Абстрактный
Фон
<р> Лизосома-ассоциированный трансмембранный белок 4β -35 (LAPTM4B-35), член млекопитающих 4-tetratransmembrane остовного белков надсемейства, как сообщается, будет избыточно экспрессируется в некоторых форм рака. Однако выражение LAPTM4B-35 и его роль в прогрессировании рака желудка (GC) остается неизвестным. Целью данного исследования было изучение LAPTM4B-35 выражение в GC, его потенциальную значимость для клиникопатологическими параметров и роли LAPTM4B-35 во время желудочного канцерогенеза.
Эти выводы показывают, что LAPTM4B-35 избыточная экспрессия может быть связано с прогрессированием GC и плохим прогнозом, и, таким образом, может служить в качестве нового прогнозирования маркера прогноза у больных ГЦ
<р> Цитирование:. Ченг Х, Чжэн Z, Z-Бу, Ву Х , Чжан L, Xing X и др. (2015) LAPTM4B-35 лет, связанных с раком генов, связан с плохим прогнозом в TNM Стадии I-III больных раком желудка. PLoS ONE 10 (4): e0121559. DOI: 10.1371 /journal.pone.0121559
<р> Академический редактор: Кэнъити Mukaisho, Сига университета медицинских наук, JAPAN
<р> Поступило: 10 апреля 2014 года; Принято: 12 февраля 2015 года; Опубликовано: 7 апреля 2015
<р> Copyright: © 2015 Cheng и др. Это статья открытого доступа распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются
<р> Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в пределах своих подтверждающей информации, файлов бумаги и
<р> Финансирование: Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (№ 30471677 и 81141024) и Национальной ключевой технологией R &Amp; D программы (Пекинского муниципального науки и техники. Проект Z121100007512010). Доноры внесли свой вклад в исследование дизайна, производительности, реактивов, материалов, анализа данных и принятия решения о публикации
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов
Введение
<р> рак желудка является третьим наиболее распространенным видом рака в Китае и является основной причиной, связанной с раком смерти в Китае [1]. Большинство пациентов GC уже находятся в продвинутой стадии на момент постановки диагноза (стадии III и IV), что делает прогноз быть мрачными, несмотря на улучшение хирургического и адъювантной подход к лечению [2-5]. Независимо от химиотерапии и предполагаемой лечебной хирургии, около 60% пациентов с GC развиваются рецидивы и в итоге умирают от метастатического заболевания [6]. GC прогрессии является многофакторной и многоэтапный процесс, в котором наследуется и экологические факторы играют жизненно важную роль [7]. Предыдущие наблюдения указывают на то, что классические биомаркеры и системы стадирования, основанные на клинических и патологических результатов, могут иметь свои ограничения на клинических приложений и побудит разрабатывать новые молекулярные биомаркеры, которые могут предсказать результат лечения пациентов [8, 9].
<Р> Лизосома-ассоциированный белок трансмембранного 4 бета (LAPTM4B) первоначально был клонирован в гепатоцеллюлярной карциномой (ЖСК) Шао и др, который расположенный на хромосоме 8q22, область часто усиливается при раке молочной железы и ГЦК [10, 11]. Он кодирует два белка с различной молекулярной массой 24 кДа и 35 кДа белки (LAPTM4B-24 и -35) с четырьмя предполагаемыми трансмембранных областей [12]. Локализация LAPTM4B-35 был обнаружен не только в лизосомы, но и в плазматической мембране и внутренних органелл, таких как аппарат Гольджи и эндосом [13]. Сообщалось, что LAPTM4B-35 был широко экспрессируется в различных типах рака. Предыдущие отчеты показали, что избыточная экспрессия LAPTM4B-35 связан с неблагоприятным биологическим поведением и плохим прогнозом при многих видов рака, таких как рак молочной железы [14], ГЦК [15-17], желчного пузыря карциномы [18, 19], колоректальный рак [20] , эпителиального рака яичников [21] и рака эндометрия [22]. Кроме того, было сообщено, что аллельные вариации LAPTM4B была связана с генетической предрасположенности ГК [23]. Кроме того, избыточная экспрессия LAPTM4B-35 путем трансфекции LAPTM4B кДНК способствует пролиферации клеток, миграции, вторжение в ГЦК ксенотрансплантатов у голых мышей и вызывает резистентность ко многим лекарственным средствам [24]. Нокдаун LAPTM4B с помощью РНК-интерференции, наоборот, обратное все эти злокачественные особенности фенотипа в ГЦК [24, 25].
<Р> Однако LAPTM4B-35 выражение, его значимость с точки зрения характеристик клиникопатологическими и биологическая роль LAPTM4B-35 в GC остаются неясными. В настоящем исследовании мы стремились определить LAPMT4B-35 выражение в GC и его потенциальную связь с клинико-патологическими особенностями, и его прогностическое значение. Кроме того, в пробирке функциональные анализы были проведены, чтобы охарактеризовать биологические эффекты LAPTMEB-35 в желудочном туморогенности.
Этика
<р> Все пациенты подписали информированное согласие для получения образцов тканей, а протокол исследования был одобрен клинических исследований по этике комитета пекинской онкологической больницы университета побочный.
образцы тканей желудка человека
<р> в общей сложности 240 (167 мужчин и 73 женщин, в возрасте 22-87 лет, а средний возраст составлял 60 лет), фиксированные формалином и парафином тканей GC, в том числе 180 в паре злокачественными и соответствием смежных доброкачественное желудка ткани слизистой оболочки, были получены от пациентов, перенесших GC гастрэктомию в онкологическом госпитале Пекинского университета с января 2003 года по декабрь 2011. клиническая и гистологическая информация для каждого случая были также собраны в соответствии с утвержденными ведомственным руководящим принципам. В 1997 году критерии UICC-TNM были использованы для классификации рака желудка. Медиана длительность периода с момента установления диагноза составил 26,2 месяцев (диапазон, 2.4-119.0 месяцев). В общей сложности, 112 (46,7%) пациентов умерли в последующей период.
Выделение РНК, количественное в режиме реального времени обратной транскрипции ПЦР (QRT-PCR),
<р> Общую РНК экстрагировали с использованием реагента TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, США) и обратной транскрипции в кДНК с использованием М-MLV обратной транскриптазы (Promega, Madison, WI, USA) в соответствии с инструкции изготовителя. ПЦР в реальном времени проводили с использованием быстрого реального времени система PCR ABI 7500 (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния, США). β-актин был использован в качестве внутреннего контроля. Последовательности праймеров, используемые перечислены ниже: LAPMT4B-35: прямой праймер: 5'-GGAAGCAGGACAGCCAACTT-3 ', обратный праймер: 5'-TTATTCTCGATCTCACAACCAAAC-3'; β-актина: прямой праймер: 5'- CCTGTGGCATCCACGAAACT-3 'обратный праймер: 5'- GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3'
Пролиферация клеток для анализа
<р> пролиферации клеток измеряли с помощью Cell счетную Kit-8. (ССК-8) (Dojindo, Япония) в соответствии с протоколом изготовления. Объем 100 мкл клеточной суспензии (3000 клеток на лунку) инкубировали в 96-луночный планшет (Costar, Корнинг, штат Нью-Йорк), в течение 24, 48, 72, 96 часов. 10 мкл раствора ССК-8 добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение 3 часов при 37 ° C. Значения поглощения всех лунок затем определяли при длине волны 450 нм с эталонной длиной волны 630 нм в Считыватель микропланшетов (Bio-Rad, США). Эксперимент был проведен в трех экземплярах и повторяется дважды.
Transwell нашествие анализы Анализ экспрессии LAPTM4B-35 в клеточных линиях GC и ШС LAPTM4B-35 экспрессия белка LAPTM4B-35 часто наблюдалась в GC LAPTM4B-35 экспрессия и прогноз GC пациентов LAPTM4B-35 способствует пролиферации опухолевых клеток <бр.> для того чтобы исследовать влияние LAPMT4B-35 в зависимости от клеточной биологии, были созданы две клеточные линии. КУП-823 и SGC-7901-клетки, представляющие относительно более низкую или более высокую экспрессию LAPTM4B-35 были отдельно выбраны для избыточной экспрессии и бросовой анализа (рис 1А). В первом из них клеточной линии КУП-823-AF гиперэкспрессией LAPTM4B-35 стабильно была создана, и напускной использовали в качестве контроля для этой клеточной линии. Во-вторых, LAPTM4B-35 был стабильно нокдауне towarding к SGC-7901 (hCas9 /gRNA) по II кластерные регулярно interspaced короткие палиндромные повторы системы (CRISPR) типа, и результаты были идентифицированы с помощью Вестерн-блоттинга (рис 4А). LAPTM4B-35 усиливается миграция опухолевых клеток и способность вторжения поддержка Информация Acknowledgments We спасибо Guoshuang Фэн (от китайского Центра по контролю и профилактике заболеваний) за его любезное помощь в статистических данных.
<р> Transwell (размер пор 8 мкм; Cell Biolabs, США). Анализ был использован для анализа клеток вторжения в соответствии с инструкциями изготовителя. 8 × 10 4 клетки были помещены в верхних камерах в бессывороточной среде, а нижние камеры были заполнены DMEM и 10% FBS. После инкубации в течение 72 часов при 37 ° С, неинвазивные клетки на верхней поверхности мембран были удалены с помощью ватного тампона. Мембраны фиксировали метанолом в течение 10 мин и окрашивали 0,5% кристаллическим фиолетовым в течение 10 мин. Клетки на нижней стороне фильтра были из подсчитывали пять случайно выбранных микроскопических просмотров.
Вестерн-блот-анализ
<р> Уровни экспрессии белка линий GC клеток измеряли с помощью вестерн-блот анализа. Клетки лизируют в предварительно охлажденный RIPA буфере для лизиса (Pierce Biotechnology, Rockford, IL), содержащей ингибиторов протеаз (Roche, Basel, Switzerland) в течение 30 мин после центрифугирования при 15,000g в течение 20 мин, получали супернатант. 50 мкг из белковых экстрактов были разделены на 10% SDS-электрофореза в полиакриламидном геле и переносили на 0,45 мкм поливинилиденфторида (ПВДФ), мембрана (Ватман, Германия). Мембрану блокировали в течение 1 ч при комнатной температуре блокирующим буфером (рН 7,6), содержащего 5% обезжиренного сухого молока, а затем инкубировали с анти-LAPTM4B-35 антителом (1: 800; подарены профессором RL Zhou) при 4 ° С в течение ночи , Мышиного антитела против человеческого β-актина антитела (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), был применен в качестве внутреннего контроля. Иммунореактивного полосы визуализируют с использованием системы обнаружения хемилюминесценции (Pierce Biotechnology, Rockford, IL).
Статистический анализ
<р> Хи-квадрат тест был использован для сравнения различий в экспрессии белка LAPTM4B-35 между GC ткани и прилегающих тканей доброкачественное. Безусловные модели логистического регрессионного анализа были использованы для анализа взаимосвязи между выражением LAPTM4B-35 и клинико-патологическими параметрами с коррекцией по полу статуса. Отличие выражение LAPMT4B-35
мРНК между GC и прилегающих к нему нераковых тканей анализировали Вилкоксона соответствует тест пары.
<Р> Общая выживаемость (OS) кривая была рассчитана с помощью метода Каплана-Мейера и анализировали с помощью теста лог-ранга. Относительный риск (RR) смерти, связанной с LAPTM4B-35 экспрессии и других предикторов были оценены из однофакторном Кокса модели во-первых. Модели Мультивариантный Кокс также были построены для оценки RR для выражения LAPMT4B-35. Все статистические анализы проводились с использованием программного обеспечения SPSS статистического пакета (версия 20.0; SPSS Inc., Чикаго, Иллинойс, США). Двусторонний значение P
менее 0,05 считалось статистической значимости.
Результаты
<р> Мы, во-первых исследовали экспрессию LAPTM4B-35 Ру по оТ-ПЦР в 5 клеточных линиях GC (MGC-803, КУП-823, MKN-28, SGC-7901 и AGS), а затем обнаружить его экспрессия белка с помощью Вестерн-блоттинга. Результаты показали, что было выражено LAPTM4B-35 во всех клеточных линиях в обеих мРНК и уровня белка (рис 1А, верхняя и нижняя панель), то мы выбрали BGC-823 и SGC-7901 ячеек для наших следующих тестов функции клеток.
выражение был также обнаружен в 24 пар образцов резецированных GC по QRT-PCR. Как мы можем видеть в рис 1B, то LAPTM4B-35
выражение в GC тканях значительно выше по сравнению с парными соседними нераковых тканей ( P
= 0,017) (рис 1В).
человека <р> Мы исследовали экспрессию LAPTM4B-35 в GC и прилегающих к нераковых тканей с помощью иммуногистохимического анализа. LAPTM4B-35 не экспрессировали в нормальной слизистой оболочке желудка (Фиг.2А), но выраженные в кишечной метаплазией, дисплазия поражения (данные не показаны), и опухолевые клетки, и в основном локализованы в цитоплазме или на клеточной мембране (фиг.2В и 2D -2Н). LAPTM4B-35 часто наблюдается в дс тканях по сравнению с согласованной смежного нераковых слизистых оболочек (68,3% против 16,1%, P
= 0,000) (таблица 1).
Взаимосвязь между экспрессией LAPTM4B-35 и клинико-патологические характеристики
<р> Мы проанализировали связь между LAPTM4B-35 экспрессии и клинико-патологическими характеристиками больных GC. В качестве пола, объекты в нашем исследовании имеет свое отклонение (167 vs. 73, Таблица 2), мы рассчитали свои отношения путем логистического регрессионного анализа и скорректирована с учетом гендерного статуса. LAPTM4B-35 чаще наблюдалось слабо дифференцированы ШС по сравнению с умеренной хорошо дифференцированной них (65,4% против 57,9%, P
= 0,017). Кроме того, LAPTM4B-35 выражение было связано с вторжением лимфоваскулярной ( P
= 0,000), глубина вторжения ( P
= 0,016) и метастазов в лимфатических узлах ( P =
0,029) (таблица 2).
<р> Рисунок 3 показывает анализ LAPTM4B-35 экспрессии и клинические исходы. Кривые выживаемости Каплана-Мейера показал, наблюдалась тенденция более короткой общей выживаемости (ОВ) у пациентов с ГК LAPTM4B-35 положительном выражении по сравнению с отрицательными ( P
= 0,064, лог-ранговый = 3,425) (рис 3A). После того, как пациенты были разделены по TNM I-III или пациентов без lypmphovascular вторжения, пациенты с LAPTM4B-35 положительной экспрессии показали значительно меньшую ОС, чем те отрицательные ( P
= 0,006 и P = 0,001
., соответственно) (рис 3B и 3D)
<р> результаты одномерных и многомерных моделей Кокса для OS пациентов GC в TNM стадии I-III выставлены, что глубина вторжения (RR = 3,103, 95% ДИ: 1,427 -6,748; P
= 0,004), метастазов в лимфатических узлах (ОР = 3,015, 95% ДИ: 1.552-5.858; P
= 0,001) и LAPTM4B-35 уровень экспрессии (RR = 2,249 , 95% ДИ: 1.242-4.072; P
= 0,007) существенно повлияло на выживаемость GC, соответственно (таблица 3); Кроме того, LAPTM4B-35 положительное выражение было независимым прогностическим фактором (ОР = 1,897, 95% ДИ: 1.041-3.457; P
= 0.025). Метастазов в лимфатических узлах (ОР = 2,665, 95% ДИ: 1.362-5.213; P
= 0,001) и независимо друг от друга предсказали ОС (таблица 3)
<р> анализ пролиферации клеток измеряли с помощью ССК-8 комплекта подсчета клеток. Значение оптической плотности клеток BGC-823-AF на 72 часов после нанесения была значительно выше, чем те, родительских клеток и напускной клеток, а результат был как раз напротив, сбив из LAPTM4B-35 в SGC-7901 клеток (рис 4б).
<р> После трансфекции с pcDNA3.0-AF и hCas9 /gRNA, мы провели ранозаживляющие анализа для анализа миграции способность LAPTM4B-35 сверхэкспрессия /нокдаун клетки рака желудка (рис. 5А) Результаты показали, что LAPTM4B-35 способствовало BGC-823 (КУП-823-AF) миграцию клеток по сравнению с BGC-823 и имитационной ( P
&л; 0,05), и вниз регуляции экспрессии LAPTM4B-35 может обратное это явление в SGC-7901 клеток ( P
&л; 0,05, фиг.5В)
<р> Соответственно, эффект LAPTM4B-35 на инвазивности опухолевых клеток изучали с помощью анализа Transwell. (фиг.6А). Мы обнаружили, что вторгся число клеток была значительно выше в LAPTM4B-35-трансфицированных BGC-823 клеток и ниже в нокдаун SGC-7901 клеток, чем в их контрольных клеток, соответственно ( P
&л; 0,05, фиг.6В). Эти результаты свидетельствуют о том, что LAPTM4B-35 способствует миграции и инвазии клеток рака желудка.
Обсуждение
<р> GC является весьма гетерогенным заболеванием, где даже аналогичные клинические и патологические особенности приводят к различным результатам [27, 28], указывая, что система TNM плацдарм для GC имеет свои ограничения и побудит к поиску новых молекулярных биомаркеров, которые могут предсказать исход и лечение пациента. Онкоген LAPTM4B-35 находится на хромосоме 8q22, и увеличение числа копий ДНК на хромосоме 8q22 является частым нахождение в GC в соответствии с нашим предыдущим исследованием (неопубликованные данные). При раке молочной железы, избыточная экспрессия LAPTM4B-35 и 8q22 амплификации способствовали де новье
химиорезистентность к антрациклинов и снисходительны метастатического рецидива [29].
<Р> В этом исследовании мы исследовали LAPTM4B-35
выражение в 24 рака желудка и их парными нераковых желудка хирургических образцов по QRT-ПЦР и обнаружили, что LAPTM4B-35 уровень экспрессии мРНК
при раке желудка был значительно повышен по сравнению с, что в паре группа нераковые ткани. Кроме того, иммуногистохимический анализ в 180 пар рака желудка показало LAPTM4B-35 был избыточно экспрессируется в тканях GC (68,3%) по сравнению с их парного доброкачественное слизистую оболочку (16,1%). LAPTM4B-35 способствует росту опухоли и толерантность к метаболическим и генетического стресса при помощи индукции аутофагии [30, 31]. В нашем настоящем исследовании, функция LAPTM4B при раке желудка исследовали с помощью анализов в лабораторных условиях. Сверхэкспрессия LAPTM4B-35 в клетках BGC-823 также увеличивается жизнеспособность клеток в сыворотке условиях свободной культуры, а также. Если это явление вызвано autophage необходимо, чтобы исследовать.
<Р> Кроме того, мы также проанализировали корреляцию экспрессии LAPTM4B-35 с клинико-патологическими параметрами при раке желудка. Высокая экспрессия LAPTM4B-35 достоверно коррелировал со степенью дифференциации, лимфоваскулярной вторжения, глубины инвазии и метастазов в лимфатических узлах, предполагая, что LAPTM4B-35 может быть широко активируется при раке желудка, и он может играть жизненно важную роль в желудочном канцерогенеза и опухолевой прогрессии. По мере того как опухоль лимфоваскулярная инвазию и метастазирование lymphonode являются весьма важными клинические прогностические показатели рецидива опухоли, мы сделали анализ выживаемости. Кривые Каплана-Мейера, стратифицированных по LAPTM4B-35 экспрессии и стадии опухоли или лимфоваскулярной вторжения показали, что LAPTM4B-35 положительных пациентов имеют значительно худшие ОС по сравнению с LAPTM4B-35 негативных в стадии TNM I-III или без лимфоваскулярной вторжения подгруппы. Многофакторный Кокс регрессионного анализа в этой подгруппе показали, что среди всех анализируемых факторов, LAPTM4B-35 выражение является независимым прогностическим фактором у больных раком желудка в TNM стадий I-III, но на стадии IV. Это разумно, потому что пациент на стадии IV не в состоянии получить радикальную операцию и может быть обработан многими другими различными паллиативное лечение, все из которых будут влиять на прогноз. Эти результаты свидетельствуют о том, что склонность к LAPTM4B-35 может специфически предсказывает наиболее агрессивные и смертельные виды рака желудка у больных с ранней и без дистальной метастазов или без лимфоваскулярной вторжения.
<Р> В нашем настоящем исследовании мы обнаружили, что LAPTM4B -35 положительное выражение в целом коррелирует с плохим прогнозом у больных ГЦ стратифицированных стадии опухоли или лимфоваскулярной вторжения. Для функции LAPTM4B-35 в GC, далее мы проводили в пробирке анализа. Избыточная экспрессия LAPTM4B-35 в клетках БГС-823 показал значительное увеличение пролиферации клеток, миграции и инвазии, и понижающую регуляцию LAPMT4B-35 привела к обратным результатам. Чжоу и др. показал, что LAPTM4B-35 суперэкспрессия способствует выживанию клеток, дерегулирования пролиферацию и миграцию в HCC клетках [12]. Недавние исследования показали, что LAPTM4B-35 была в значительной степени связано с худшим клиническим исходом во многих злокачественных опухолей человека, таких как НСС [16], метастатической опухоли яичников [32], желчного пузыря [19, 33], внепеченочных холангиокарциномой [34] и рака эндометрия [22]. Эти накопленные свидетельства поддерживают наши текущие результаты, что свидетельствует о том, что LAPTM4B-35 избыточная экспрессия может играть важную роль в злокачественной трансформации и прогрессии GC
. <Р> Молекулярные механизмы LAPTM4B-35 в свойствах прогрессирования опухоли до сих пор не ясны. Некоторые предыдущие исследования показали, что LAPTM4B-35 необходим для лизосом гомеостаза, подкисление и функции, и что LAPTM4B-35 делает опухолевые клетки, устойчивые к лизосом-опосредованной клеточной смерти, вызванной экологическими и генотоксических напряжений [30, 31]. Сверхэкспрессия LAPTM4B-35 может активировать некоторые Протоонкогены, такие как с-Мус, C-JUN и С-FOS [35], а также способствовать распространению, миграцию и вторжение в некоторых линиях рака человека, который будет усиливать рост и метастазирование HCC ксенотрансплантатов у голых мышей [36]. Провести расследование предполагает, что LAPTM4B может улучшить клеточную пролиферацию или выживание через участие в трансдукции сигнала, такие как фосфатидилинозитол 3-киназы-протеинкиназой В пути. И LAPTM4B-35 может взаимодействовать с некоторыми связанных с раком белков, как белок фосфатазы 2A и протеинкиназы С [10]. Ли и др обнаружили, что LAPTM4B-35 стимулирует устойчивость ко многим лекарственным средствам раковых клеток, способствуя оттоку наркотиков и антиапоптоз путем активации PI3K /Akt сигнализации [24], что указывает на LAPTM4B-35 может быть новой мишенью терапии. Функциональная роль и механизм LAPTM4B в GC нуждаются в дальнейшем исследовании.
<Р> В заключение, данное исследование указывает на то, что LPTM4B-35 избыточная экспрессия играет важную роль в развитии клеточной пролиферации, миграции и инвазии в рака желудка. LAPTM4B-35 положительное выражение в желудочном раковых тканей коррелирует с неблагоприятным исходом и оказался независимым прогностическим фактором в подгруппе GC пациента в TNM стадии I-III или без лимфоваскулярной вторжения. Таким образом, LAPTM4B-35 может служить полезным биомаркером для предсказания прогноза в некоторой подгруппе GC. Кроме того, как роли LAPTM4B-35 в ограничении лизосом-опосредованная гибель клеток и содействие аутофагию оказывают значительное влияние на выживание в раковых клетках, и сверхвыражен LAPTM4B-35 в большом количестве рака желудка, это может быть полезным объектом для лечения подтипа группы рака желудка.
S1 Dataset. Отдельные результаты относительной мРНК экспрессии LAPTM4B-35, клеточной пролиферации, миграции и вторжения, выживание pathients и клинико-патологическими features.
(Excel)
doi:10.1371/journal.pone.0121559.s001
(XLS)