Фон
<р> MicroRNAs (микроРНК) широко изучены некодирующие РНК, которые модулируют экспрессию генов. МикроРНК дерегулирование в различных опухолей, включая рак желудка (GC) и имеют потенциальные диагностические и прогностические последствия. Цель нашего исследования состояла в том, чтобы определить профиль микроРНК в тканях GC, с последующей оценкой нерегулируемых микроРНК в плазме больных ГХ. Использование доступных баз данных и биоинформатики методы, которые мы также направлены для оценки потенциальных генов-мишеней подтвержденного дифференциально выраженной микроРНК и подтвердить эти результаты в GC тканях.
Введение Заявление по этике Подготовка ткани образца и РНК экстракции образец плазмы и РНК экстракция выражение микроРНК профилирование GC и здоровой ткани слизистой оболочки желудка с помощью TLDA TaqMan Человека микроРНК низкой плотности анализ массива был проведен для выявления возможных микроРНК, проявляющие измененную экспрессию в желудочной ткани рака. Тканевые микроРНК профили из пациентов GC сравнивали с профилями слизистой оболочки желудка у здоровых лиц. После фильтрации для низких обильные микроРНК (значение Ct &GТ; 37 и не обнаруживаемых в более чем 25% проб), набор из 193 микроРНК (от общего 377) остается для дальнейшего анализа. Сравнение злокачественными по сравнению с нормальной тканью определили 15 дифференцированно выраженных микроРНК, 7 из которых были повышающей регуляции и 8 были вниз регулируется с ПБУ скорректированного значения р &ЛТ; 0,01 и сгиб изменения &GТ; 2 (таблица 2). Результаты продемонстрированы на участке вулкана (рис 1). Среди них 6 микроРНК (микроРНК-135а-5P, микроРНК-148а-3p, микроРНК-204-5p, микроРНК-375, микроРНК-223-3p и микроРНК-155-5p), показав самую высокую значимость и сложите изменения значений, были отобраны для исследования валидации. Иерархическая кластеризация под евклидовым расстоянием выбранных данных нормализованы экспрессии микроРНК показали две подгруппы: одна соответствует контрольной группе, а второй, соответствующие главным образом к группе пациентов. (Рис 2). шесть кандидатов микроРНК, отобранных для проверки были определены количественно с использованием QRT-PCR. Для выбора опорного гена данные TLDA анализировали с использованием двух различных алгоритмов (NormFinder и geNorm) для определения опорных генов. MIR-127-3p показал самую высокую стабильность экспрессии через все образцы в данных TLDA и из-за этой особенности MIR-127-3p был выбран в качестве контрольного гена для нормализации данных КПЦР. Уровни экспрессии микроРНК-148а-3p, MIR-204-5p, MIR-223-3p и микроРНК-375 показали значительное дифференциальное выражение в том же направлении, как и в исследовании обнаружения (FDR, скорректированной р ≪ 0,05), в то время как не оказывает существенного различия были обнаружены в уровнях экспрессии микроРНК-135а-5p и MIR-155-5p (FDR скорректирована р &GТ; 0,05; рис 3) Плазма микроРНК в качестве потенциальных биомаркеров для рака желудка Задача прогнозирования гена BCL2 Обсуждение
<р> обнаружение микроРНК (миРНК) и установление их роли в молекулярных путей принес огромный прогресс в области молекулярной биологии [1] [2]. Эти малые некодирующие РНК, состоящие из ~ 22BP участвуют в пост-транскрипционной регуляции экспрессии генов. МикроРНК характеризуются высокой стабильностью в биологических образцах, делающих эти молекулы привлекательной мишенью в биомаркером области исследований [3] [4]. Накопленные данные показывают, что микроРНК участвуют в основных путей канцерогенеза [5]. Предыдущие исследования показали, что дерегулирование микроРНК происходит практически во всех основных типах рака [5] [6]. Кроме того, микроРНК было показано, что диагностическое или прогностическое роль и даже потенциальные клинические последствия для целевой генной терапии у онкологических больных [7] [8].
<Р> Заболеваемость раком желудка (GC) в западных странах имеет сократилась за последние десятилетия; Тем не менее, этот тип рака по-прежнему составляет около одного миллиона новых случаев заболевания во всем мире и таит в себе очень высокий уровень смертности [9]. Недавние исследования на GC показал много новых идей в патогенезе этой злокачественной опухоли. Тем не менее, точные механизмы злокачественной трансформации от хеликобактерной
( H
. пилори
) инфекции хронический атрофический гастрит, кишечная метаплазия и GC-прежнему плохо понимают [10 ]. Текущая гипотеза развития GC включает объединенное влияние бактериальных, хозяина и факторов питания; Тем не менее, на сегодняшний день, эта теория предполагает очень мало клинически обоснованных поступательные последствий [11]. Большинство случаев GC диагностируется на поздних стадиях заболевания, что связано с неблагоприятными результатами для пациентов. Таким образом, одним из основных направлений в исследовании GC является оценка потенциальных молекулярных биомаркеров, которые могут быть использованы для ранней неинвазивной диагностики этой злокачественной опухоли.
<Р> Решающая роль микроРНК в GC было показано в различных исследованиях [12]. Volinia и др. обеспечили один из первых профилей экспрессии микроРНК в GC ткани, показывающие специфическую картину дерегулирования [13]. Дальнейшие исследования также сообщили о значительном дерегулирование микроРНК, принадлежащих к MIR-17, микроРНК-21, микроРНК-223, микроРНК-135 и многие другие семьи. Среди опубликованных исследований в GC тканях, MIR-21, MIR-25, MIR-92, MIR-223 были наиболее последовательно повышающей регуляции микроРНК, в то время как микроРНК-375 и микроРНК-148 были наиболее последовательно вниз регулируется [14] [ ,,,0],15] [16]. Большинство из этих исследований посмотрел на профиль микроРНК у больных с ГК и спаренного с нормальной слизистой оболочки желудка [14]. Важные исследования показали, что микроРНК уже дерегулированы на ранних стадиях рака желудка, включая H
. пилори
гастрит и предраковые этапы желудочной атрофии и кишечной метаплазии [17] [18]. Интересно отметить, что некоторые из микроРНК имеют противоположные направления дерегулирования в присутствии GC, как отдельные исследования свидетельствуют о значительном профилирование несоответствие между нерегулируемых микроРНК [14]. Было установлено, что до регулируемой в двух исследованиях [15] [19] MIR-9, в то время как две другие работы показали значительное понижающее регулирование этого микроРНК в тканях GC [13] [20]. Эти расхождения относительно противоположные результаты дерегулирования для MIR-9 и многие другие микроРНК, скорее всего, связаны с различиями в анатомической локализации ГХ, гистологического подтипа, стадии заболевания, профилирование платформ, статистического анализа и многих других возможных факторов. Кроме того, в настоящее время большинство опубликованных исследований по профилю микроРНК в тканях GC охватывают предметы из азиатских стран; В то же время, данные о пациентах европейских GC по-прежнему мало [21].
<р> Целью нашего исследования было определить профиль микроРНК в тканях GC и сравнить его с нормальной здоровой слизистой оболочки желудка с использованием широкого охвата микроРНК TaqMan низкой плотности массивы. В дальнейшем анализе мы стремились подтвердить наши результаты профилирования в тканях и плазме большой группы пациентов GC и здоровых людей европейского происхождения. В конечном счете, мы оценивали потенциальные гены-мишени подтвержденного дифференциально экспрессируются микроРНК и проводили заболевания ассоциации анализ генов по обогащению их генов-мишеней.
Материалы и методы
<р> исследование было одобрено Комитетом Каунасского регионального биомедицинских исследований по этике (Протокол № ВЕ-2-10). Все пациенты подписали форму информированного согласия на участие в исследовании.
Исследуемая популяция
<р> Тканевые образцы были собраны перспективно в период между 2011 и 2014 годами в отделениях гастроэнтерологии и хирургии больницы Литовского университета медицинских наук (Каунас, Литва). В исследование было включено в общей сложности 51 контрольных субъектов и 51 пациентов GC, которые были разделены на профилирование (GC, N = 13; контроль, п = 12) и когорты проверки (GC, N = 38; контроль, п = 39). Все предметы были европейского происхождения. Желудочные биоптаты были получены из антрального отдела желудка от контрольных субъектов, которые были переданы для эзофагоскопии из-за симптомов диспепсии и не имели в анамнезе злокачественных новообразований. Образцы GC ткани получали из хирургических образцов сразу после резекции у пациентов, перенесших операцию по поводу первичной ГХ с не предоперационного облучения и химиотерапии. Аденокарциномы желудка у больных GC была подтверждена гистологии и классифицированы в соответствии с Lauren в размытые и кишечных типов [22]. H
. пилори
статус оценивался в GC и группой контроля с помощью непр мого ИФА для определения в сыворотке специфических IgG-антиген (Вирион /SERION GmbH, Wünrzburg, Германия). Клинические и патологические характеристики когорт пациентов, включая возраст, пол и стадии заболевания приведены в таблице 1.
<р> Образцы желудочные ткани хранились в RNAlater (Ambion, Остин , штат Техас, США) при + 4 ° С, и через 24 часа хранили при -80 ° С. 30 мг ткани гомогенизировали в стерильном состоянии до полной изоляции РНК с изоляцией Kit Mirvana микроРНК (Амбион, Остин, штат Техас, США) для профилирования исследования и miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) для проверочного исследования, в соответствии с инструкция производителей. Качество РНК оценивали с использованием NanoDrop 2000 спектрофотометра (Thermo Scientific, США). Качественное исследование целостности РНК проводили с помощью электрофореза на агарозном геле (5%).
Препарат
<р> Образцы плазмы были взяты у пациентов со здоровьем и больных с GC. Выражение микроРНК в плазме когорты состояла из образцов плазмы от 38 больных раком желудка и 39 здоровых добровольцев. Образцы венозной крови собирают в вакуумных трубках ЭДТА противосвертывающей и центрифугировали при 3500 оборотах в минуту в течение 15 мин при комнатной температуре; отделенную плазму переносили в 1,5 мл пробирки и помещают в -80 ° C морозильнике для кратковременного хранения. Малые РНК экстрагировали из 200 мкл плазмы с помощью пакета miRNeasy сыворотка /плазма (Qiagen, Valencia, CA, USA) в соответствии с инструкциями изготовителя.
микроРНК профилирования с использованием TaqMan низкой плотности массива
<р> микроРНК профилирование была выполнена с TaqMan массива Human микроРНК карты А v2.1, что позволило дать количественную оценку 377 человека микроРНК каталогизированы в miRBase v20 [23]. Вкратце, 350 нг общей РНК была первоначально обратной транскрипции с использованием Megaplex RT установлен бассейн на версии 2.1 (Applied Biosystems, Карлсбад, Калифорния, США) и 800 мкл продукта кДНК затем загружали на TaqMan массив микроРНК карты человека и работать на VIIa 7 система ПЦР в реальном времени (Applied Biosystems). Первичный анализ был проведен с использованием программного обеспечения VIIa 7 (Applied Biosystems), чтобы получить выражение через Ct. Анализ данных проводился с использованием Bioconductor HTqPCR пакета [24]. МикроРНК со значением Ct > 37 были рассмотрены неусиленных. МикроРНК, которые не были амплифицированы в более чем в 25% образцов считались смирен выражены и, следовательно, исключаются из дальнейшего анализа. Выражение данные микроРНК нормализовалось с использованием ранга инвариантной нормализации. NormFinder и geNorm алгоритмы были использованы для определения эталонного гена из данных TLDA для проверочного исследования [25]. В соответствии с алгоритмами микроРНК-127-3p показал самую низкую дисперсию Ct и был выбран в качестве контрольного гена для проверочного исследования. Недавние исследования показывают, что уровни экспрессии RNU6A и некоторых других небольших ядерных РНК может быть неустойчивым в определенных тканях и условиях и не могут служить в качестве лучших эталонных генов [26] [27] [28] [29]. Одна из последних публикаций также определил микроРНК-127-3p как хороший кандидат для выбора опорного гена [30].
Количественные обратной транскрипции полимеразной цепной реакции (QRT-PCR)
<р> обратной транскрипции (RT ) реакции были проведены с использованием TaqMan микроРНК обратной транскрипции Kit (Applied Biosystems, Карлсбад, Калифорния, США) и микроРНК-специфические праймеры стволовых петли RT (Applied Biosystems, Карлсбад, Калифорния, США). Singleplex реакции проводили в объеме 7,5 мкл. Каждая реакция включала 2,08 мкл нуклеазы свободной воды, 0,74 мкл 10 × RT буфера, 0,08 мкл дНТФ (100 мМ), 1,5 мкл 5 × микроРНК-специфические праймеры RT, 0,1 ингибитор мкл РНКазы, 0,5 мкл Multiscribe обратной транскриптазы и фиксированный объем микроРНК шаблон (2,5 мкл). РТ была проведена в амплификаторе при следующих условиях: 16 ° С в течение 30 мин, 42 ° С в течение 45 мин и 85 ° С в течение 5 мин, после чего трюм при 4 ° С
<р> TaqMan, реально. -время реакции ПЦР проводили в двух реакциях, содержащих 6,25 мкл TaqMan 2 × Универсальный PCR Master Mix с Нет AmpErase Узбекнефтегазу (Applied Biosystems, Карлсбад, Калифорния, США) 0,625 мкл 20 × микроРНК-специфического праймера и зонда сочетание набора TaqMan микроРНК пробирной (Applied Biosystems, Карлсбад, Калифорния, США), 3 мкл обратной транскрипции продукта и 2.625 мкл нуклеазы свободной воды. ОТ-ПЦР проводили с использованием 7500 Fast Real-Time System PCR (Applied Biosystems, Карлсбад, Калифорния, США) при следующих условиях: 95 ° C в течение 10 мин, затем 40 циклов 95 ° С в течение 15 с, 60 ° с в течение 60 с, после чего выдержки при температуре 4 ° с. Каждый образец был запущен в двух экземплярах. Данные были проанализированы с автоматическими установками для назначения базовой линии, и были рассчитаны средние Ct и SD значения. Уровень экспрессии микроРНК в ткани была нормализована к микроРНК-127-3p и уровень экспрессии в плазме была нормализована к HSA-MIR-16-5p. Результаты были рассчитаны с использованием метода ΔΔCT [31]. Данные были проанализированы с автоматическими установками для назначения базовой линии, и были рассчитаны средние значения Ct и SD.
<Р> кДНК BCL2
и Анализ DNMT3b
экспрессии гена синтезируют из 500 нг РНК с использованием высокой емкости кДНК с обратной транскрипцией Kit (Applied Biosystems, Карлсбад, Калифорния, США). Singleplex реакции проводили в объеме 7,5 мкл. Каждая реакция включала 2,1 мкл нуклеазы свободной воды, 1 мкл 10 × RT буфера, 0,4 мкл дНТФ (100 мМ), 1 мкл 10 × RT Случайные праймеры, 0,5 мкл Multiscribe ревертазам и фиксированный объем шаблона микроРНК (2,5 мкл). ОТ-ПЦР проводили в термоциклере при следующих условиях: 25 ° С в течение 10 мин, 37 ° С в течение 120 мин и 85 ° С в течение 5 мин, после чего следует выдержкой при температуре 4 ° С. Перед тем как образцы КПЦР кДНК разводили 1: 1 с нуклеазы свободной воды и 2 мкл использовали в 10,5 мкл реакции RT-КПЦР вместе с 6,25 мкл 2x TaqMan Fast Универсальный Master Mix (Life Technologies, Карлсбад, штат Калифорния, США), 0,625 мкл 20x TaqMan Gene Expression Assay (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния, США) и 3,625 мкл стерильной воды. RT-КПЦР анализы проводились в трех экземплярах на системе 7900HT Fast Real-Time PCR (Applied Biosystems, Карлсбад, Калифорния, США) при следующих условиях: 95 ° С в течение 10 мин, затем 40 циклов 95 ° С в течение 15 с, 60 ° с в течение 60 с, после чего выдержки при температуре 4 ° с. Уровни экспрессии BCL2
и DNMT3b
в ткани была нормализована к ACTB
.
Целевой ген сетевого анализа
<р> списки проверенных генов-мишеней кандидата микроРНК были получены из miRTarbase v4.5 (mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw) и miRecords v4.0 (mirecords.biolead.org) баз данных. Данные ассоциации Gene-заболевания были извлечены из базы данных DisGeNET (http://www.disgenet.org/~~HEAD=pobj). Для идентификации ГХ-генов, ассоциированных с, термин "аденокарциномы желудка" (UMLS: C0278701) использовали в качестве запроса для базы данных. Биологические сети были созданы с использованием Cytoscape V3.2 программного обеспечения с открытым исходным кодом с приложением CyTargetLinker [32].
Статистический анализ
<р> Клинические характеристики между группами сравнивали с помощью χ
тест 2 и точный критерий Фишера для качественных данных, и т-тест для количественных данных. Данные TLDA анализировали с использованием Т-теста и коррекции Benjamini Höchberg для ложных обнаружения таким образом, что дифференциальное выражение было сочтено значимым с р &ЛТ; 0.01. Данные нормализовали с использованием ранга инвариантной нормализации [33] и анализировали с помощью пакета HTqPCR. Выражение данных КПЦР проверки и плазму анализировали с помощью непараметрического Mann-Whitney U-тест. Benjamini Хехберга скорректированный р &л; 0,05 считали статистически значимым. Для данных QRT-PCR, относительные уровни экспрессии каждой мишени микроРНК (Log2 относительный уровень) были рассчитаны в соответствии с разницей в значениях КТ между целевыми микроРНК и микроРНК-127-3p в образцах тканей и MIR-16-5p в образцах плазмы (Δ CТ) [34]. Гипергеометрическое тест использовали для анализа целевого обогащения GC-ассоциированной. Приемник работает характеристической кривой (ROC) была сгенерирована для каждого микроРНК с использованием данных Δ CТ. Площадь под кривой значения (AUC) и 95% доверительный интервал (ДИ) были рассчитаны для определения специфичности и чувствительности. Проанализировать диагностическую ценность комбинированных изменений в плазме уровней микроРНК, использовался средний алгоритм однофакторного экспрессии гена [35]. Кривые ROC были получены с использованием ROCR пакета [36]. Все данные исследования были выполнены с использованием R версии 3.1.1 программного обеспечения.
Результаты
микроРНК проверки в GC и здоровой ткани слизистой оболочки желудка с QRT-PCR
<р.> в GC ткани одобренного MIR-148a-3p, микроРНК-204-5p, микроРНК-223-3p и микроРНК-375 были отобраны для дальнейшего анализа в образцах плазмы. Относительные уровни кандидата мРНК в отдельных образцах определяли с помощью QRT-PCR (фиг.3). МикроРНК-16-5p был использован в качестве эндогенного контроля для нормализации уровней экспрессии микроРНК-кандидатов. На сегодняшний день обсуждение более широкого выбора наиболее подходящих эталонных генов в микроРНК профилирующих исследований продолжается. Традиционно используемые малые ядерные РНК (RNU6A, RNU44, RNU48 и другие) могут быть нестабильны в плазме и может привести к систематической ошибке в эксперименте. Мы провели тщательный анализ литературы, прежде чем выбрать MIR-16-5p в качестве эталонного гена. Предыдущие исследования выявили микроРНК-16-5p в качестве эндогенного контроля микроРНК, которые могли бы служить в качестве точного опорного гена из-за его относительной стабильном уровне экспрессии в сыворотке [37] [21]. Уровни экспрессии микроРНК-148а-3П и микроРНК-375 показали значительное понижающее регулирование в GC плазме; в то время как микроРНК-223-3p была значительно повышающей регуляции (FDR скорректирована р &лт; 0,05). Никаких существенных различий не было обнаружено в уровнях экспрессии микроРНК-204-5p (рис 3). Для того, чтобы исследовать характеристики дифференциально выраженных микроРНК в качестве потенциальных биомаркеров GC, анализ кривой ROC была выполнена. Кривые ROC СИК-148a-3p, микроРНК-375 и MIR-223-3p показали AUC значение 0,349 (95% ДИ 0.289-0.408), 0,32 (95% ДИ, 0.261-0.377) и 0,671 (95% ДИ , 0.614-0.731), соответственно (рис 4). В одномерный экспрессии генов среднего анализа вниз регулируемых MIR-148a-3П и микроРНК-375, в результате кривая ROC имела АУК значение 0,711 (95% ДИ 0.657-0.769), что соответствует умеренной расстояние между GC и контрольные образцы (рис. 4) Специфичность и чувствительность кандидата микроРНК, показаны на рис 4.
<р> Для дальнейшего изучения возможных целей микроРНК-148а-3p, MIR-204-5p, MIR-223- 3p и микроРНК-375, все их экспериментально подтвержденных микроРНК-мишени взаимодействий были получены из двух различных баз данных (miRTarbase и miRecords). Данные были визуализированы в Cytoscape в качестве биологической сети, содержащей все упомянутые микроРНК и их целевых взаимодействий (рис 5). Каждое взаимодействие в сети состояла из двух узлов, регулирующий узел микроРНК (красный) и узел мРНК-мишени (розовый), соединенный через один направленный край. В целом, сеть насчитывала 593 подтвержденных целей, 419 из них отнесены к микроРНК-375, 88 назначен MIR-204-5p, 83 назначенный MIR-148a-3П и 21 назначенный MIR-223-3p. Анализ сети показал, что микроРНК-148а-3p и микроРНК-375 было шесть общих целей (MPP5, DNMT3b, PAPD4, RASSF8, PBXIP1 и RAB10), микроРНК-204-5p и микроРНК-375 также имели шесть общих целей (SERP1, CTSC , EFNB2, HSP90AA1, TCF12 и IL1RAP), микроРНК-148а-3p и микроРНК-204-5p имели две общие цели (AURKB и CDC25B), микроРНК-223-3p и микроРНК-148а-3p также имели два общих целей (HSP90B1 и IRS1), микроРНК-223-3p и микроРНК-375 была одна общая цель (PARP1) и MIR-148A-3П, микроРНК-204-5p и микроРНК-375 также была одна общая цель (BCL2). Целевые гены, которые регулируются одновременно двумя или тремя микроРНК представлены в оранжевых и зеленых цветов, соответственно (рис 5).
Болезнь-ассоциированный ген Обогащение анализ
<р> Для того, чтобы определить, является ли болезнь -associated гены были значительно обогащены в нашем наборе целей микроРНК, обогащение анализ был проведен. Во-первых, список генов был получен из базы данных DisGeNet. В качестве запроса для базы данных мы использовали термин "аденокарциномы желудка" (UMLS: C0149826). После фильтрации микроРНК, lncRNA и гены, которые не были в miRTarbase и miRecords, были идентифицированы 115 генов, которые будут связаны с GC. При анализе сети 20 GC-ассоциированных генов были перекрыты, 4 (BCL10, YAP1, IGFBP3 и jag1) из них назначены MIR-375, 6 (IL8, ММР9, IL1B, CDX2, SERPINE1 и СПАРК), назначенный микроРНК-204 -5p, 4 (cdkn1b, APC, NR1I2 и CCKBR) назначен микроРНК-148а-3p и 2 (STMN1 и IGF1R) назначен MIR-223-3p. Целевые гены, которые были связаны с GC представлены синим цветом (рис 5). И, наконец, связанных с заболеванием анализ обогащения гена проводили с использованием теста распределения на основе гипергеометрическое что привело оценить, является ли число GC-ассоциированных генов больше, чем ожидалось, в наборе генов-мишеней, выбранных микроРНК. Обогащение анализ показал, что GC-ассоциированных генов были значительно более широко представлены (р &л; 0,05) в MIR-148a-3p, микроРНК-204-5p и MIR-223-3p, а не значительное обогащение не наблюдалось в MIR-375 генов-мишеней (р > 0,05) (таблица 3)
и DNMT3b
сверхэкспрессии и обратной корреляции с микроРНК ориентации в раковых тканях желудка
<р.> The биоинформатики скрининг потенциальных мишеней микроРНК выявленных BCL2
как мнимого мишень для микроРНК-148а-3p, MIR-204-5p и микроРНК-375 и DNMT3b
для MIR-148a-3П и микроРНК-375. Все эти микроРНК в нашем исследовании были признаны понижающей регуляции в желудочном ткани рака. Для дальнейшей поддержки этих результатов, первый анализ экспрессии BCL2
и DNMT3b
генов была выполнена. Данные QRT-PCR показали значительное увеличение уровня экспрессии обоих BCL2
и DNMT3b
гены в желудочном ткани рака. BCL2
показал 2,7-кратное увеличение, в то время как DNMT3b
имел 16.7-кратное увеличение уровней мРНК (рис 6). корреляционный анализ Пирсона был проведен для того, чтобы раскрыть взаимосвязь между BCL2
и DNMT3b
МРНК и их таргетингом уровни микроРНК в нормальных и раковых тканей желудка (рис 6). Обратная корреляция наблюдалась для обоих предсказанное DNMT3b
-targeting микроРНК: микроРНК-375 (г = -0,49; р = 0,00001) и микроРНК-148а-3p (г = -0,26; р = 0,0328) , Отрицательная корреляция наблюдалась между BCL2
и микроРНК-375 (г = -0.32, р = 0,0116), в то время как никакой связи не было найдено между BCL2
и микроРНК-148а-3p (г = -0,06; р = 0,6631) или BCL2
и микроРНК-204-5p (г = -0,02; р = 0,8546)
<р> Altered профили экспрессии микроРНК имеют. сообщалось, в тканях и крови GC [13] [20] [14] [38]. Некоторые из этих нерегулируемых микроРНК были связаны с выживанием, метастатическим поведением опухоли и других клинико-патологических особенностей ГХ [39] [40]. Кроме того, микроРНК было показано, регулирует рост опухоли путем воздействия на пролиферацию, адгезию, инвазию и миграцию в клеточных линиях GC [41]. Что еще более важно, целевые гены нерегулируемых микроРНК в GC вовлечены в апоптоз, клеточный цикл и других важнейших путей канцерогенеза [12]. Таким образом, исследование микроРНК и их потенциальных генов-мишеней в GC может служить основанием для дальнейшего развития важных диагностических и лечебных альтернатив. Очевидно, что микроРНК являются основными игроками в желудочном канцерогенезе, но мы до сих пор нет точных данных о механизмах и потенциальных клинических применений этих молекул в газовой хроматографии
. <Р> Наше нынешнее исследование с целью определения профиля нерегулируемых микроРНК в GC ткани, оценить их в образцах плазмы и для оценки потенциальных генов-мишеней нерегулируемых микроРНК. Использование TaqMan микроРНК TLDA карт, охватывающих 377 микроРНК праймеров, мы нашли 15 дифференцированно выраженных микроРНК между раковой GC и здоровых тканей желудка. Восемь микроРНК были вниз регулируется (пусть-7а-5P, пусть-7G-5P, MIR-26b-5P, микроРНК-30b-5p, микроРНК-135а-5P, микроРНК-148а-3p, микроРНК-204-5p, микроРНК -375), в то время как семь микроРНК были повышающей регуляции (микроРНК-146b-5P, микроРНК-155-5p, микроРНК-214-3p, микроРНК-223-3p, микроРНК-224-5p, микроРНК-331-3p и зер- 484). Наши результаты профилирование не выявили некоторые из наиболее часто нерегулируемых микроРНК, которые были ранее сообщениям, дерегулирование в других исследованиях, в том числе MIR-21-5p, MIR-25-3p, MIR-92a-3p, MIR-29с-3П, и некоторые другие [15] [19] [14]. Одним из возможных объяснений этих недостающих микроРНК может быть связано с очень строгими статистические критерии, которые применялись для TLDA анализа наших данных (FDR скорректированного значения р < 0,01 и сложите изменение > 2). Кроме того, некоторый уровень расхождения в микроРНК профилирования результатов среди исследований может возникнуть в результате различий в анатомической локализации желудка, гистологического подтипа, статистический анализ и методы особенно профилирующих [18]. Исследование, проведенное Mestdagh и соавт. показывает, что различные платформы микроРНК профилирования имеют различные скорости обнаружения, специфичности и воспроизводимости, а также, что наиболее подходящей платформой должны быть выбраны на основе экспериментальных условий и конкретных вопросов исследования (Mestdagh и др., 2014).
<р> на втором этапе нашего исследования мы использовали QRT-PCR в когорте репликации в том числе шести наиболее нерегулируемых микроРНК из фазы профилирование (микроРНК-135а-5P, микроРНК-148а-3p, микроРНК-155-5p, микроРНК-204-5p , микроРНК-223-3p и микроРНК-375). Мы показали, что микроРНК-148а-3p, микроРНК-204-5p, микроРНК-223-3p и микроРНК-375 были последовательно дерегулированы между нормальными и раковыми тканями GC. Результаты нашей когорте репликации поддерживаются предыдущими отчетами. Несколько исследований показали, что микроРНК-148а-3р значительно понижающей регуляции в клеточных линиях GC и образцов тканей по сравнению с соседними нормальными тканями [42] [43]. Низкие уровни экспрессии микроРНК-375 были также зарегистрированы в исследованиях, что гипотезу микроРНК-375 был связан с желудка канцерогенеза [44] [16]. Мы определили, что микроРНК-223-3p была значительно повышающей регуляции в GC ткани по сравнению с нормальной тканью, как это было предложено несколько предыдущих докладов [15] [19]. MIR-204-5p было реже сообщили в ГК микроРНК профилирование исследований; тем не менее, наши результаты согласуются с предыдущим исследованием, которое показало значительное понижающее регулирование этого микроРНК в GC ткани и клеточных линий GC [45]. выражение микроРНК-135а-5p был в GC тканях ниже, чем в контрольной группе; Тем не менее, наблюдаемая тенденция понижающая регуляция была похожа на предыдущие доклады [15] и, возможно, наберете необходимое значение в связи с большим числом особей в пределах групп. Стоит отметить, что мы не нашли различий для MIR-155-5p в нашей группе репликации, сравнивающие контроля и пациентами GC. Скорее всего, эта находка связана с тем, что в начальной когорте профилирование, контрольные субъекты были H
. пилори
бесплатно, в то время как в наборе репликации, некоторые из контрольных субъектов имели положительный тест для этой бактерии. Хорошо известно, что микроРНК-155-5p участвует в воспалительных путей, включая H
. пилори
гастрит [46]; Таким образом, это может дать определенный уклон к нашим результатам. Наши результаты согласуются с предыдущим исследованием по ссылке и др. (2015), где разница в экспрессии микроРНК-155 в биопсий GC по сравнению с контрольной группой не достигало статистической значимости [18]. На стадии репликации нашего микроРНК профилирующего исследования мы выбрали только шесть микроРНК, которые показали самую высокую биологическую значимость и статистическую значимость. Мы согласны с тем, что было бы целесообразно, чтобы посмотреть на все значительно дерегулируемых микроРНК, и это может быть потенциальной задачей в дальнейших исследованиях.
<Р> Для исследования потенциальной роли микроРНК дифференцированно выраженных в качестве биомаркеров в GC, мы проанализировали дерегулированы микроРНК в образцы плазмы. Циркулирующие микроРНК, в частности, сочетание нескольких микроРНК, может представить в качестве перспективных биомаркеров для диагностики рака желудочно-кишечного тракта [21]. Исследование, проведенное Zhu и соавт. показал, что группа из пяти микроРНК может служить в качестве потенциального биомаркера в выявлении ранней стадии GC [47]. На сегодняшний день, сообщает микроРНК профили в GC сыворотке или плазме крови значительно отличаются среди отдельных исследований [21].
Исследование связывает потребление ферментированных овощей с низкой смертностью от COVID-19
Диагностика вирусных инфекций с помощью микро- и нанотехнологий
Меры по предотвращению передачи SARS-CoV-2 со сточными водами в бедных регионах
Изменение микробиома верхних дыхательных путей у детей, связанное с восприимчивостью к SARS-CoV-2
Ксилит и экстракт семян грейпфрута обещают предотвратить заражение SARS-CoV-2,
Кормить домашних животных сырой пищей безопасно,
Микробиом влагалища может влиять на эффективность профилактической терапии ВИЧ.
Новое исследование, проведенное доктором Николь Клатт из Университета Миннесоты, и коллеги, выявил, что микробные сообщества влагалища связаны с повышенным риском заражения ВИЧ. а также может влиять
Фастфуд может быть главной причиной подростковой депрессии
Почему депрессия становится такой растущей проблемой среди подростков в Америке? Один ответ - это то, что они едят, согласно новому исследованию исследователей из Университета Алабамы в Бирмингеме.
Исследование:микробы, вызывающие сердечные приступы
Исследование, проведенное на Конгрессе ESC 2019, состоявшемся в прошлые выходные в Париже, показывает, что аномальная популяция микробов в организме может привести к нарушению стабильных коронарных бл