Bakgrunn
microRNAs (mirnas) er mye studert ikke-kodende RNA som modulerer genuttrykk. Mirnas er deregulert i ulike tumorer inkludert magekreft (GC) og har potensielle diagnostiske og prognostiske implikasjoner. Målet med vår studie var å bestemme miRNA profil i GC vev, etterfulgt av evaluering av deregulerte miRNAs i plasma av GC pasienter. Ved hjelp av tilgjengelige databaser og bioinformatikk metoder vi også sikte på å vurdere potensielle målgener av bekreftet forskjellig uttrykt miRNA og validere disse funnene i GC vev.
Studien inkluderte 51 GC pasienter og 51 kontroller. I utgangspunktet vi skjermet miRNA uttrykket profil i 13 vevsprøver av GC og 12 normale mage vev med TaqMan lav tetthet array (TLDA). I det andre trinn ble det differensielt uttrykte mirnas validert i et replikasjons kohort ved hjelp QRT-PCR i vev og plasmaprøver. Deretter analyserte vi mulige målgener av deregulerte mirnas bruker bioinformatikk tilnærming, bestemt uttrykk i GC vev og utført korrelasjonsanalyse med targeting mirnas.
Profilering med TLDA avslørte 15 deregulerte mirnas i GC vev sammenlignet med normal gastrisk mucosa. Replication analyse bekreftet at Mir-148a-3p, MIR-204-5p, MIR-223-3p og MIR-375 ble konsekvent deregulert i GC vev. Analyse av GC pasientenes plasmaprøver viste signifikant nedregulering av MIR-148a-3p, MIR-375 og oppregulering av MIR-223-3p sammenlignet med friske personer. Videre, ved hjelp av bioinformatiske verktøy vi identifisert mål for replikert mirnas og utført sykdomsassosierte genet berikelse analyse. Til syvende og sist evaluert vi potensielt mål genet BCL2 Hotell og DNMT3B Vår studie viste miRNA profil i GC vev og viste at Mir-148a-3p, MIR-223-3p og MIR-375 er deregulert i GC plasmaprøver, men disse sirkulerende mirnas viste relativt svak diagnostisk ytelse som eneste biomarkører. Target genet analyse viste at BCL2 Hotell og DNMT3B Citation. Juzėnas S, Saltenienė V, Kupcinskas J, Link A , Kiudelis G, Jonaitis L, et al. (2015) Analyse av deregulert microRNAs og deres mål Gener i magekreft. PLoS ONE 10 (7): e0132327. doi: 10,1371 /journal.pone.0132327 Redaktør: Lin Zhang, University of Pennsylvania School of Medicine, USA mottatt: 22 april 2015; Godkjent: 13 juni 2015; Publisert: 14.07.2015 Copyright: © 2015 Juzėnas et al. Dette er en åpen tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres Data Tilgjengelighet: All relevant data er i avisen og dens saksdokumenter filer Finansiering:. Dette arbeidet av JK, LJ, Siju, LK, ble JS støttet av European Social Fund No. VP1-3.1-SMM-07-K-01 -156. Arbeidet med PM støttes av tyske Kunnskapsdepartementet i rammen av ERA-Net PathoGenoMics. Gi No: BMBF-0315905D. Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer Innledning oppdagelsen av microRNAs (miRNAs) og etablering av sin rolle i molekylære stier har brakt et stort fremskritt i molekylærbiologi [1] [2]. Disse små ikke-kodende RNA består av ~ 22bp er involvert i post-transcriptional regulering av genekspresjon. Mirnas er preget av høy stabilitet i biologiske prøver å lage disse molekylene et attraktivt mål i biomarkør forskningsfelt [3] [4]. Samle bevis viser at mirnas er involvert i store karsinogenisitetsstudier trasé [5]. Tidligere studier har vist at deregulering av miRNAs skjer praktisk talt i alle store typer kreft [5] [6]. Videre mirnas har vist seg å ha en diagnostisk eller prognostisk rolle og selv potensielle kliniske implikasjoner for målrettet genterapi hos kreftpasienter [7] [8]. Forekomsten av magekreft (GC) i vestlige land har falt de siste tiårene; Men denne typen kreft fortsatt står for nesten en million av nye sykdomstilfeller over hele verden og har en svært høy dødelighet [9]. Nyere forskning på GC har avdekket mange nye innsikt i patogenesen av malignitet. Likevel, de eksakte mekanismene for malign transformasjon fra Helicobacter pylori product: ( H Det avgjørende rolle miRNAs i GC har blitt vist i forskjellige studier [12]. Volinia et al. har gitt en av de første miRNA uttrykk profiler i GC vev som viser en bestemt deregulering mønster [13]. Videre studier har også rapportert betydelig deregulering av miRNAs tilhører MIR-17, MIR-21, MIR-223, MIR-135 og mange andre familier. Blant rapporterte studier i GC vev, MIR-21, MIR-25, MIR-92, MIR-223 var de mest konsekvent oppregulert mirnas, mens MIR-375 og MIR-148 var den mest konsekvent nedregulert [14] [ ,,,0],15] [16]. De fleste av disse studiene har sett på miRNA profil hos pasienter med GC og paret ved normal mageslimhinnen [14]. Viktige studier har vist at mirnas allerede deregulert i tidlige stadier av magekreft inkludert H Målet vårt denne studien var å fastslå miRNA profil i GC vev og sammenligne den med normal sunn mageslimhinnen ved hjelp av bred dekning miRNA TaqMan lav tetthet arrays. I videre analyse, rettet vi å validere profilering resultater i vev og plasma av en større gruppe av GC pasienter og friske kontroller av europeisk avstamning. Til syvende og sist, vi evaluert mulige målgener av bekreftede forskjellig uttrykt miRNA og utført sykdom-foreningen genet berikelse analyse av sine målgener. Etikk uttalelse studien ble godkjent av Kaunas Regional Biomedisinsk forskningsetiske komité (protokoll BE-2-10). Alle pasienter inngikk et informert samtykkeskjema til å delta i studien. Vevsprøver ble prospektivt samlet mellom 2011 og 2014 i Institutt for gastroenterologi og kirurgi, Hospital of Lithuanian University of Health Sciences (Kaunas, Litauen). Studien inkluderte totalt 51 kontrollpersoner og 51 GC pasienter, som ble delt inn i profilering (GC, n = 13, kontroller, n = 12) og validerings kohorter (GC, n = 38, kontroller, n = 39). Alle fag var av europeisk avstamning. Gastric biopsiprøver ble innhentet fra antrum del av magen fra kontrollpersoner som var henvist for øvre GI endoskopi på grunn av dyspeptiske symptomer og hadde ingen tidligere historie av kreft. GC vevsprøver ble oppnådd fra kirurgiske prøver umiddelbart etter reseksjon fra pasienter som gjennomgår primær kirurgi for GC uten preoperativ bestråling og kjemoterapi. Gastric adenokarsinom i GC pasienter ble verifisert med histologi og klassifisert i henhold til Lauren til diffuse og tarm typer [22]. H Tissue prøveopparbeidelse og RNA ekstraksjon Gastric vevsprøver ble lagret i RNAlater (Ambion, Austin , TX, USA) ved + 4 ° C og 24 timer senere lagret ved -80 ° C. 30 mg vev ble homogenisert i steril tilstand før total RNA isolering med Mirvana miRNA Isolation Kit (Ambion, Austin, TX, USA) for å profilere studiet og miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) for valideringsstudie, i henhold til produsentens instruksjoner. Kvaliteten på RNA ble vurdert ved hjelp av Nanodrop 2000 spektrofotometer (Thermo Scientific, USA). Kvalitativ undersøkelse av RNA integritet ble utført ved elektroforese på agarosegel (5%). Plasmaprøver ble samlet inn fra helse pasienter og pasienter med GC. Den miRNA uttrykket i plasma kohorten besto av plasmaprøver fra 38 mage kreftpasienter og 39 friske frivillige. Venøst blod ble oppsamlet i EDTA vakuumrør antikoagulerende og ble sentrifugert ved 3500 rpm i 15 minutter ved romtemperatur; separerte plasma ble overført til 1,5 ml rør og plassert i en -80 ° C fryser for kortvarig lagring. Små RNA ble ekstrahert fra 200 mL plasma ved hjelp av miRNeasy serum /plasma Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. miRNA profilering ble utført med TaqMan Array menneskelige miRNA kort Et v2.1 som Script for å kunne kvantifisere 377 menneskelige mirnas katalogisert i miRBase v20 [23]. Kort, 350 ng av total RNA ble opprinnelig revers transkribert ved hjelp av Megaplex RT satt basseng, versjon 2.1 (Applied Biosystems, Carlsbad, California, USA) og 800 mL av cDNA produktet ble deretter lastet på TaqMan Array Menneskelig Mirna kort og kjøre på VHA 7 real-Time PCR System (Applied Biosystems). Primær analyse ble gjort ved hjelp VIIa 7 programvare (Applied Biosystems) for å komme til uttrykk i form av Ct. Dataanalyse ble utført ved hjelp Bioconductor HTqPCR pakke [24]. Mirnas med en Ct-verdien > 37 ble vurdert unamplified. Mirnas som ikke var forsterket i mer enn 25% av prøvene ble ansett for å være beskjeden uttrykt og derfor utelukket fra videre analyse. MiRNA uttrykket data ble normalisert ved hjelp av rang invariant normalisering. NormFinder og geNorm algoritmer ble brukt til å identifisere en referanse gen fra TLDA data for valideringsstudie [25]. I henhold til algoritmer MIR-127-3p viste laveste Ct varians og ble valgt som en referanse gen for validerings studien. Nyere studier viser at uttrykket nivåer av RNU6A og noen andre små nukleære RNA kan være ustabil i visse vev og betingelser og kan ikke tjene som beste referanse gener [26] [27] [28] [29]. En fersk publikasjon har også identifisert MIR-127-3p som en god kandidat for referanse genet utvalg [30]. Revers transkripsjon (RT ) reaksjoner som ble utført med TaqMan Mirna Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, California, USA) og miRNA-spesifikke RT stilk-løkke primere (Applied Biosystems, Carlsbad, California, USA). Singleplex reaksjonene ble utført i et volum på 7,5 mL. Hver reaksjon omfattet 2,08 mL nukleasefritt gratis vann, 0,74 mL 10 × RT buffer, 0,08 mL dNTP (100 mm), 1,5 mL 5 × miRNA-spesifikke RT-primere, 0,1 mL RNase hemmer, 0,5 mL Multiscribe revers transkriptase og en fast volum av miRNA mal (2,5 mL). RT ble utført i en termosykler under følgende betingelser: 16 ° C i 30 min, 42 ° C i 45 minutter og 85 ° C i 5 minutter, etterfulgt av et hold ved 4 ° C TaqMan ekte. -time PCR reaksjoner ble utført i duplikat reaksjoner som omfatter 6,25 mL TaqMan 2 × Universal PCR Master mix med Ingen AmpErase UNG (Applied Biosystems, Carlsbad, California, USA) 0,625 mL 20 × miRNA-spesifikke primer og sonde blanding av TaqMan miRNA Assay Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, California, USA), 3 ul av revers transkripsjon produkt og 2,625 mL nuklease fritt vann. RT-PCR ble utført ved anvendelse av en 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Carlsbad, California, USA) under de følgende betingelser: 95 ° C i 10 min, deretter 40 sykluser med 95 ° C i 15 s, 60 ° C i 60 sekunder, etterfulgt av et hold ved 4 ° C. Hver prøve ble kjørt i duplikat. Dataene ble analysert med automatiske innstillinger for å tildele grunnlinjen, og gjennomsnittlig Ct og SD-verdier ble beregnet. Ekspresjonsnivået av miRNA i vevet ble normalisert til MIR-127-3p og uttrykket nivå i plasma var normalisert til HSA-MIR-16-5p. Resultatene ble beregnet ved anvendelse av ΔΔCT metoden [31]. Dataene ble analysert med automatiske innstillinger for å tildele grunnlinjen, og gjennomsnittlig Ct og SD-verdier ble beregnet. cDNA for BCL2 Hotell og DNMT3B lister over validerte målgener av søker mirnas ble innhentet fra miRTarbase v4.5 (mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw) og miRecords v4.0 (mirecords.biolead.org) databaser. Gene-sykdom foreningen data ble hentet fra DisGeNET database (http://www.disgenet.org/). For å identifisere GC-assosierte gener, betyr uttrykket "gastrisk adenokarsinom" (umls: C0278701) ble anvendt som spørringen for databasen. Biologiske nettverk ble opprettet ved hjelp av Cytoscape v3.2 åpen kildekode med CyTargetLinker søknad [32]. De kliniske kjennetegn blant gruppene ble sammenlignet med χ miRNA uttrykk profilering av GC og sunn mageslimhinnen vev av TLDA TaqMan Menneskelig miRNA Low-Density Array analyse ble utført for å identifisere kandidat mirnas stiller endret uttrykk i magekreft vev. Tissue miRNA profiler fra GC pasienter ble sammenlignet med profiler av mageslimhinnen fra friske individer. Etter filtrering for lave rikelig mirnas (Ct verdi > 37 og ikke-detekterbare i over 25% av prøvene), et sett av 193 mirnas (fra total 377) forble for videre analyse. En sammenligning av kreft versus normalt vev identifisert 15 forskjellig uttrykt mirnas, syv av dem ble oppregulert og åtte ble nedregulert med FDR justert p-verdi < 0,01 og fold change > 2 (tabell 2). Resultatene er vist i vulkanen tomten (figur 1). Blant disse, 6 mirnas (MIR-135a-5p, MIR-148a-3p, MIR-204-5p, MIR-375, MIR-223-3p og MIR-155-5p), som viser den høyeste betydning og brett endre verdier, ble valgt for validerings studien. Hierarkisk clustering henhold euklidsk avstand fra utvalgte miRNA normaliserte uttrykk data viste to undergrupper: en svarende til kontrollgruppen og den andre svarende hovedsakelig til pasientgruppen. (Fig 2). De seks kandidat mirnas valgt for verifisering ble kvantifisert ved hjelp QRT-PCR. For referanse genet utvalg av TLDA data ble analysert ved hjelp av to forskjellige algoritmer (NormFinder og geNorm) for å identifisere referanse gener. MiR-127-3p viste høyeste uttrykk stabilitet på tvers av alle prøvene i TLDA data og på grunn av denne funksjonen MIR-127-3p ble valgt som referanse genet for å normalisere qPCR data. Uttrykket nivåer av MIR-148a-3p, MIR-204-5p, MIR-223-3p og MIR-375 viste signifikant uttrykket i samme retning som i funn studien (FDR justert p < 0,05), mens ingen signifikant ble påvist forskjeller i uttrykket nivåer av MIR-135a-5p og MIR-155-5p (FDR justert p > 0,05; fig 3) Plasma mirnas som potensielle biomarkører for magekreft Target genet prediksjon For ytterligere å undersøke mulige mål av MIR-148a-3p, MIR-204-5p, MIR-223- 3p og MIR-375, alle sine eksperimentelt validerte miRNA-målet interaksjoner ble hentet fra to forskjellige databaser (miRTarbase og miRecords). Dataene ble visualisert i Cytoscape som et biologisk nettverk som inneholder alle de nevnte mirnas og deres mål-interaksjoner (fig 5). Hver samhandling i nettverk besto av to noder, en regulatorisk miRNA node (rød) og et mål mRNA node (rosa) forbundet gjennom en rettet kant. Samlet, nettverket inkludert 593 validerte mål, 419 av dem er tildelt MIR-375, 88 tildelt MIR-204-5p, 83 tildelt MIR-148a-3p og 21 tildelt MIR-223-3p. Nettverket Analysen avdekket at Mir-148a-3p og MIR-375 hadde seks felles mål (MPP5, DNMT3B, PAPD4, RASSF8, PBXIP1 og RAB10), MIR-204-5p og MIR-375 hadde også seks felles mål (SERP1, CTSC , EFNB2, HSP90AA1, TCF12 og IL1RAP), MIR-148a-3p og MIR-204-5p hadde to felles mål (AURKB og CDC25B), MIR-223-3p og MIR-148a-3p hadde også to felles mål (HSP90B1 og IRS1), MIR-223-3p og MIR-375 hadde en felles mål (PARP1) og Mir-148a-3p, MIR-204-5p og MIR-375 hadde også en felles mål (BCL2). Målgener som ble regulert samtidig av to eller tre mirnas er representert i oransje og grønne farger, henholdsvis (fig 5). For å finne ut om sykdommen -associated gener ble betydelig beriket i vår sett miRNA mål, ble berikelse analyse utført. Først ble genet listen hentes fra DisGeNet database. Som spørring for databasen vi brukte begrepet "adenokarsinom i ventrikkel" (umls: C0149826). Etter å filtrere ut miRNA, lncRNA og gener som ikke var i miRTarbase og miRecords, ble 115 gener identifisert til å være assosiert med GC. I nettverket analyse 20 av GC-forbundet gener ble overlappet, 4 (BCL10, YAP1, IGFBP3 og JAG1) av dem tildelt MIR-375, 6 (IL8, MMP9, IL1B, CDX2, SERPINE1 og SPARC) tildelt MIR-204 -5p, 4 (CDKN1B, APC, NR1I2 og CCKBR) tildelt MIR-148a-3p og 2 (STMN1 og IGF1R) tildelt MIR-223-3p. Målgener som ble assosiert med GC er representert i blått (figur 5). Til slutt ble sykdomsassosierte genet berikelse analyse utført ved hjelp av en hypergeometrisk fordeling basert test som førte til å vurdere om antall GC-assosiert gener er større enn forventet i settet av målgener av utvalgte miRNAs. Berikelse analyse avdekket at GC-forbundet gener var betydelig overrepresentert (p < 0,05) i MIR-148a-3p, MIR-204-5p og MIR-223-3p, mens ingen signifikant berikelse ble observert i Mir-375 mål gener (p > 0,05) (Tabell 3) BCL2 Hotell og DNMT3B Diskusjoner Endrede miRNA uttrykk profiler har. Det er rapportert i GC vev og blodprøver [13] [20] [14] [38]. Noen av disse deregulerte miRNAs har vært knyttet til overlevelse, metastatisk oppførsel av svulsten og andre clinicopathological funksjoner av GC [39] [40]. Videre mirnas er blitt vist å regulere tumorvekst ved å påvirke proliferasjon, adhesjon, invasjon og migrasjon i GC-cellelinjer [41]. Enda viktigere er målgener av deregulerte mirnas i GC involvert i apoptose, cellesyklus og andre viktige karsinogenisitetsstudier trasé [12]. Derfor kan undersøkelse av miRNAs og deres potensielle målgener i GC tjener for videre utvikling av viktige diagnostiske og behandlingsalternativer. Det er tydelig at mirnas er viktige aktører i magekreftutvikling, men vi mangler fortsatt presise data om mekanismene og potensielle kliniske anvendelser av disse molekylene i GC. Vår studien forsøkte å bestemme profilen til deregulerte miRNAs i GC vev, vurdere dem i plasmaprøver og for å vurdere potensielle målgener av deregulerte miRNAs. Ved hjelp av TaqMan miRNA TLDA kort, som omfatter 377 mirnas primere, fant vi 15 forskjellig uttrykt mirnas mellom kreft GC og sunn mage vev. Åtte mirnas ble nedregulert (la-7a-5p, la-7g-5p, MIR-26b-5 p, MIR-30b-5 p, MIR-135a-5p, MIR-148a-3p, MIR-204-5p, MIR -375), mens sju mirnas var oppregulert (MIR-146b-5p, MIR-155-5p, MIR-214-3p, MIR-223-3p, MIR-224-5p, MIR-331-3p og speil 484). Våre profilering resultatene ikke avsløre noen av de oftest deregulerte mirnas, som tidligere har blitt rapportert å bli deregulert i andre studier, blant annet MIR-21-5p, MIR-25-3p, MIR-92a-3p, MIR-29C-3p, og noen andre [15] [19] [14]. En av de mulige forklaringer på disse mangler mirnas kan ha sammenheng med svært strenge statistiske kriterier som ble brukt for TLDA analyse av våre data (FDR justert p-verdi < 0,01 og fold change > 2). Videre kan en viss grad av avvik i miRNA profilering resultater blant studiene skyldes forskjeller i anatomisk plassering av magen, histologisk subtype, statistisk analyse og spesielt profileringsmetoder [18]. En studie av MESTDAGH et al. viser at ulike plattformer av miRNA profilering har ulike deteksjon priser, spesifisitet og reproduserbarhet, og at den mest hensiktsmessige plattformen bør velges på grunnlag av den eksperimentelle innstillingen og de konkrete forskningsspørsmål (MESTDAGH et al., 2014). i den andre fasen av vår studie brukte vi QRT-PCR i replikering kohort inkludert seks mest deregulerte mirnas fra profileringen fase (MIR-135a-5p, MIR-148a-3p, MIR-155-5p, MIR-204-5p , MIR-223-3p og MIR-375). Vi viste at Mir-148a-3p, MIR-204-5p, MIR-223-3p og MIR-375 ble konsekvent deregulert mellom normale og kreft GC vev. Resultatene av vår replikering kohort støttes av tidligere rapporter. Flere studier har vist at MIR-148a-3p var signifikant nedregulert i GC-cellelinjer og vevsprøver i forhold til de tilstøtende normalt vev [42] [43]. Lave nivåer av MIR-375 ble også rapportert av studier, hypoteser som MIR-375 ble forbundet med magekreftutvikling [44] [16]. Vi identifiserte at Mir-223-3p var signifikant oppregulert i GC vev sammenlignet med normalt vev, som foreslått av flere tidligere rapporter [15] [19]. MiR-204-5p har blitt sjeldnere rapportert i GC miRNA profilering studier; Likevel, våre resultater er i tråd med en tidligere studie som viste betydelig nedregulering av denne miRNA i GC vev og GC cellelinjer [45]. MiR-135a-5p uttrykk var lavere i GC vev enn i kontrollpersoner; men var observert nedregule trend som ligner på tidligere rapporter [15] og kan ha nådd nødvendig betydning med et høyere antall individer i gruppene. Det er verdt å påpeke at vi ikke fant forskjeller for Mir-155-5p i vår replikering kohort sammenligne kontrollpersoner og GC pasienter. Mest sannsynlig dette funnet er knyttet til det faktum at i den innledende profilering årsklasse, kontrollpersoner var H For å undersøke den potensielle rolle forskjellig uttrykt mirnas som biomarkører i GC, analyserte vi deregulert mirnas i plasmaprøver. Sirkulasjons mirnas, spesielt kombinasjonen av flere miRNAs, kan presentere som lovende biomarkører for diagnostisering av gastrointestinale kreft [21]. En studie av Zhu et al. vist at et panel på fem mirnas kan tjene som en potensiell biomarkør ved påvisning av tidlig stadium GC [47]. Hittil rapporterte miRNA profiler i GC serum eller plasma varierer betydelig mellom separate studier [21].
uttrykk ved QRT-PCR i GC vev, som korrelert med targeting miRNA uttrykket.
Konklusjoner
uttrykk i GC vev korrelert med deres målgruppe miRNA uttrykket
. pylori
) smitte til kronisk atrofisk gastritt, intestinal metaplasi og GC er fortsatt dårlig forstått [10 ]. Nåværende hypotesen om GC utvikling innebærer kombinerte effekten av bakteriell, vert og ernæringsmessige faktorer; Men til dags dato, tyder denne teorien svært få klinisk lyd translasjonsforskning implikasjoner [11]. De fleste av GC tilfeller diagnostiseres i sene stadier av sykdommen, som er forbundet med dårlig pasientutfall. Derfor er en av de store fokuserer i GC forskning er evaluering av potensielle molekylære biomarkører som kan brukes for tidlig non-invasiv diagnostikk av denne malignitet.
. pylori
gastritt og premaligne stadier av gastrisk atrofi og intestinal metaplasi [17] [18]. Interessant, noen av miRNAs har motsatt deregulering retninger i nærvær av GC, som separate profilering studier viser betydelig inkonsekvens mellom deregulerte mirnas [14]. MiR-9 ble funnet å være oppregulert i to studier [15] [19], mens to andre papirer viste en betydelig nedregulering av dette miRNA i GC vev [13] [20]. Disse uoverensstemmelsene vedrørende motsatte deregulerings resultater for Mir-9 og mange andre mirnas er mest sannsynlig knyttet til forskjeller i anatomisk plassering av GC, histologisk subtype, sykdom scenen, profilering plattformer, statistisk analyse og mange andre potensielle konfunderende faktorer. Dessuten, de fleste i dag publiserte studier på miRNA profil i GC vev dekker emner fra asiatiske land; i mellomtiden, data om europeiske GC pasienter er fortsatt mangelvare [21].
Materialer og metoder
Study befolkningen
. pylori
ble fastslått i GC og kontrollpersoner ved hjelp av indirekte ELISA for å påvise serum-IgG spesifikt antigen (Virion /Serion GmbH, Wünrzburg, Tyskland). Kliniske og patologisk karakteristikk av pasientkullene som alder, kjønn og stadium av sykdommen er oppsummert i Tabell 1.
Plasma prøveopparbeidelse og RNA ekstraksjon
Mirna profilering med TaqMan Low-Density Array
Kvantitativ revers transkripsjon polymerase kjedereaksjoner (QRT-PCR)
genekspresjonsanalyser ble syntetisert fra 500 ng av RNA ved hjelp av en High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, California, USA). Singleplex reaksjonene ble utført i et volum på 7,5 mL. Hver reaksjon omfattet 2,1 mL nukleasefritt gratis vann, 1 mL 10 × RT buffer, 0,4 mL dNTP (100 mm), 1 mL 10 × RT Tilfeldige primere, 0,5 mL Multiscribe revers transkriptase og en fast volum av miRNA mal (2,5 mL). RT-PCR ble utført i et termo under følgende betingelser: 25 ° C i 10 min, 37 ° C i 120 min og 85 ° C i 5 minutter, etterfulgt av et hold ved 4 ° C. Før qPCR cDNA prøvene ble fortynnet 1: 1 med nuklease fritt vann og 2 pl brukt i 10,5 mL RT-qPCR reaksjoner sammen med 6,25 mL 2x TaqMan Fast Universal Master mix (Life Technologies, Carlsbad, California, USA), 0,625 ul 20x TaqMan Gene Expression analyse (Life Technologies, Carlsbad, California, USA) og 3,625 mL sterilt vann. RT-qPCR analysene ble kjørt i triplikat på en 7900HT Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Carlsbad, California, USA) under de følgende betingelser: 95 ° C i 10 min, deretter 40 sykluser med 95 ° C i 15 s, 60 ° C i 60 sekunder, etterfulgt av et hold ved 4 ° C. Uttrykket nivåer av BCL2 Hotell og DNMT3B
i vevet var normalisert til ACTB
.
Target genet nettverksanalyse
Statistisk analyse
2 test og Fishers eksakte test for kvalitative data, og t-test for kvantitative data. Den TLDA data ble analysert ved hjelp av t-test og Benjamini Hochberg korreksjon for falsk funnrate, slik at dette uttrykket ble ansett å være av betydning med en p < 0,01. Dataene ble normalisert ved hjelp av rang invariant normalisering [33] og analysert ved hjelp av HTqPCR pakken. Validerings og plasma qPCR uttrykk data ble analysert ved hjelp av parametriske Mann-Whitney U-test. En Benjamini Hochberg justert p < 0,05 ble ansett for å være statistisk signifikant. For QRT-PCR data, de relative uttrykk nivåer av hvert mål miRNA (log2 relative nivå) ble beregnet i henhold til forskjellen i CT verdier mellom målet mirnas og MIR-127-3p i vevsprøver og MIR-16-5p i plasmaprøver (ΔCT) [34]. Hyperometrisk test ble anvendt for GC-assosiert target berikelse analyse. En mottaker som opererer karakteristikk (ROC) kurve ble generert for hvert miRNA ved hjelp ΔCT data. Arealet under kurven (AUC) verdier og 95% konfidensintervaller (CI) ble beregnet for å bestemme spesifisitet og sensitivitet. Å analysere diagnostisk verdi av kombinerte endringer i plasma miRNA nivåer ble univariate genuttrykk gjennomsnittlig algoritmen som brukes [35]. ROC-kurver ble generert ved hjelp ROCR pakke [36]. Alle data analyser ble utført ved hjelp av R-versjon 3.1.1-programvaren.
Resultater
Mirna validering i GC og sunn mageslimhinnen vev med QRT-PCR
Sykdom-forbundet genet berikelse analyse
over-uttrykk og invers korrelasjon med targeting mirnas i mage kreft vev
som en antatt mål for Mir-148a-3p, MIR-204-5p og MIR-375 og DNMT3B
for MIR-148a-3p og MIR-375. Alle disse miRNAs i vår studie ble funnet å være nedregulert i magekreft vev. For å støtte videre disse resultatene, først uttrykket analyse av BCL2 Hotell og DNMT3B
gener ble utført. Dataene i QRT-PCR viste signifikant økning i uttrykk nivåer av både BCL2 Hotell og DNMT3B
gener i magekreft vev. BCL2
viste en 2,7 ganger økning, mens DNMT3B
hadde en 16,7-ganger økning i mRNA nivåer (fig 6). Pearsons korrelasjonsanalyse ble utført for å avsløre forholdet mellom BCL2 Hotell og DNMT3B
mRNA og deres målgruppe miRNA nivåer i normale og kreft mage vev (fig 6). Det ble observert en invers korrelasjon for begge spådd DNMT3B
for målretting mirnas: Mir-375 (r = -0,49, p = 0,00001) og Mir-148a-3p (r = -0,26, p = 0,0328) . En negativ korrelasjon ble observert mellom BCL2 Hotell og Mir-375 (r = -0,32, p = 0,0116), mens ingen sammenheng ble funnet mellom BCL2 Hotell og MIR-148a-3p (r = -0,06; p = 0,6631) eller BCL2 Hotell og MIR-204-5p (r = -0,02, p = 0,8546)
. pylori
gratis, mens i replikering sett noen av kontrollpersonene hadde positiv serologi for denne bakterien. Det er velkjent at Mir-155-5p er involvert i betennelses trasé inkludert H
. pylori
gastritt [46]; Derfor kan dette gi en viss skjevhet i resultatene. Våre resultater er i tråd med tidligere studie av Link et al. (2015), hvor forskjellen i uttrykket av MIR-155 i biopsier fra GC sammenlignet med kontrollene ikke nådde statistisk signifikans [18]. I replikering fasen av vår miRNA profilering studie valgte vi bare seks mirnas, som viste den høyeste biologiske relevans og statistisk signifikans. Vi er enige om at det ville være verdt å se på alle betydelig deregulerte mirnas og som kan være en potensiell oppgave i videre studier.
Pasienter på immunterapier bør konsumere mer fiber,
Migrasjon påvirker tarmmikrobiota som igjen påvirker helsefunnforskere
Munnhygiene og alvorlighetsgraden av COVID-19-forbindelsen
Penis mikrobiom er reservoar for bakteriell vaginose-assosierte bakterier
Forskere gjør blod av type A til universell type O,
Flått som nå bærer flere sykdommer,
Forskere utvikler en tilnærming for å vaksinere mot tarmbetennelse
Inflammatorisk tarmsykdom (IBD) er et paraplybegrep som beskriver mange lidelser som involverer kronisk betennelse i fordøyelseskanalen, inkludert ulcerøs kolitt og Crohns sykdom. Disse forholdene er
Edderkoppespeptid kan hjelpe til med å stoppe smerter ved irritabel tarm
Forskere fra University of Queensland har funnet ut at et spesifikt peptid som finnes i edderkoppgift kan ha egenskaper som kan gjøre det nyttig for å lindre smerter hos pasienter med irritabel tarm.
Barn er immunforberedt på SARS-CoV-2
Minst 30 nye sykdommer har dukket opp de siste 20 årene og truer nå sammen hundrevis av millioner menneskers helse. For mange av disse sykdommene, det er ingen behandling, kurere, eller vaksine. Selv