ESPG povzroča Tyr 992 in Tyr 1068 fosforilacijo EGFR. PKG II vezan z EGFR in povzročila treonin fosforilacijo njim.

Zaključek /Pomen

Naši rezultati sistemsko potrjuje inhibicijo PKG II o migracijah-ESPG povzroča in s tem povezano signalov za PLCγ1 in MAPK /ERK posredovane poti, kar pomeni, da ima PKG II inhibicijo fargoing o ESPG v zvezi /EGFR signalov in biološke aktivnosti želodčnih rakavih celic preko fosforilacije EGFR preprečil aktiviranje to

Navedba. Jiang L, Lan T Chen Y, Sang J Li Y, Wu M, et al. (2013) PKG II zavira EGF /EGFR-inducirane migracije iz želodca rakavih celic. PLoS ONE 8 (4): e61674. doi: 10,1371 /journal.pone.0061674

Urednik: Vladislav V. Glinskii, University of Missouri-Columbia, Združene države Amerike

Prejeto: 30. september 2012; Sprejeto: 12. marec, 2013; Objavljeno: 16 april 2013

Copyright: © 2013 Jiang et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. Ta študija je podprl Nacionalni Natural Science Foundation Kitajske, No.81272755, No.31040002, No.81001100 in No.31100974; Inovacija Grant Univerze Jiangsu. Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

Tip II cGMP odvisnih proteinskih kinaz (PKG II) serin /treonin kinaze in kopičijo podatki iz raziskav so pokazali, da je ta kinaze pomembno vlogo pri uravnavanju celičnih biološke aktivnosti, kot so orožja in apoptozo, zlasti v tumorskih celicah . Leta 2004, Cook et al
ugotovila, da bi PKG II inducira apoptozo človeških kulturah prostate stromalnih celic [1]. V letu 2009 je Swartling et al
poročala, da PKG II inhibirana proliferacijo nevroglioma celicami in zaviranje je bilo povezano z zmanjšanjem ekspresije prepisovanje faktorja Sox9 in fosforilacijo Akt [2]. V letu 2011, Fallahian et al
ugotovila, da bi cGMP povzroči apoptozo celic raka dojke in ta učinek je bil povezan z PKG II [3]. V naši raziskavi smo ugotovili, da so izraz in dejavnost PKG II v človeške želodčne raka celičnih linijah bistveno nižja od običajnih želodčne sluznice celic [4]. Nadaljnje študije v našem laboratoriju je pokazala, da PKG II lahko zavira širjenje želodca raka celičnih linij in blok ESPG povzroča signalov od MAPK /ERK posredovano poti s preprečevanjem aktivacijo EGFR ga ESPG [5], [6]. Ker lahko aktivacija EGFR sprožiti več signalov poti, vključno MAPK /ERK, PI3K /Akt, JAK /STAT in PLCγ1 posredovanih poti [7], [8], zaporni učinek PKG II o aktiviranju EGFR predlaga, da se ta encim imajo lahko široko paleto zavira signalov in s tem povezane biološke aktivnosti želodca rakavih celic. Ta dokument je bil zasnovan za potrditev te široko paleto zaviralni učinek PKG II s preiskavo inhibicijo PKG II na aktivnost-ESPG inducirane migracije in z njimi povezanih prenos signala v želodcu rakavih celic.

Rezultati

PKG II zavira ESPG inducirane Cell migracije, ki je povezana z signalov za PLCγ1 in MAPK /ERK posredovano poteh

Cell migracije je pomembno za normalno fiziologijo in bolezni. Pridobitev migracijskega sposobnosti, ki ga rakave celice je značilno, da prispeva k širjenju metastaznih tumorskih celic v oddaljene organe. Nedavni podatki so pokazali, da lahko ESPG spodbuditi migracijo rakavih celic. Mehanizem, prek katerega ESPG spodbuja migracijo celic ni jasen, vendar pa nekateri podatki kažejo, da lahko ESPG to narediti z začetkom prenos signala od PLCγ1 in MAPK /-ERK posredovano poti. V tem poskusu smo zaznali vpliv-migracijske spodbujanje EGF v AGS celicah in se uporablja inhibitor ključnih komponent v signalnih poti, da razišče morebitno transdukcijo signala, povezane z učinkom. Rezultati so pokazali, da je zdravljenje ESPG povečana aktivnost migracije AGS celic in tako MEK (ključni element MAPK /ERK posredovano poti) inhibitor U0126 in PLCγ1 zaviralca U73122 inhibirana-ESPG inducirane migracije, kar kaže, da ESPG spodbudila aktivnost migracije celic skozi aktiviranje tako MAPK /ERK in PLCγ1 posredovana transdukcije signala poti (sl. 1).

PKG II Blocks ESPG inducirane Tyr 992 in Tyr 1068 fosforilacijo EGFR

Ko ESPG veže z EGFR, povzroča avto- fosforilacija receptorja. Obstaja več avto-Fosforilacijske strani, ki so povezani z različnimi signalov poti. Tirozin 992 in tirozin 1068 so med auto-fosforilacijskih mestih z EGFR in so povezane s PLCγ1 posredovana in MAPK /ERK posredovano signalizacijo oz. V tem poskusu smo raziskovali inhibitornega učinka PKG II na tirozin 992 in tirozin 1068 fosforilacijo EGFR v različno obdelanih AGS celic z Western blotting-om. Rezultati so pokazali, da je zdravljenje ESPG povzročil 14 gub povečanje tirozin 992 in z 8 gub povečanje Tirozin 1068 fosforilacijo EGFR. V celicah, okuženih z Ad-PKG II in stimuliranih z cGMP, je fosforilacije občutno zmanjšala (sl. 2, 3). To kaže, da bi lahko PKG II preprečiti-ESPG povzroča Tyrosine 992 in Tirozin 1068 fosforilacijo EGFR in s tem zavirajo PLCγ1 posredovana in MAPK /-ERK posredovano signalizacijo.

PKG II Preprečuje EGF-sproži Glavni dogodki PLCγ1 posredovane signalov Pathway

(1) PLCγ1 aktiviranje.

PLCγ je komponenta dolvodno od receptorjev tirozin kinaz (RTK). Ima dve izo: PLCγ1 se razširi povsod in PLCγ2 se izraža predvsem v hematopoetske celice. Aktivacija PLCγ1 zahteva njegovo imenovanje na mesto membrane in združevanja, prek svojega SH2 domeni, z aktivnim RTK kot EGFR. To združenje bo imelo za posledico fosforilacijo PLCγ1 o ostankih tirozin, zlasti na tirozin 783, in povečanje njenega encimske aktivnosti. Uporabili smo IP metodo za izolacijo PLCγ1 in nato uporabi Western metodo blot za odkrivanje fosforilacijo PLCγ1. Rezultati so pokazali, da je zdravljenje ESPG povzročil očitno povečanje Tyr783 fosforilacije PLCγ1 in povečanje dejavnosti PKG II z okužbo celic z Ad-PKG II in spodbujanju celice z cGMP učinkovito preprečil-ESPG inducirano fosforilacijo PLCγ1 (sl. 4 ).

(2) DAG oblikovanje.

Ko se aktivira, lahko PLCγ1 katalizira hidrolizo fosfatidilinozitol 4,5-bisphos-fosfat (PI-4,5P _{2) v inozitol 1,4,5-trisphosphate (IP 3) in diacilglicerol (DAG), dve molekul, ki urejajo sprostitev znotrajcelično Ca ^{2+ in aktivnost protein kinaze C v tem zaporedju. Upoštevati učinke ESPG in PKG II o oblikovanju DAG je ELISA metoda za odkrivanje koncentracijo dag v AGS celicah. Rezultati so pokazali, da ESPG stimulirane AGS celic, stopnja DAG seveda poveča in pred okužbo z Ad-PKG II in zdravljenju z 8P-CPT-cGMP inhibira nastajanje DAG s stimulacijo povzročene z EGF (sl. 5).}}

(3) Ca ^{2+ sprošča.}

IP3 in DAG so drugi sli v PLCγ1 posredovano signalov poti. IP3 je znano, da stimulira sproščanje kalcija iz notranjih trgovinah. Uporabili smo kalcija indikator fluo-3 /AM za zaznavanje kalcija v citoplazmi. Rezultati so pokazali, da je zdravljenje ESPG poveča sproščanje Ca ^{2+ iz endoplazemski retikulum (ER) v citoplazmo in visoko ekspresijo in aktivnost PKG II znatno inhibira sproščanje, vzvratno učinek zdravljenja ESPG (sl. 6).}

(4) Aktiviranje PKCα.

PKCα, izoforma za protein kinaze C, je ključni element PLCγ1 posredovano signala poti in se lahko aktivira s Ca ^{2+ in DAG . Aktivirana, PKCα premikanjem od citosol na membrane celic. Tako da je količina PKCα na membrani predstavlja aktivacijo PKCα. V tem poskusu smo raziskovali inhibitornega učinka PKG II o aktiviranju PKCα v različno obdelanih AGS celic z Western blotting-om. Rezultati so pokazali, da je v petih minutah po dodajanju ESPG v gojišču, v prenosom PKCα od citosolu na membrano dramatično povečalo in translokacije je zaviral s predhodno okužbo celice z Ad-PKG II in zdravljenje z 8-pCPT-cGMP ( sl. 7).}

(5) Aktiviranje CaMKIIα.

Študije o urejanju Ca ^{2 + /kalmodulin (CAM) -dependent kinaze II alfa (CaMKIIα), ki je primarna izooblika CaMKII, so predlagali, da kadar Ca 2 + /CaM veže z CaMKIIα, znotraj molekulske avtofosforilacijski pojavi in ​​fosforilacija ohranja vztrajno aktivacijo encima. Protitelo proti fosfo-CaMKIIα (Thr286) je bila uporabljena v zahodni blot za odkrivanje fosforilacijo CaMKIIα. Rezultati so pokazali, da je v AGS celici, zdravljenih z ESPG, Thr286 fosforilacija CaMKIIα povečala za skoraj 2,5 gub in okužbe z Ad-PKG II in zdravljenje z 8-pCPT-cGMP zaviral povečanje fosforilacijo s ESPG (sl. 8) inducirane.}

PKG II zavira ESPG inducirano Vključitev ključnih sestavin MAPK /ERK pogojenega signalov poti,

(1) Aktiviranje MAPK /ERK.

MAPK /ERK je ključni element MAPK /ERK posredovano poti. Fosforilacija na obeh treonin 202 in tirozin 204 ostankov ERK1 in treonin 185 in tirozin 187 ostankov ERK2 je za polno encimsko aktivacijo potrebno. Protitelo proti p-ERK1 /2 (CX 202 /Tyr 204) je bila uporabljena v zahodni blot za odkrivanje dvojno fosforilacijo ERK. Rezultati so pokazali, da je v petih minutah po dodatku ESPG mediju celične kulture, fosforilacije ERK1 /2 v AGS celice drastično (10 gube) povečala in fosforilacijo je inhibira pred okužbo celice z Ad-PKG II in aktivira encim pri 8-pCPT-cGMP (sl. 9).

(2) Aktiviranje ras.

Majhen G protein Ras je še en ključni element v MAPK /-ERK posredovanega signala poti. Ima dve obliki v celicah:-GTP vezan aktivno obliko in-BDP vezan neaktivno obliko. Ko Ras je v-GTP vezani obliki, lahko veže in aktivira Raf-1 in začeti posledičnih aktivacij serinskih /treonin kinaze v poti signala. Uporabili smo "pull-down" metode za odkrivanje aktivirano RAS. Rezultat je pokazala, da po dodajanju ESPG gojišča, aktivno Ras v AGS celicah seveda poveča v petih minutah. Okužbo celic z Ad-PKG II in jih spodbuja z 8-pCPT-cGMP pred dodajanjem ESPG bistveno preprečil-ESPG povzroča aktivacijo Ras (sl. 10).

PKG II zavira ESPG inducirano Aktivacija RAC1

Majhen G protein RAC1 je glavni član Rho družine, ki igrajo pomembno vlogo pri uravnavanju migracijo rakastih celic. Oba PLCγ1 in MAPK /ERK posredovana signalov lahko aktivirate RAC1 in nato spodbuditi migracijo celic. Da bi še dodatno potrditev zaviralni učinek PKG II o ESPG signalizacijo /-EGFR povzroča kar je povezano z migracijami, je bila uporabljena "Pull-down" metoda za odkrivanje inhibicijo PKG II o aktiviranju RAC1. Rezultat je pokazal, da zdravljenje ESPG povzročila očiten porast aktivnega RAC1 in visoke aktivnosti PKG II učinkovito inhibira aktivacijo RAC1 (sl. 11). To je zagotovilo dodaten dokaz zaviranja PKG II o-ESPG povzroča migracijo želodca rakavih celic.

PKGII komunicira z EGFR in Povzroča CX-phoshporylation receptorja

mehanizem, s katerim PKGII blokov the-ESPG povzroča aktiviranje EGFR je bilo predhodno raziskali v tem poskusu. Co-imuno je bila uporabljena za odkrivanje interakcijo med PKGII in EGFR. Western blot s pan anti fosforilacijo treonina protitelesa uporabimo za odkrivanje treonin fosforilacijo EGFR s PKGII povzročili. Rezultati Co-imuno je pokazala, da v AGS celic, okuženih z Ad-PKG II in stimuliranih z 8-CPT-cGMP, direktno vezavo med PKG II in EGFR je bila odkrita (sl. 12, plošče A). Rezultati Western blotting so pokazali, da aktivacija PKG II povzročil treonin fosforilacijo EGFR (sl. 12, panel B). To kaže, da PKG II blokiran za aktivacijo EGFR z vezavo z receptorjem in povzroči fosforilacijo njim.

Pogovor

Trenutno je za dva cGMP odvisne proteinske kinaze (PKGS), PKG I in PKG II , so bile ugotovljene v sesalskih celic [10], [11]. PKG sem se široko porazdeli po celem telesu in zaradi svoje zaviralnega učinka na rast tumorja in invazivnosti in indukcijo učinek na apoptozo tumorskih celic, je bilo ugotovljeno, da je zaviralnih [12]. Izraz PKG II je bolj tkiv omejena [13]. Za dolgo časa, v nasprotju z dobro izkazala-antitumorskim učinkom PKG I nobenih podatkov raziskav jasno navedeno antitumorsko vlogo PKG II in to kinaze je bil vpleten le v več fizioloških funkcijah, vključno črevesno izločanje, rast kosti in učenja in pomnilnika [14]. Vendar pa raziskave interes o PKG II se povečuje in nekatere nove funkcije PKG II so nedavno odkrili, vključno z vlogo PKG II v ureditvi epitela natrijevega kanala in mehanoterapijo signalov [15] - [17]. Še pomembneje, akumuliranje raziskava podatki kažejo, da je PKG II povezan s proliferacijo in apoptozo v nekaterih celicah, zlasti v tumorskih celicah, močno kaže na potencialno vlogo tega encima pri regulaciji biološke aktivnosti tumorskih celic [1] - [6].

EGFR obstaja na površini vseh celic. Z molekulsko maso 170KD, EGFR ima zunajcelično domeno, navzkrižno membranski domeno ter znotrajcelično domeno. Znotrajcelično domeno EGFR ima 542 amino kislin ostanke in jih lahko razdelimo v približni membrane sub-domene tirozin kinaze sub-domeno in C-terminalno sub-domene [18]. Proces aktivacijska EGFR vključuje tirozin fosforilacijo njenega intracelularne domene in različne fosforilacijskih mest na področjih so povezane z različnimi potmi signalov. Ko je EGFR aktivira, lahko zaposli efektornih beljakovine svoje fosforiliranega C-terminal sub-domene in sproži efektornih-beljakovinske posredovano poti [19], [20]. Med fosforilacijskih mest, so tirozin 1068 in 1086, povezane z MAPK /ERK posredovano poti in tirozin 992 in 1173 so povezani z PLCγ posredovano signala poti [7], [8]. Naši prejšnji Rezultati so pokazali, da je PKG II lahko zavira-ESPG povzroča tirozin 1068 fosforilacijo EGFR v rakave celice skladu želodca BGC-823 [6], postavlja vprašanje, ali lahko PKG II zavre fosforilacijo drugih tirozin območij na ESPG /EGFR in nato še zaviranja široka o ESPG /-EGFR povzroča signalnih transductions in sorodnih biološke aktivnosti želodca rakavih celic.

V tem delu smo raziskovali delovanje PKG II na aktivnost migracije-ESPG povzroča raka celične linije želodca AGS. Rezultat je pokazal, da je imel PKG II pomembno zaviranje na celični migraciji s ESPG škodo. To zagotavlja dodatne dokaze razkrivajo tumor zaviralni učinek PKG II. Podatki raziskav so pokazali, da med /EGFR začel prenos signalov poti iz ESPG, so PLCγ1 in MAPK /ERK posredovana transdukcije signala poti, povezane z migracijo dejavnosti [21], [22]. Da bi to potrdili, v želodčnih rakavih celic, smo uporabili inhibitor signalov komponente opredeliti sodelovanje MAPK /ERK in PLCγ1 posredovanih poti v procesu. Rezultati so pokazali, da MEK inhibitor U0126 in PLCγ1 zaviralec U73122 delno blokirana ESPG /-EGFR povzroča migracijo aktivnost AGS celic, kar pomeni, da obe transdukcije signala poti sodelovala v procesu regulacijo. Za pojasnitev potencialno inhibitorno delovanje PKG II o teh prenos signalov poti, smo najprej raziskali zaviralni učinek PKG II o ESPG začela PLCγ1 posredovano signalov pot. Rezultati so pokazali, da je PKG II preprečiti vseh glavnih dogodkov v tem signalov poti, vključno s Tyr 992 fosfatnem /aktivacijo EGFR, fosforilacijo /aktiviranju PLCγ1 nastajanje drugi messenger DAG, sproščanje kalcija v citoplazma, in aktivacija PKC in CAMK IIα. Za zaviranje PKG II o ESPG /EGFR povzroča MAPK /-ERK posredovano signalov poti, so naše prejšnje delo pokazalo, da PKG II zavira aktivacijo vseh ključnih komponent v poti, ki jo ESPG, ki se inducira v rak celične linije želodca BGC-823 [ ,,,0],6]. V tem prispevku smo raziskovali zaviralni učinek PKG II o ESPG /-EGFR povzroča aktiviranje ključnih komponent v tej poti. Rezultati so potrdili, da PKG II inhibira EGF inducirano aktiviranje Ras proteina in MAPK /ERK v AGS celicah, kar kaže, da PKG II inhibira tudi ESPG /-EGFR inducirano signalno transdukcijo MAPK /ERK-posredovano poti v tem rak celične linije. Ti rezultati sistematično pokazala, da PKG II zaviral EGF-inducirano migracijo želodčnih rakavih celic z blokado ESPG /EGFR začela signalov za PLCγ1 in MAP /ERK posredovanih poti.

transdukcija signal tako PLCγ1 in MAP /ERK pogojenega poti lahko vključite majhno G protein Rac1, ki je ključni element pri urejanju celične migracije [23], [24]. Za potrditev inhibicijo PKG II o tem pomembnem dogodku v-ESPG povzroča migracije plinskih celic, smo uporabili "pull-down" metode za preverjanje aktivnosti Rac1 v različno obdelanih AGS celic. Rezultati so pokazali, da je med-ESPG inducirane migracije, je Rac1 aktivira in aktivacija je povezana tako PLCγ1 in MAP /ERK posredovano signalizacijo. Poleg tega PKG II zaviral-ESPG povzroča aktiviranje RAC 1. To je potrdil zaviralni učinek PKG II o ESPG /EGFR začela migracijo celic.

EGFR je tesno povezano s tumorigenensis. Preko izražanja in mutacije EGFR se pogosto zgodi pri večini rakavih obolenj. Podatki iz raziskav so pokazali, da ima več kot 50% -70% pljučnega raka, raka debelega črevesa in rak dojk visoko ekspresijo EGFR [25]. Poleg tega bolniki z rakom in s prekomerno ekspresijo EGFR imajo običajno slabo prognozo. Na primer, EGFR prekomerno ekspresijo smo odkrili pri 60% bolnikov, nedrobnoceličnega pljučnega raka (NSCLC) in prognoza pacientov bili revni, s preživetjem samo 4-5 mesecev [26]. vitro
poskusi so potrdili, da prekomerno ekspresijo EGFR povzročil preoblikovanje NIH-3T3, Rat-1 in NRK celic in blokiranje aktivacije EGFR zavrla širjenje nekaterih tumorskih celic [27]. Zato EGFR je prva receptorja rastnega faktorja upošteva kot tarčo zdravljenje raka. Več načinov inhibira EGFR dejavnosti in s tem povezanih signalov, vključno s specifičnimi protitelesi proti EGFR in zaviralci EGFR, prejetih intenzivne raziskave [28] - [30]. Nove in bolj učinkovite metode za blokiranje-EGFR posreduje prenos signala bo v pomoč pri zdravljenju raka. Zato je ugotovitev, da PKG II lahko zavira aktivacijo EGFR in posledično prenos signala ima pomemben pomen. To jasno kaže, da je PKG II potencialni endogeni zaviralec EGFR in bo zagotovil nov namig o strategiji zdravljenja raka.

Raziskovalni podatki kažejo, da lahko nekateri proteinske kinaze povzroči fosforilacijo EGFR in vplivajo na njeno aktiviranje in /ali namena. Na primer, protein kinaza C (PKC) povzroči fosforilacijo treonina 654 EGFR in regulira receptor vezavo in internalizacije [31]. Serin 1046/1047 (Ser1046 /1047) fosforilacija stran je potreben za EGFR desenzibilizacijo v ESPG zdravljenih celic [32] .V naših poskusih smo odkrili fosforilacijo Thr654 in Ser1046 /1047 EGFR in ugotovila, da PKG II ni povzročil fosforilacija teh fosforilacijskih mest. Vendar pa naši rezultati so pokazali, da obstaja neposredna interakcija med PKG II in EGFR in PKG II povzročil treonin fosforilacijo EGFR. To kaže, da PKG II blokiral aktivacijo EGFR z vezavo z in fosforiliranje receptor. Natančen fosforilacija stran bo naš naslednji raziskovalni cilj.

Materiali in metode

Cell Line in reagenti

Human želodčni rak celične linije AGS je bil zagotovljen z Inštituta za biologijo celice (Shanghai, Kitajska). Adenoviralni vektorji, ki kodirajo beta-galaktosidase (PAD-LacZ) in PKG II (PAD-PKG II), so bili prijazni darila iz dr Gerry Boss in dr Renate Pilz na University of California, San Diego, ZDA Dulbeccovem Modified Eagle je medije (DMEM) in fetalni goveji serum (FBS) je bilo iz Gibco (Grand Island, NY). Protitelo proti PKG II je bil od ABGENT biotehnologijo (San Diego, CA). Goat anti-β-aktin, miška anti-pan-Ras in miške anti-PLCγ1 protitelesa so iz Santa Cruz (Santa Cruz, CA). Rabbit anti-p-EGFR (Tyr1068), kunčjega anti-p-EGFR (Tyr992), kunčjega anti-EGFR, miška anti-p-ERK (CX 202 /Tyr 204), kunčjega anti-ERK in kunčjega anti-p-PLCγ1 (Tyr783) protitelesa so bili iz signalizacijo med celicami tehnologijo (Danvers, MA). Rabbit anti-PKCα in kunčjega anti-p-CaMK IIα (Thr286) je bilo iz Bioworld tehnologijo (St. Louis Park, MN). Rabbit anti-p-CX protiteles je bil iz Abcam (MA, ZDA) .Horseradish peroksidazo (HRP), označenih s sekundarna protitelesa so bila iz Jackson Immuno Research Laboratories (West Grove, PA). Celični prepustna cGMP analog 8-pCPT-cGMP je od Calbiochem (San Diego, CA). ESPG, U73122 in U0126 bili iz Sigma (St. Louis, MO). Electrochemiluminescence (ECL) reagenti so bili od Millipore (Billerici, MA). Ca ^{2+ kazalnik Fluo-3 /AM in Membrane in citosolu Protein Pridobivanje Kit je bilo iz Beyotime (Jiangsu, Kitajska). Human diacil glicerol (DAG /DG) ELISA Kit je bil iz Cusabio Biotech Co., Ltd. (Newark, DE). Vsi ostali reagenti so bili analitsko čisti.}

Priprava Adenoviralni Vektorji

293A Celice so transfekciji s adenovirusno vektor kodiranje LacZ in PKG II oziroma in kultivirani za do deset dni, dokler je bil videti CPE. Celice in gojišče smo zbrali in doživel tri zamrzovanje, odmrzovanje ciklov. Supernatanta, ki vsebuje adenovirusi (Ad-lacZ in Ad-PKG II), so bili uporabljeni za okuži nove 293A celice razširjajo adenovirusi. Pomnoženih adenovirusne Priprave so postopoma povečevali in pfu /ml je bila določena, in se hranijo na -80 ° C do uporabe.

Cell Culture in okužbo z Adenoviralni vektorji

AGS celice so kultivirali v DMEM na voljo z 10% FBS in vzdrževali pri 37 ° C v vlažnem inkubatorju s 95% zraka in 5% CO _{2. Gojišče smo spremenili vsaka dva dni in celice so bile sub-kultiviramo na sotočju. Na dan pred okužbo, so bile celice sveže posajene na 70-80% sotočju, in je bila opravljena okužba z Ad-LacZ in Ad-PKG II.}

Western blot

Vzorce proteina smo izpostavljeni s SDS-PAGE (8-12%) gel po molekularno velikost ciljnega proteina in elektroforeze in membransko prenosa smo izvedli po protokolu proizvajalca (Bio-Rad, Hercules, CA). Primarna protitelesa smo inkubirali čez noč pri 4 ° C v TBS-T (2% Tween-20), in ustrezna sekundarna protitelesa inkubiramo 1 h pri sobni temperaturi v TBS-T (2% Tween-20), s tremi pranj po vsakem inkubaciji. ECL reagente smo uporabili za prikaz pozitivne pasov na membrano. Za izvedbo analize denzitometrija so digitalne podobe pozitivnih pasov dobimo z Chemidoc XRS in analizirali s pomočjo programa za analizo slike Količina One (Bio-Rad, Hercules, CA, ZDA). Rezultati so pokazali, kot razmerje med tarčnega proteina /nadzor obremenitve.

"Pull-down" Analiza Active Small G beljakovin Ras in Rac1

Dejavnost Ras je bila odkrita v spustnem Postopek kot je opisano predhodno [9]. Na kratko smo celice rastejo na 100 mm kulture ploščo izperemo trikrat s hladnim PBS in lizirali z dodatkom 400 xl na liznega pufra (25 mM HEPES pH 7,5, 150 mM NaCl, 1% NP40, 10% glicerola, 25 mM Naf , 10 mM MgCl _{2, 0,25% natrijev deoksiholat, 1 mM EDTA, 1 mM Na 3VO 4, 10 ug /ml aprotinina in 10 ug /ml leupeptina). Vzorec smo zbrali in centrifugirali (14000 g, 4 ° C, 10 min), da se znebite umazanije. Supernatant smo inkubirali z glutationa-Sepharose kroglice in glutation S
-transferase-Ras-RBD (GST-RBD) pri 4 ° C 1 uro. Kroglice speremo 3-krat z liznega pufra in segrevamo pri vrele vode za sprostitev proteinov. Vzorci beljakovin (ki vsebujejo aktivno RAS), smo analizirali z metodo Western blot z protiteles proti pan-Ras. Aktivna Rac1 je bila odkrita s podobno metodo, vendar z vezave na beljakovine domeno GST-Pak1 (GST-PBD) in protitelesa proti Rac1.}

imuno

speremo Celice rastejo na 100-mm ploščo z gojiščem dvakrat z mrzlo PBS in lizirali z dodatkom 1 ml RIPA pufra (50 mM Tris-HCl pH 7,4, 1% Triton X-100, 1 mM EDTA, 1 mM leupeptina, 1 mM fenilmetilsulfonil fluorid, 10 mM NaF, 1 mM Na _{3VO 4) na ploščo. Protitelesa proti PLCγ1 in p-PLCγ1 so bili uporabljeni za imuno. Usedline so skeniran s protitelesi proti ciljnim proteinov.}

Analiza kalcija v citoplazma

Za spremljanje učinek ESPG in PKG II o-ESPG povzroča kalcijevega javnost, AGS celice so bili naloženi s 5 uM membrane prepustnega indikator kalcija fluo-3-acetoksimetil (AM) estra 30 minut pri 37 ° C v DMEM. Po nakladanju, smo celice izperemo s PBS in suspendiramo v DMEM. Meritve fluorescence so bile izvedene z uporabo konfokalnega sistem Olympus Fluoview-500. Fluo-3 smo vzbujali z argonom lasersko svetlobo pri 488 nm in fluorescence smo izmerili pri valovnih dolžinah 515 nm.

ELISA testa za DAG

Koncentracije DAG smo izmerili z ELISA, v skladu z navodili proizvajalca . Ta test uporablja količinsko sendvič encimsko imunsko tehniko. Protitelo, specifično za DAG je bil predhodno prevlečen na mikro ploščo. Standardi in vzorci odpipetiramo vodnjakov in vse DAG prisotna je vezan na imobilizirano protitelesa. Po odstranitvi katerekoli nevezane snovi, je biotin konjugirano specifičnih protiteles za DAG doda vdolbinic. Po izpiranju avidin konjugirani s hrenovo peroksidazo (HRP) se doda vdolbinic. Po spiranje, da se odstranijo kakršne koli nevezan avidin-encimsko reagent, je rešitev substrat dodamo v jamice in barva ne razvije v razmerju s količino DAG veže na začetni stopnji. Razvoj barve se ustavi in ​​se meri jakost barve.

subceličnih Frakcioniranje

subceličnih frakcionirni v citosol in membranskih frakcij smo izvedli s pomočjo Membrane in citosolu Protein ekstrakcija Kit se je po podatkih proizvajalca navodilo. Enoslojne kulture izperemo trikrat z ledeno mrzlo raztopino PBS in postrgamo v hladno pufru za homogenizacijo (HB), ki vsebuje 20 mM Tris-HCl (pH 7,4), 4 mM EDTA, 2 mM EGTA, 10% glicerol, 10 g /ml leupeptina, in 1 mM PMSF. Celice smo lizirali s pomočjo ultrazvoka z 4-15 s intervalih in popolno lizo mikroskopsko spremljati. Homogenat smo ultracentrifugiranih pri 86,000 g 45 minut pri 4 ° C in supernatant je bil določen kot citosolne frakcije. Pelet smo resuspendirali v HB, ki vsebuje 1% Triton X-100 in inkubiramo na ledu 30 minut. Vzorce smo nato centrifugirali pri 14.000 g 20 minut pri 4 ° C in supernatant je bil določen kot frakcije membrane. Vsi vzorci so bili kuhani in žogo s centrifugiranjem.

Cell migracije Vsebnost

Migracija aktivnost AGS celic so odkrile transwell sistema (BD BioCoatTM Control 8,0 mm PET Membrane 24 in celične kulture vložki, BD Biosciences). Po trypsinization smo 5 * 10 ^{4cells zasejali v zgornjo komoro, ki vsebuje gojišče brez FBS. Celične migracije na spodnji strani membrane smo inducirali z medija, ki vsebuje 10% FBS v spodnji komori za 12 ur pri 37 ° C v inkubatorju s tkivnih kultur. Prehajali celic na spodnji strani membrane so bile določene v 40% raztopini paraformaldehid 30 minut, obarvane v raztopini Giemsa 10 minut in nato speremo z vodo. Obarvane celice so bile podvržene mikroskopskim pregledom pod svetlobnim mikroskopom. Preselili celice so bili prešteti v 5 naključno izbranih področjih na vložka, in so bili v povprečju vrednosti. Vse poskuse smo izvedli s tremi ponovitvami pod vsako migracije stanju.}

Statistična analiza

Podatki so bili izraženi kot sredstvo ± standardni odklon (SD). Statistična analiza je bila opravljena z uporabo dvo-tailed ANOVA s statističnim opreme SPSS. A P
-vrednost manjša od 0,05 je zdelo pomembno.

Priznanja

Zahvaljujemo se dr Gerry Boss in dr Renate Pilz, University of California, San Diego, ZDA za prijazne darila adenovirusnih konstruktov.

• Plos ONE: Socio-demografski in geografski dejavniki pri požiralnika in želodca umrljivosti zaradi raka na Švedskem
• Plos ONE: Čezmerno CD151 napoveduje prognozo pri bolnikih z odstranjenimi želodca Cancer