PLoS ONE: LAPTM4B-35, joka on syöpään liittyvien Gene, liittyy huonoon ennusteeseen TNM vaiheiden I-III mahasyövän Patients

tiivistelmä

Background

lysosomifuusio liittyvä transmembraaniproteiiniksi 4β -35 (LAPTM4B-35), joka kuuluu nisäkkäiden 4-tetratransmembrane sivuavaa proteiinia superperheen, on raportoitu olevan yli-ilmentynyt useissa syövissä. Kuitenkin ilmaus LAPTM4B-35 ja sen rooli etenemistä mahasyövän (GC) on edelleen tuntematon. Tutkimuksen tavoitteena oli tutkia LAPTM4B-35 ilmentyminen GC, sen mahdollisuudet merkitystä ennusteeseen viittaavia parametreja ja rooli LAPTM4B-35 aikana mahasyövän.

Methods

Tässä tutkimuksessa, parafiinia -Embedded näytteet GC (n = 240, mukaan lukien 180 pariksi yksilöt) ja 24 pariksi tuore kudosta analysoitiin. qRT-PCR ja immunohistokemia (IHC) käytettiin ekspression analysoimiseksi LAPTM4B-35 GC. Vaikutukset LAPTM4B-35 GC solujen lisääntymisen, migraation ja invaasion määritettiin yli-ilmentymisen ja knockdown määrityksissä.

Tulokset

IHC osoitti, että LAPTM4B-35 ilmentyi 68,3% (123/180 ) GC kudoksiin, kun taas 16,1% (29/180) niiden pariksi viereisen noncancerous mahan kudoksissa ( P
= 0,000). LAPTM4B-35
mRNA tasot GC kudoksissa myös merkittävästi kohonnut verrattuna niiden pariksi viereisen noncancerous kudoksiin ( P
= 0,017). Yli-ilmentymisen LAPTM4B-35 oli merkitsevästi yhteydessä erottelua syvyys invaasio, lymphovascular invaasio ja imusolmuke etäpesäke ( P
< 0,05). Kaplan-Meier selviytymisen käyrät paljasti, että potilaalla on LAPTM4B-35 ilmentyminen oli merkittävä väheneminen yleisessä (OS) vaiheittain I-III GC potilailla ( P
= 0,006). Monimuuttuja-analyysi osoitti korkea ilmentyminen LAPTM4B-35 oli itsenäinen ennustetekijä OS vaiheessa I-III GC potilailla ( P
= 0,025).

Johtopäätös

Nämä havainnot osoittavat, että LAPTM4B-35 yliekspressio voi liittyä GC etenemistä ja huono ennuste, ja siten ne voivat toimia uuden ennusteen merkkiaine ennusteen GC potilailla.

Citation: Cheng X, Zheng Z, Bu Z, Wu X Zhang L, Xing X, et al. (2015) LAPTM4B-35, joka on syöpään liittyvien Gene, liittyy huonoon ennusteeseen TNM vaiheiden I-III mahasyöpäpotilaista. PLoS ONE 10 (4): e0121559. doi: 10,1371 /journal.pone.0121559

Academic Editor: Ken-ichi Mukaisho, Shiga University of Medical Science, Japani

vastaanotettu: 10 huhtikuu 2014; Hyväksytty: 12 helmikuu 2015; Julkaistu 7 huhtikuuta 2015

Copyright: © 2015 Cheng et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat National Natural Science Foundation of China (nro 30471677 ja 81141024) ja National Key Technology R &D Program (Pekingin Kunnan Science and Technology Project Z121100007512010). Rahoittajat osaltaan tutkimuksen suunnittelu, suorituskyky, reagenssit, materiaalit, tietojen analysointi ja päätös julkaista.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mahasyöpä on kolmanneksi yleisin syöpä Kiinassa ja suurin syy syöpään liittyvät kuolemat Kiinassa [1]. Valtaosa GC potilaat ovat jo pitkälle aikaan diagnoosin (vaihe III ja IV), mikä tekee ennuste on synkkä, vaikka parantaa kirurginen ja adjuvanttihoitona lähestymistapa [2-5]. Riippumatta kemoterapiaa ja tarkoitettu parantava leikkaus, lähes 60%: lla GC kehittää toistuminen ja lopulta kuolevat etäpesäkkeitä [6]. GC eteneminen on monitekijäinen ja monivaiheinen prosessi, jossa perinnöllinen ja ympäristötekijät tärkeässä rooleja [7]. Aiemmat havainnot osoittavat, että klassinen biomarkkereita ja lavastus järjestelmiä, jotka perustuvat kliinisiin ja patologisten löydökset, saattavat käyttää rajoituksia kliiniset sovellukset ja pakottaa kehittämään uusia molekyyli biomarkkereita joka voi ennustaa potilaiden hoitotuloksiin ja hoito [8, 9].

lysosomifuusio liittyvä proteiini transmembraaninen 4 beta (LAPTM4B) on alunperin kloonattu maksasolukarsinoomat (HCCs) Shao et ai, joka sijaitsee kromosomissa 8q22, alueella usein monistettiin rintasyövän ja HCC [10, 11]. Se koodaa kaksi proteiinia, joilla on erilaiset molekyylipainon, 24-kDa ja 35-kDa: n proteiinit (LAPTM4B-24 ja -35), jossa on neljä oletetun trans- [12]. Lokalisointi LAPTM4B-35 ei havaittu ainoastaan ​​lysosomiin, mutta myös solukalvon ja sisäisen soluelimiin kuten Golgin laite ja endosomeihin [13]. On raportoitu, että LAPTM4B-35 on yleisesti ilmaistu eri syöpä. Aiemmat raportit osoittivat, että yli-ilmentyminen LAPTM4B-35 liittyy epäedullinen biologista käyttäytymistä ja huonon ennusteen monissa syövissä, kuten rintasyövän [14], HCC [15-17], sappirakon syöpä [18, 19], peräsuolen syöpä [20] , munasarjan epiteelin karsinooman [21] ja kohdun limakalvon karsinooman [22]. Se on myös raportoitu, että alleelinen vaihtelu LAPTM4B liittyi geneettinen alttius GC [23]. Lisäksi yli-ilmentyminen LAPTM4B-35 transfektoimalla LAPTM4B cDNA edistää solujen lisääntymisen, migraation hyökkäyksen HCC nude-hiirissä ja indusoi monilääkeaineresistenssin [24]. Knockdovvn LAPTM4B RNA interferenssin kääntäen päinvastaiseksi kaikki nämä pahanlaatuiset fenotyyppisten ominaisuuksien HCC [24, 25].

Kuitenkin LAPTM4B-35 ilme, sen merkitys ennusteeseen viittaavia ominaisuuksia, ja biologisen roolin LAPTM4B-35 GC jää epäselväksi. Esillä olevassa tutkimuksessa pyrittiin tunnistamaan LAPMT4B-35 ilmentyminen GC ja sen mahdollisia suhdetta kliinis-, ja sen ennustetekijöitä merkitys. Lisäksi in vitro funktionaaliset määritykset suoritettiin kuvaamaan biologisia vaikutuksia LAPTMEB-35 mahalaukun kasvainten muodostumiseen.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics

Kaikki potilaat olivat allekirjoittaneet tietoisen suostumuksen saamiseksi kudosnäytteitä, ja tutkimussuunnitelman hyväksyi Clinical Research eettisen komitean Pekingin yliopiston Cancer sairaala.

Ihmisen mahalaukun kudosnäytteiden

yhteensä 240 (167 urosta ja 73 naarasta, vuotiaista 22-87 vuotta, ja mediaani-ikä oli 60 vuotta) formaliinilla parafiiniin upotettuja GC kudoksissa, mukaan lukien 180 pariksi syöpä- ja sovitettu viereisen noncancerous mahan limakalvon kudokset, kerättiin GC potilailla, joille gastrectomy Pekingin yliopisto Cancer sairaala tammikuusta 2003 joulukuu 2011. kliiniset ja histologiset tiedot kulloinkin kerättiin myös mukaan hyväksyttyjen vakiintuneiden ohjeiden. Vuoden 1997 UICC-TNM kriteereitä käytettiin luokitteluun syöpien. Mediaani seuranta kesto ajoista diagnoosi oli 26,2 kuukautta (alue, 2,4-119,0kuukausi). Kaikkiaan 112 (46,7%) potilaista kuoli seuranta-ajan.

immunohistokemia

Parafiinisektioista (4 pm) poistettiin vaha ja niihin lisätään xylem ja etanoliin. Immunohistokemia suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [16] käyttäen anti-LAPTM4B-35-vasta-ainetta (1: 200) (lahjakas Pro. RL Zhou). Negatiivisina kontrolleina, leikkeet prosessoitiin samalla menettelyllä, paitsi että niitä inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa blokkausliuoksessa ilman primaarista vasta-ainetta.

ilmentyminen LAPTM4B-35 arvioitiin kaksi kokenutta patologit (Y Sun ja B Dong), joka toimi itsenäisesti ja oli sokaissut potilaiden kliinisiä tuloksia. Eroja tarkkailijoita havaittiin alle 10% tutkituista dioja, ja päästiin jälkeen tarkempaa tarkastelua. Värjäystä arviointi oli juuri käytetty semikvantitatiivinen menetelmiä luokitella LAPTM4B-35 ilmentyminen kuin negatiivisen ja positiivisen värjätään immunoreaktii- soluja. Suhde positiivisuus pisteytettiin '' 0 '(< 10% positiivisia kasvainsoluja),' "1" (10-50% positiivisia kasvainsoluja), ja '' 2 "(> 50% positiivisia kasvainsoluja). Värjäytymisintensiteettiä pisteytettiin '' 0 "(ei värjäytymistä tai heikosti värjätty), '' 1" (kohtalainen värjäytyminen), tai '' 2 "(voimakas värjäytyminen). Summa värjäytymisen intensiteetti pisteet ja prosenttiosuuden pisteet käytettiin määrittelemään LAPMT4B ekspressiotasoja: 0-2, negatiivinen ilmaus ja 3-4, positiivinen ilme (14). Positiivinen lauseke ainoastaan ​​arvioinut jaksoon, joissa on vähintään 10% positiivisia alueen kasvaimia.

Soluviljely, LAPTM4B-35-ekspressioplasmidin ja hCas9 /gRNA transfektio

Mahasyöpää solulinjoissa (SGC- 7901, BGC-823, MGC-803, MKN-28 ja AGS) viljeltiin DMEM: ssä (Wisent Inc., St-Bruno, QC, Kanada) täydennettynä 10% naudan sikiön seerumia (FBS) (HyClone, Logan, UT, USA) ja 100 U /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä, 37 ° C: ssa ilmakehässä, jossa 5% CO _{2. pcDNA3
. 0-AF
sisältävä koko ORF LAPTM4B tuottaa LAPTM4B-35-proteiini oli lahjakas prof RL Zhou [11]. Transfektio suoritettiin Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) valmistajan protokollan. Positiivinen solu kloonit saatiin antibiootti valinta G418: aa (Gibco, Grand Island, NY), jonka pitoisuus on 800 ng /ml.}

hCas9 ja gRNA vektori oli hankittu Kiinasta Zebrafish Resource Center (CZRC). Täyspitkä Cas9 cDNA kloonattiin pXT7 vektoriin ja linearisoitu, ja rajattu mRNA syntetisoitiin käyttäen mMessage mMACHINE mRNA transkriptio synteesin sarjat (Life Technologies, Carlsbad, Kalifornia, USA). GRNA alukesekvenssit käytettiin: forward-aluke, 5'-TACGACTCACTATAGGGGGATGGTGCCGGTGCGGACAGTTT TAGAGCTAGAAATAGC-3 ', ja reverse-aluke: 5'-AGCACCGACTCGGTGCCACT-3'.The protokollan seurasi aiemmin julkaistun paperin [26]. hCas9 mRNA (3 ng /ul) ja gRNA (0,2 ng /ul) kotransfektoitiin SGC-7901 solujen suoritettiin Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA).

RNA: n eristämistä, kvantitatiivisen tosiaikaisen käänteistranskriptio PCR (qRT-PCR) B

Kokonais-RNA uutettiin käyttäen TRIzol reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), ja käänteistranskriptio cDNA: ksi käyttäen M-MLV käänteistranskriptaasia (Promega, Madison, WI, USA) mukaisesti valmistajan ohjeita. Reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttäen ABI 7500 Fast reaaliaikainen PCR-järjestelmän (Life Technologies, Carlsbad, Kalifornia, USA). β-aktiini on käytetty sisäisenä kontrollina. Alukesekvenssit käytetään, on lueteltu alla: LAPMT4B-35: forward-aluke: 5'-GGAAGCAGGACAGCCAACTT-3 ', käänteinen aluke: 5'-TTATTCTCGATCTCACAACCAAAC-3'; β-aktiini: forward-aluke: 5'CCTGTGGCATCCACGAAACT-3 'käänteinen aluke: 5'GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3'.

Soluproliferaatiomääritys

Solulisääntyminen mitattiin Cell Counting Kit-8 (CCK-8) (Dojindo, Japan) mukaan valmistajan ohjeiden mukaisesti. Tilavuus 100 ui solususpensiota (3000 solua per kuoppa) inkuboitiin 96-kuoppaisella levyllä (Costar, Corning, NY) 24, 48, 72, 96 tuntia. 10 ui CCK-8-liuosta lisättiin kuhunkin kuoppaan ja inkuboitiin 3 tuntia 37 ° C: ssa. Absorbanssiarvot kaikki kuopat määritettiin 450 nm: ssä, jossa on viite aallonpituudella 630 nm on Microplate Reader (Bio-Rad, USA). Koe tehtiin kolmena kappaleena ja toistettiin kahdesti.

haavanparantumis- määritys

Solun muuttoliikettä mitattiin haavan paranemista määrityksen mukaan IncuCyte HD-järjestelmän (IncuCyte ZOOM, Essen BioScience, USA). Solut siirrostettiin 96-kuoppaisille levyille tiheydellä 6 x 10 ^{4 solua kuoppaa kohti. Haava kautta yksisolukerros solujen tappikappaleen ja solut pestiin 1 x PBS: llä, viljeltiin DMEM-alustassa, jossa oli 10% naudan sikiön seerumia. Valokuvia solut kuvattiin käyttämällä IncuCyte HD järjestelmä 4 tunnin välein 2 erilliseen alueeseen per kuoppa käyttäen 10x tavoite. Arvot 2 alueilla kunkin hyvin yhdistettiin ja keskiarvo kaikissa 3 rinnakkaisnäytteiden.}

TranswellTM invaasio määrityksissä

TranswellTM (8 um huokoskoko Cell Biolabs, USA) määritystä käytettiin analysoimaan soluinvaasiota mukaan valmistajan ohjeiden. 8 x 10 ^{4-solut sijoitettiin ylähuoneissa seerumittomassa median ja alakammioissa täytettiin DMEM ja 10% FBS. Inkuboinnin jälkeen 72 tuntia 37 ° C: ssa, ei-invasiivisia solujen yläpinnan kalvot poistettiin pumpulipuikolla. Membraanit kiinnitettiin metanolilla 10 minuutin ajan ja värjättiin 0,5% kristallivioletilla 10 minuutin ajan. Solujen alapuolella suodattimen oli viisi satunnaisesti valittua mikroskooppisen näkymät laskettiin.}

Western blot-analyysi

proteiinin ekspressiotasot GC-solulinjoja mitattiin Western Blot -analyysillä. Solut lyysattiin ennalta jäähdytetty RIPA lyysipuskuria (Pierce Biotechnology, Rockford, IL), joka sisälsi proteaasi-inhibiittoriseosta (Roche, Basel, Sveitsi) 30 min: n kuluttua sentrifugoimalla 15000 g 20 minuutin ajan, supernatantti saatiin. 50 ug proteiinia uutteet erotettiin 10% SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla, ja se siirretään 0,45 um polyvinylideenidifluoridi (PVDF) kalvo (Whatman, Saksa). Membraani blokattiin 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa estopuskurilla (pH 7,6), joka sisälsi 5% rasvatonta kuivamaitoa, inkuboitiin sitten anti-LAPTM4B-35-vasta-ainetta (1: 800; lahjakas professori RL Zhou) 4 ° C: ssa yön yli . Hiiren anti-ihmisen β-aktiini-aineella (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) levitettiin sisäisenä kontrollina. Immunoreaktiivisia bändit visualisoitiin käyttäen kemiluminesenssidetektiolla järjestelmä (Pierce Biotechnology, Rockford, IL).

Tilastollinen

Chi-square testiä käytettiin vertaamaan eroja LAPTM4B-35-proteiinin ilmentymisen välillä GC kudokset ja viereisten noncancerous kudoksiin. Ehdoton regressioanalyysimme malleja käytettiin analysoimaan suhteita LAPTM4B-35 ilmentyminen ja kliinis parametreja säätää sukupuolen status. Ero on LAPMT4B-35
mRNA ilmaisun välillä GC ja viereisten noncancerous kudoksia analysoitiin Wilcoxonin sovitettu pari testiä.

Kokonaiselossaoloaika (OS) käyrä laskettiin Kaplan-Meier menetelmällä ja analysoidaan log-rank-testi. Suhteelliset riskit (RRS) kuoleman liittyy LAPTM4B-35 ilmaisun ja muiden ennustaja muuttujia arvioitiin päässä yhden muuttujan Coxin suhteellisten riskien mallia ensiksi. Coxin monimuuttuja malleissa myös rakennettiin arvioida RR LAPMT4B-35 ilme. Kaikki tilastolliset analyysit tehtiin SPSS ohjelmistoa tilastopaketilla (versio 20.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Kaksipuolinen P
arvo alle 0,05 pidettiin tilastollista merkittävyyttä.

Tulokset

Expression analyysin LAPTM4B-35 GC solulinjoissa ja GC

ensin tarkasteltiin ilmentymisen LAPTM4B-35
RT-PCR: llä 5 GC solulinjoissa (MGC-803, BGC-823, MKN-28, SGC-7901 ja AGS), ja sitten havaittiin sen proteiinin ilmentyminen Western blotilla. Tulokset osoittivat, että LAPTM4B-35 ilmentyi kaikissa solulinjoissa sekä mRNA ja proteiini tasoilla (kuvio 1A, ylempi ja alempi paneeli), niin päätimme BGC-823 ja SGC-7901-solujen meidän seuraava solujen toiminnan tutkimus.

LAPTM4B-35
ilmentyminen havaittiin myös 24 paria resektoitiin GC näytteistä qRT-PCR. Kuten näemme, että kuviossa 1B, LAPTM4B-35
ilmentyminen GC kudoksissa merkittävästi koholla verrattuna pariksi viereisen noncancerous kudoksiin ( P
= 0,017) (kuvio 1 B).

LAPTM4B-35-proteiinin ekspressio havaitaan usein ihmisen GC

tutkittiin ekspressiota LAPTM4B-35 GC ja viereisten noncancerous kudosten avulla immunohistokemiallinen analyysi. LAPTM4B-35 ei ilmaista normaalin mahan limakalvon (kuvio 2A), mutta ilmaistuna suoliston metaplasia, dysplasia vaurio (Data ei esitetty) ja kasvainsolujen, ja pääasiallisesti paikallinen sytoplasmassa tai solukalvon (kuvio 2B ja 2D -2H). LAPTM4B-35 havaitaan usein GC kudoksissa verrattuna Hyväksytty viereisen noncancerous limakalvo (68,3% vs. 16,1%, P
= 0,000) (taulukko 1).

väliset LAPTM4B-35 ilmaisun ja kliinis ominaisuudet

Analysoimme suhdetta LAPTM4B-35 ilmentyminen ja kliinis ominaisuudet GC potilaista. Koska sukupuoli, esineet tutkimuksessamme on niiden poikkeama (167 vs. 73, taulukko 2), laskimme suhdettaan regressioanalyysimme ja oikaistu sukupuolen status. LAPTM4B-35 havaittiin useammin huonosti eriytetty GC verrattuna kohtalainen-hyvin erilaistuneet (65,4% vs. 57,9%, P
= 0,017). Lisäksi LAPTM4B-35 ilmentyminen liittyi lymphovascular invaasio ( P
= 0,000), syvyys invaasio ( P
= 0,016) ja imusolmuke etäpesäke ( P
= 0,029) (taulukko 2).

LAPTM4B-35 ilmentyminen ja ennusteen GC potilaiden

kuvio 3 esittää analyysin LAPTM4B-35 ilmentyminen ja kliinisiä tuloksia. Kaplan-Meier selviytymisen käyrät osoittivat oli taipumus lyhyemmän kokonaiselinaika (OS) GC potilailla, joilla LAPTM4B-35 positiivinen ilmaisu verrattuna negatiivisia ( P
= 0,064, log-rank = 3,425) (kuvio 3A). Sen jälkeen potilaat stratifioitiin TNM I-III tai potilailla, joilla ei lypmphovascular invaasio, potilaalla on LAPTM4B-35 positiivinen ilme näytti huomattavasti lyhyempi OS kuin negatiivisiin ( P
= 0,006 ja P
= 0,001 , vastaavasti) (kuvio 3B ja 3D).

tulokset yhden ja usean Coxin malleja OS GC potilaiden TNM vaiheen I-III näytteillä että syvyys invaasio (RR = 3,103, 95% CI: 1,427 -6,748; P
= 0,004), imusolmuke etäpesäke (RR = 3,015, 95% CI: 1,552-5,858; P
= 0,001) ja LAPTM4B-35 ekspressiotason (RR = 2,249 , 95% CI: 1,242-4,072; P
= 0,007) vaikuttaa merkittävästi selviytymisen GC, vastaavasti (taulukko 3); Lisäksi LAPTM4B-35 positiivinen ilme oli itsenäinen ennustetekijä (RR = 1,897, 95% CI: 1,041-3,457; P
= 0,025). Imusolmuke etäpesäke (RR = 2,665, 95% CI: 1,362-5,213; P
= 0,001) myös itsenäisesti ennustettu OS (taulukko 3).

LAPTM4B-35 edistää kasvainsolujen proliferaatiota

jotta vaikutuksen tutkimiseksi LAPMT4B-35 toiminta solubiologian, kaksi solulinjat perustettiin. BGC-823 ja SGC-7901 esitteleville soluille suhteellisesti pienempiä tai suurempia ilmentymisen LAPTM4B-35 oli erikseen valittu yli-ilmentymisen ja taintumisen määritys (kuvio 1A). Ensimmäisessä solulinja BGC-823-AF yliekspressoivia LAPTM4B-35 pysyvästi perustettiin, ja MOCK käytettiin kontrollina tässä solulinjassa. Toiseksi LAPTM4B-35 stabiilisti pudotettiin towarding kohteeseen SGC-7901 (hCas9 /gRNA) mukaan tyypin II ryhmittyneet säännöllisesti ryhmittyneinä lyhyt palindromisiin toistoja (CRISPR) järjestelmä, ja tulokset tunnistettiin Western blot (kuvio 4A).

Soluproliferaatiomääritys mitattiin CCK-8 solulaskennan kit. Absorbanssi arvo BGC-823-AF-solujen 72 tunnin kuluttua leviämistä oli merkittävästi suurempi kuin vanhemman soluja ja mock-solut, ja tulos oli aivan vastapäätä naputtamalla alas LAPTM4B-35 SGC-7901-soluissa (kuvio 4B).

LAPTM4B-35 tehostettu kasvainsolun muuttoliikettä ja invaasiota kyky

jälkeen transfektoimalla pcDNA3.0-AF ja hCas9 /gRNA, suoritimme arpeutumisprosessit määritys analysoida muuttoliikkeen kykyä LAPTM4B-35 yli-ilmentyminen /knockdown mahasyövän soluja (kuvio 5A). Tulokset osoittivat, että LAPTM4B-35 edistänyt BGC-823 (BGC-823-AF) solumigraation verrattuna BGC-823 ja MOCK ( P
< 0,05), ja alas-säätely LAPTM4B-35 ilmentyminen voisi kääntää tätä ilmiötä SGC-7901-solut ( P
< 0,05, kuvio 5B).

Näin ollen, vaikutusta LAPTM4B-35 invasiivisuus kasvainsolujen tutkittiin käyttämällä transwell määritystä (kuvio 6A). Huomasimme, että hyökkäsi solujen määrä oli merkitsevästi suurempi LAPTM4B-35-transfektoitujen BGC-823-solujen ja pienempi knockdown SGC-7901-soluissa, kuin niiden kontrolli-soluissa, vastaavasti ( P
< 0,05, kuvio 6B). Nämä tulokset viittaavat siihen, että LAPTM4B-35 edistää muuttoliikkeen ja invaasion mahalaukun syöpäsoluja.

Keskustelu

GC on hyvin heterogeeninen sairaus, jossa jopa samanlaisia ​​kliinisiä ja patologisia piirteitä johtaa erilliset seuraamukset [27, 28], mikä osoittaa, että TNM pysähdyspaikan järjestelmä GC on niiden rajoitettu ja pakottaa etsimään uusia molekyyli biomarkkereita joka voi ennustaa potilaan lopputulokseen ja hoitoon. Onkogeeni LAPTM4B-35 sijaitsee kromosomissa 8q22, ja voitto DNA kopioluvun kromosomissa 8q22 on usein löydös GC mukaan edellisessä tutkimuksessa (julkaisematon data). Rintasyövässä yliekspressio LAPTM4B-35 ja 8q22 vahvistus olivat osallistuneet de Nove
chemoresistance antrasykliinien ja ovat sallivia metastasoineeseen uusiutumisen [29].

Tässä tutkimuksessa selvitettiin LAPTM4B-35
ilmentymistä 24 mahasyövän ja niiden pariksi noncancerous mahalaukun kirurginen näytteistä qRT-PCR ja totesi, että LAPTM4B-35
mRNA ekspressiotaso mahasyövässä oli merkittävästi koholla verrattuna, että pariksi noncancerous kudosryhmässä. Lisäksi immunohistokemiallinen analyysi 180 paria mahasyövän osoitti LAPTM4B-35 yliekspressoitui GC kudoksissa (68,3%) verrattuna niiden pariksi noncancerous limakalvo (16,1%). LAPTM4B-35 edistää kasvaimen kasvua ja sietokyky metabolisen ja geneettisen stressiä induktion autophagy [30, 31]. Meidän esillä olevassa tutkimuksessa, toiminta LAPTM4B mahasyövän tutkittiin in vitro. Yli-ilmentymisen LAPTM4B-35 BGC-823-solujen lisääntynyt solujen elinkelpoisuus seerumittomassa viljelyolosuhteet samoin. Jos tämä ilmiö johtuu autophage tarvitaan tutkittava.

Lisäksi olemme analysoineet korrelaatio LAPTM4B-35 ilmaisutapoja kliinis parametrit mahasyövässä. Korkea LAPTM4B-35 ilmentyminen korreloi merkitsevästi erottelua lymphovascular invaasio, syvyys invaasion ja imusolmuke etäpesäke, mikä viittaa siihen, että LAPTM4B-35 voidaan laajasti aktivoida mahasyövän ja se voi olla tärkeä rooli mahasyövän ja syövän etenemiseen. Koska kasvain lymphovascular invaasion ja lymphonode etäpesäke ovat erittäin tärkeitä kliinisiä prognostisia indikaattoreita kasvaimen uusiutumisen, teimme selviytymisen analyysin. Kaplan-Meier -käyrät stratifioitu LAPTM4B-35 ilmentyminen ja kasvaimen vaiheesta tai lymphovascular hyökkäys paljasti, että LAPTM4B-35 positiiviset potilaat ovat merkittävästi huonompi OS verrattuna LAPTM4B-35 kielteisiä TNM vaiheissa I-III tai ilman lymphovascular invaasio alaryhmä. Coxin monimuuttuja regressioanalyysi tässä alaryhmässä osoittivat, että kaikkien analysoitiin tekijät, LAPTM4B-35 ilmentyminen on itsenäinen ennustetekijä mahasyöpäpotilaista TNM vaiheissa I-III, mutta vaiheessa IV. On järkevää, koska potilaan IV vaiheessa ei pysty vastaanottamaan radikaalia toimintaa ja voidaan käsitellä monilla erilaisilla lievittävä hoitoja, jotka kaikki vaikuttavat ennusteeseen. Nämä tulokset osoittavat, että alttius LAPTM4B-35 voi nimenomaan ennustaa kaikkein aggressiivinen ja kohtalokas tyyppisiä mahasyövän tapauksissa varhain ja ilman distaalisen etäpesäke tai ilman lymphovascular hyökkäystä.

Meidän Tässä tutkimuksessa havaittiin, että LAPTM4B -35 positiivinen ilmaisu yleensä korreloi huonompi ennusteen GC potilailla ositettu kasvaimen vaiheesta tai lymphovascular hyökkäystä. Jotta toiminta LAPTM4B-35 GC, olemme edelleen suoritetaan in vitro. Yli-ilmentymisen LAPTM4B-35 BGS-823-solut paljasti merkittävän kasvun solujen lisääntymisen, migraation ja invaasion ja alas-säätely LAPMT4B-35 lyijypitoista päinvastaiseen tulokseen. Zhou et al. on osoittanut, että LAPTM4B-35 yliekspressio edistää solujen eloonjäämistä, vapautettu proliferaatio ja migraatio HCC-soluissa [12]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat raportoineet, että LAPTM4B-35 liittyi merkittävästi huonommalla kliininen tulos monissa ihmisen maligniteettien, kuten HCC [16], metastasoitunut munasarjakasvain [32], sappirakon [19, 33], ekstrahepaattisen kolangiokarsinooma [34] ja kohdun limakalvon syöpä [22]. Nämä kertyneet todisteet tukevat nykyiset havainnot, mikä osoittaa, että LAPTM4B-35 yliekspressio voi olla tärkeä rooli pahanlaatuisiin ja etenemisen GC.

molekyylitason mekanismeja LAPTM4B-35 kasvainprogression ominaisuudet ovat vielä epäselviä. Jotkin aiemmat tutkimukset osoittivat, että LAPTM4B-35 vaaditaan lysosomiin homeostaasiin, happamoituminen ja toiminta, ja että LAPTM4B-35 tekee kasvainsolut resistenttejä lysosomiin-välitteisen solukuoleman aiheuttama ympäristön ja genotoksinen korostaa [30, 31]. Yli-ilmentymisen LAPTM4B-35 voisi käyttää joitakin proto-onkogeenien, kuten c-myc, c-jun ja c-fos [35], ja edistää proliferaatiota, migraatiota, ja invaasio joissakin ihmisen syövän linjat, jotka lisäisivät kasvua ja etäpesäke HCC nude-hiirissä [36]. Related tutkimus ymmärtää, että LAPTM4B voivat parantaa solujen lisääntymisen tai eloon kautta osallistuminen signaalinvälitysreitin, kuten fosfatidyyli 3 kinaasi-proteiinikinaasi B-reitin. Ja LAPTM4B-35 voivat olla vuorovaikutuksessa joidenkin syöpään liittyvien proteiinien, kuten proteiini fosfataasi 2A ja proteiinikinaasi C: n [10]. Li et al havaitsivat, että LAPTM4B-35 motivoi monilääkeaineresistenssin syöpäsolujen edistämällä lääkevuoto- ja anti-apoptoosin aktivoimalla PI3K /AKT signalointi [24], mikä osoittaa, että LAPTM4B-35 voi olla uusi tavoite hoidon. Toiminnallista roolia ja mekanismi LAPTM4B GC tarvitsevat lisätutkimuksia.

Yhteenvetona, nykyinen tutkimus osoittaa, että LPTM4B-35 yli-ilmentymisen on merkittäviä rooleja edistämisessä solujen lisääntymisen, migraation ja invaasion in syöpien. LAPTM4B-35 positiivista ilmentymistä mahasyövän kudoksissa korreloi huonon lopputuloksen ja osoittautui itsenäinen ennustetekijä alaryhmässä GC potilaan TNM vaiheissa I-III tai ilman lymphovascular hyökkäystä. Siten LAPTM4B-35 voi olla hyödyllinen biomerkkiaine ennustaa ennusteen tietyissä alaryhmässä GC. Lisäksi, koska roolit LAPTM4B-35 rajoittamaan lysosomissa-välitteistä solukuolemaa ja edistää autophagy on merkittäviä eloonjäämisen vaikutuksia syöpäsolujen ja LAPTM4B-35 on yli-ilmaistu suuri osa mahasyöpä, se voi olla hyödyllinen kohde hoitamiseksi alatyypin ryhmä mahasyövän.

tukeminen Information
S1 Dataset. Yksittäiset tulokset suhteellisen mRNA LAPTM4B-35 ilme, solujen proliferaatiota, migraatiota ja invaasiota, selviytymistä pathients ja kliinis features.
(Excel)
doi:10.1371/journal.pone.0121559.s001
(XLS)

Acknowledgments

We kiitos Guoshuang Feng (kiinalaisten Center for Disease Control and Prevention) ystävällisistä apua tietoja tilastoihin.

• PLoS ONE: n yli-ilmentyminen reseptorin glykaation lopputuotteita (RAGE) liittyy huonoon ennusteeseen mahasyövän
• PLoS One: vaikutus kasvaimensisäisenä Expression tasot fluoropyrimidiinipohjaiseen metaboloivia entsyymejä on Treatment Outcomes of Adjuvantti S-1 Therapy mahasyövän