PLoS ONE: Analyysi vapautettiin MikroRNA ja niiden kohdegeenien Mahalaukun Cancer

tiivistelmä

Background

MikroRNA (miRNA) ovat laajalti tutkittu ei-koodaavat RNA: t, jotka säätelevät geenin ilmentymistä. MiRNA sääntely on purettu eri kasvaimissa kuten mahasyövän (GC) ja on potentiaalia ja ennustavia vaikutuksia. Tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää miRNA profiilin GC kudoksissa, jonka jälkeen arviointi vapautetuilla miRNA plasmassa GC potilaista. Käyttämällä tietokannat ja bioinformatiikan menetelmiä myös pyrittiin arvioimaan mahdollisia kohdegeenien vahvisti differentiaalisesti ilmaisi miRNA ja vahvistaa nämä havainnot GC kudoksissa.

Methods

Tutkimus käsitti 51 GC potilasta ja 51 valvontaa. Aluksi me seulotaan miRNA ilmaisun profiili 13 kudosnäytteistä GC ja 12 normaali mahan kudoksissa TaqMan alhaisen tiheyden array (TLDA). Toisessa vaiheessa, ilmentyvät eri miRNA oli validoitu replikointi kohortti käyttäen qRT-PCR kudosten ja plasman näytteitä. Myöhemmin olemme analysoineet potentiaali kohdegeenien vapautetuilla miRNA bioinformatiikan lähestymistapaa, määräytyy niiden ilmaisun GC kudoksissa ja suoritetaan korrelaatio analyysi kohdistamista miRNA.

Tulokset

Profilointi kanssa TLDA paljasti 15 vapautettiin miRNA GC kudoksiin verrattuna normaaleihin mahan limakalvoa. Replikointi analyysi vahvisti, että miR-148a-3p, miR-204-5p, miR-223-3p ja miR-375 oli johdonmukaisesti vapaimpiin GC kudoksissa. Analyysi GC potilaiden plasmanäytteistä osoitti merkittäviä alas-säätely miR-148a-3p, miR-375 ja ylös-säätely miR-223-3p verrattuna terveisiin henkilöihin. Edelleen, käyttämällä bioinformatiikan työkaluja tunnistimme tavoitteet Replikoidun miRNA ja suorittaa sairauteen liittyvän geenin rikastaminen analyysi. Loppujen lopuksi arvioida mahdollisten kohdegeenin BCL2
ja DNMT3B
ilmentymisen qRT-PCR GC kudoksessa, joka korreloi kohdistamista miRNA ilme.

Johtopäätökset

Tutkimuksemme paljastivat miRNA profiilin GC kudosten ja osoitti, että miR-148a-3p, miR-223-3p ja miR-375 on vapautettu GC plasmanäytteissä, mutta nämä kiertävä miRNA osoitti suhteellisen heikkoa diagnostinen suorituskyky ainoana biomarkkereita. Target geeni analyysi osoitti, että BCL2
ja DNMT3B
ilmentymistä GC kudoksessa korreloi niiden kohdistamista miRNA ilmaisua.

Citation: Juzėnas S, Saltenienė V Kupcinskas J, Linkin , Kiudelis G, Jonaitis L, et ai. (2015) analyysi vapautettiin MikroRNA ja niiden kohdegeenien mahasyövän. PLoS ONE 10 (7): e0132327. doi: 10,1371 /journal.pone.0132327

Editor: Lin Zhang, University of Pennsylvania School of Medicine, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 22 huhtikuu 2015; Hyväksytty: 13 Kesäkuu 2015; Julkaistu: 14 heinäkuu 2015

Copyright: © 2015 Juzėnas et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä työ JK, LJ, SiJu, LK, JS tukivat Euroopan sosiaalirahasto nro VP1-3.1-SMM-07-K-01 -156. Työ PM tukee Saksan opetus- ja tutkimusministeriö kehyksessä ERA-Net PathoGenoMics. Grant No: BMBF-0315905D. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

löytö MikroRNA (miRNA) ja perustamalla niiden merkitys molekyyli polkuja on tuonut valtavan etukäteen molekyylibiologian [1] [2]. Nämä pienet ei-koodaavat RNA: t koostuvat ~ 22 bp ovat mukana transkription jälkeinen geenin ilmentymisen säätelyyn. MiRNA on luonteenomaista korkea vakaus biologisten näytteiden mikä näistä molekyyleistä houkutteleva kohde in biomarkkereiden tutkimusalalla [3] [4]. Kertyvät näyttöä siitä, että miRNA ovat mukana suurissa karsinogeneesissä väyliä [5]. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että vapauttaminen miRNA esiintyy lähes kaikissa merkittävissä syöpätyyppien [5] [6]. Lisäksi miRNA on osoitettu olevan diagnostista tai prognostista rooli ja jopa mahdollista kliinistä merkitystä kohdistettuun geeniterapian syöpäpotilailla [7] [8].

esiintyvyys mahasyöpä (GC) länsimaissa on vähentynyt viimeisten vuosikymmenten aikana; kuitenkin, tämä syöpä osuus on edelleen lähes miljoona uutta tautitapauksista maailmanlaajuisesti ja kuljettaa hyvin korkea kuolleisuus [9]. Viimeaikainen tutkimus GC on paljastanut monia uusia oivalluksia patogeneesin tämän maligniteetti. Kuitenkin tarkka mekanismit pahanlaatuisen muodonmuutoksen Helicobacter pylori
( H
. pylori
) infektio krooninen atrofinen gastriitti, suoliston metaplasiaa ja GC on edelleen huonosti [10 ]. Nykyinen hypoteesi GC kehitys liittyy yhdistettyjen vaikutusten bakteeri, isäntä ja ravitsemukselliset tekijät; Tähän mennessä tämä teoria viittaa hyvin harvat kliinisesti ääni translaation vaikutuksia [11]. Suurin osa GC tapauksista diagnosoidaan loppuvaiheissa tauti, joka liittyy huono hoitotuloksia. Sen vuoksi yksi tärkeimmistä painopisteistä GC tutkimus on arvioitaessa mahdollista molekyyli biomarkkereita, joita voitaisiin käyttää varhaisen ei-invasiivisia diagnostiikka tämän maligniteetti.

ratkaisevaa roolia miRNA GC on esitetty eri tutkimuksissa [12]. Volinia et ai. ovat antaneet ensimmäisiä miRNA ekspressioprofiileja GC kudoksessa näyttää tietyn vapauttamisen mallia [13]. Lisätutkimukset ovat myös raportoitu merkittävä vapautuminen miRNA kuuluvien miR-17, miR-21, miR-223, miR-135 ja monia muita perheitä. Niistä raportoidussa tutkimuksessa GC kudoksissa, miR-21, miR-25, miR-92, miR-223 olivat johdonmukaisesti sääteli miRNA, kun taas miR-375 ja miR-148 olivat johdonmukaisesti alassäädetty [14] [ ,,,0],15] [16]. Useimmat näistä tutkimuksista on tarkasteltu miRNA profiilin potilaalla on GC ja pariksi viereisen normaali mahan limakalvon [14]. Tärkeää tutkimukset ovat osoittaneet, että miRNA jo vapautettu alkuvaiheessa mahasyövän lukien H
. pylori
gastriitti ja premaligni vaiheissa mahalaukun surkastumisen ja suoliston metaplasiaa [17] [18]. Mielenkiintoista on, että jotkut miRNA on vastakkaiset vapauttamisen suuntiin, kun läsnä on GC, erillisinä profilointi tutkimukset osoittavat merkittävää epäjohdonmukaisuutta joukossa vapautettu miRNA [14]. MiR-9 todettiin säädelty kahdessa tutkimuksessa [15] [19], kun taas kaksi muuta papereita osoitti merkittäviä alas-säätely tämän miRNA GC kudoksissa [13] [20]. Nämä eroavuudet koskevat vastapäätä sääntelyn tulokset miR-9 ja monet muut miRNA todennäköisimmin liittyy eroihin anatominen sijainti GC, histologinen alatyyppi, sairauden vaiheessa, profilointi alustoja, tilastollinen analyysi ja monet muut mahdolliset sekoittavat tekijät. Lisäksi suurin osa nykyään julkaistut tutkimukset miRNA profiili GC kudoksissa käsittää aiheita Aasian maista; välin tiedot Euroopan GC potilaista on niukasti [21].

Päämääränä läsnä oli selvittää miRNA profiilin GC kudosten ja vertaa sitä normaaliin terve mahalaukun limakalvo käyttämällä kattavuus miRNA TaqMan alhaisen tiheyden taulukot. Vuonna tarkempaa analysointia, pyrimme vahvistamaan meidän profilointitulosten kudosten ja plasman suurempaa ryhmää GC potilaiden ja terveiden verrokkien eurooppalaista syntyperää. Loppujen lopuksi arvioitiin mahdollisia kohdegeenien vahvistetuilla differentiaalisesti ilmaisi miRNA ja suorittaa taudista yhdistys geenin rikastaminen analyysi niiden kohdegeenien.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics selvitys

tutkimuksen hyväksyi Kaunas Regional Biomedical Research eettisen komitean (pöytäkirja nro BE-2-10). Kaikki potilaat allekirjoitti tietoisen suostumuksen lomakkeella osallistua tutkimukseen.

Tutkimuskanta

dosnäytteistä prospektiivisesti kerättiin vuosien 2011 ja 2014 osastot gastroenterologian ja kirurgian sairaala liettualaista University of Health Sciences (Kaunas, Liettua). Tutkimuksessa oli mukana yhteensä 51 verrokeilla ja 51 GC potilasta, jotka oli jaettu profilointi (GC, n = 13; valvontaa, n = 12) ja validointi kohortteja (GC, n = 38; valvontaa, n = 39). Kaikki koehenkilöt olivat eurooppalaista syntyperää. Mahalaukun biopsianäytteissä saatiin antral osa mahassa verrokeilla, jotka on alistettu ylemmän ruoansulatuskanavan endoskopia takia happovaivat ja ollut aiempi maligniteetti. GC kudosnäytteitä saatiin kirurgisista näytteistä heti resektion potilailta, joille suoritetaan ensisijainen leikkaus GC ilman leikkausta edeltävän säteilytys ja kemoterapia. Mahalaukun adenokarsinooma GC potilaille varmistettiin histologisesti ja luokitellaan Lauren osaksi hajanainen ja suoliston tyypit [22]. H
. pylori
tila arvioitiin GC ja verrokeilla käyttämällä epäsuoraa ELISA havaita seerumin IgG antigeenin (Virioni /Serion GmbH, Wünrzburg, Saksa). Kliiniset ja patologiset ominaisuudet potilasaineistoihin kuten ikä, sukupuoli ja sairauden vaihe on koottu taulukkoon 1.

Tissue näytteen valmistus ja RNA

Mahalaukun kudosnäytteitä säilytettiin RNAlater (Ambion, Austin , TX, USA) + 4 ° C: ssa ja 24 tuntia myöhemmin säilytettiin -80 ° C: ssa. 30 mg kudosta homogenoitiin steriilinä ennen kokonais-RNA eristyksissä Mirvana miRNA Isolation Kit (Ambion, Austin, TX, USA) profilointiin tutkimus ja miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) validointitutkimuksella mukaan valmistajien opetusta. Laatu RNA arvioitiin käyttämällä Nanodrop 2000 spektrofotometrillä (Thermo Scientific, USA). Laadullinen tarkastelu RNA eheys suoritettiin elektroforeesilla agaroosigeelillä (5%).

Plasma näytteen valmistus ja RNA

Plasma kerättiin terveyteen potilailla ja GC. Mirna ilme plasmassa kohortissa koostui plasmanäytteistä 38 mahasyöpäpotilaista ja 39 tervettä vapaaehtoista. Laskimoverta kerättiin EDTA antikoagulaatio tyhjöputket ja sentrifugoitiin 3500 rpm: llä 15 minuutin ajan huoneenlämpötilassa; erotettu plasma siirrettiin 1,5 ml: n putkiin ja laitettiin -80 ° C pakastimeen lyhytaikaiseen varastointiin. Pieni RNA: t uutetaan 200 ui plasmaa käyttämällä miRNeasy seerumi /plasma Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) kohti valmistajan ohjeiden.

Mirna profilointi käyttäen TaqMan Low-Density Array

miRNA profiloinnin suoritettiin TaqMan Array Human Mirna Card v2.1 joka mahdollisti määrällisesti 377 ihmisen miRNA luetteloitu miRBase v20 [23]. Lyhyesti, 350 ng kokonais-RNA: ta aluksi käänteiskopioitua käyttäen Megaplex RT asetettu allas versio 2.1 (Applied Biosystems, Carlsbad, Kalifornia, USA) ja 800 ui cDNA tuote lastattiin TaqMan Array Human Mirna kortti ja ajaa VIIa 7 Real-Time PCR System (Applied Biosystems). Ensisijainen analyysi tehtiin käyttämällä VIIA 7 Software (Applied Biosystems) saada ilmentymisen suhteen Ct. Tietojen analysointi suoritettiin käyttäen Bioconductor HTqPCR paketti [24]. MiRNA joiden Ct arvon > 37 pidettiin unamplified. MiRNA joita ei monistettiin yli 25% näytteistä katsottiin lowly ilmaista, ja näin ollen, jätettiin pois lisäanalyysistä. MiRNA ekspressiotietojen normalisoitiin käyttämällä listalla invariant normalisointi. NormFinder ja geNorm algoritmeja käytettiin tunnistamaan viittaus geeni TLDA tietojen validointitutkimusta [25]. Mukaan algoritmien miR-127-3p osoitti alin Ct varianssi ja valittiin viittaus geeni validointitutkimuksessa. Viimeaikaiset tutkimukset osoittavat, että ekspressiotasot RNU6A ja joitakin muita pieniä ydin- RNA: t saattavat olla epävakaa tietyissä kudoksissa ja ehdot eivät voi olla tehtävässä parhaana viitteenä geenejä [26] [27] [28] [29]. Yksi tuore julkaisu on myös tunnistettu miR-127-3p niin hyvä ehdokas viite geenin valinta [30].

Quantitative käänteistranskriptio polymeraasiketjureaktioilla (qRT-PCR) B

Käänteiskopiointireaktioita (RT ) suoritettiin käyttäen TaqMan Mirna Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, Kalifornia, USA) ja miRNA-erityisiä RT varsi-silmukka-alukkeita (Applied Biosystems, Carlsbad, Kalifornia, USA). Singleplex reaktiot suoritettiin tilavuudessa 7,5 ui. Kukin reaktio käsitti 2,08 ui nukleaasilla vapaata vettä, 0,74 ui 10 x RT-puskuria, 0,08 ui dNTP: itä (100 mM), 1,5 ui 5 x miRNA-spesifisiä RT-alukkeita, 0,1 ui RNaasi-inhibiittorin, 0,5 ui Multiscribe käänteistranskriptaasia ja kiinteä tilavuus miRNA mallin (2,5 ui). RT suoritettiin termosyklerissä seuraavissa olosuhteissa: 16 ° C 30 min, 42 ° C: ssa 45 min ja 85 ° C: ssa 5 min, jota seurasi pito 4 ° C: ssa.

TaqMan real -Aika PCR-reaktiot suoritettiin kahtena reaktiot käsittävät 6,25 ui TaqMan 2 × Universal PCR Master Mix Ei AmpErase UNG (Applied Biosystems, Carlsbad, Kalifornia, USA) 0,625 ui 20 x miRNA aluketta ja koetin sekoitus TaqMan miRNA Assay Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, Kalifornia, USA), 3 ui käänteisen transkription tuotteita ja 2,625 ui nukleaasin vapaata vettä. RT-PCR suoritettiin käyttäen 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Carlsbad, Kalifornia, USA) seuraavissa olosuhteissa: 95 ° C: ssa 10 min, sitten 40 sykliä 95 ° C 15 s, 60 ° C: ssa 60 s, jonka jälkeen pitää 4 ° C: ssa. Kukin näyte ajettiin kahtena kappaleena. Aineisto analysoitiin automaattiasetuksilla osoittamiseksi lähtötilanteen, ja keskimääräinen Ct ja SD-arvot laskettiin. Ilmentymistason miRNA kudoksessa normalisoitiin miR-127-3p ja ilmentymisen taso plasmassa oli normalisoitu HSA-miR-16-5p. Tulokset laskettiin käyttäen ΔΔCT menetelmällä [31]. Aineisto analysoitiin automaattiasetuksilla osoittamiseksi lähtötilanteen, ja keskimääräinen Ct ja SD-arvot laskettiin.

cDNA BCL2
ja DNMT3B
geeniekspressioanalyysissä syntetisoitiin 500 ng RNA käyttäen High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, Kalifornia, USA). Singleplex reaktiot suoritettiin tilavuudessa 7,5 ui. Kukin reaktio käsitti 2,1 ui nukleaasilla vapaata vettä, 1 ui 10 x RT-puskurilla, 0,4 ui dNTP: itä (100 mM), 1 ui 10 x RT Random alukkeita, 0,5 ui Multiscribe käänteistranskriptaasia ja kiinteä tilavuus miRNA malli (2,5 ui). RT-PCR suoritettiin termosyklerissä seuraavissa olosuhteissa: 25 ° C: ssa 10 minuuttia, 37 ° C: ssa 120 min, ja 85 ° C: ssa 5 min, jota seurasi pito 4 ° C: ssa. Ennen qPCR cDNA laimennettiin 1: 1-nukleaasilla ilmaista vettä ja 2 ui käytettiin 10,5 ui RT-qPCR reaktioita yhdessä 6,25 ui 2x TaqMan Fast Universal Master Mix (Life Technologies, Carlsbad, Kalifornia, USA), 0,625 ui 20x TaqMan Gene Expression Assay (Life Technologies, Carlsbad, Kalifornia, USA) ja 3,625 ui steriiliä vettä. RT-qPCR määritykset suoritettiin kolmena rinnakkaisena on 7900HT Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Carlsbad, Kalifornia, USA) seuraavissa olosuhteissa: 95 ° C: ssa 10 min, sitten 40 sykliä 95 ° C 15 s, 60 ° C: ssa 60 s, jonka jälkeen pitää 4 ° C: ssa. Ilmaisu tasot BCL2
ja DNMT3B
kudoksessa normalisoitiin ACTB
.

Kohdegeenin verkostoanalyysi

luettelot validoitu kohdegeenien ehdokas miRNA saatiin miRTarbase v4.5 (mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw) ja miRecords v4.0 (mirecords.biolead.org) tietokantoihin. Gene-tauti yhdistyksen tiedot haettiin DisGeNET tietokannasta (http://www.disgenet.org/). Jotta voitaisiin tunnistaa GC liittyvien geenien, termi "mahalaukun adenokarsinooman" (umls: C0278701) käytettiin kyselyn tietokantaan. Biologiset verkot luotiin käyttäen Cytoscape v3.2 avoimen lähdekoodin ohjelmisto CyTargetLinker sovelluksen [32].

Tilastollinen

kliiniset ominaisuudet ryhmissä verrattiin käyttämällä χ
2 testiä ja Fisherin testiä varten laadullisia tietoja, ja t-testiä varten määrällisiä tietoja. TLDA analysoitiin käyttäen t-testiä ja Benjamini Hochberg korjaus vääriä löytö nopeudella, että ero ilmentyminen pidettiin merkittävänä kanssa p < 0,01. Aineisto normalisoitiin käyttämällä listalla muuttumattomalla normalisointi [33] ja analysoitiin käyttämällä HTqPCR paketti. Validointi ja plasma qPCR ilmaisun analysoitiin käyttäen epäparametrisia Mann-Whitneyn U-testiä. Benjamini Hochberg oikaistun p < 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä. Sillä qRT-PCR tietoja suhteellinen ekspressiotasot kohde-miRNA (Log2 suhteellinen taso) laskettiin eron CT-arvojen tavoite miRNA ja miR-127-3p kudosnäytteistä ja miR-16-5p plasmanäytteissä (ACt) [34]. Hypergeometrinen testiä käytettiin GC-liittyvä tavoite rikastamiseen analyysi. Vastaanotin toimii (ROC) käyrä muodostettiin kullekin miRNA käyttäen ACt tiedot. Pinta-ala (AUC) arvo ja 95% luottamusvälit (CI) laskettiin määrittää spesifisyys ja herkkyys. Analysoida diagnostinen arvo yhdistetään muutoksia plasman miRNA tasoilla, yhden muuttujan geenin ilmentyminen keskimääräinen algoritmia käytettiin [35]. ROC käyrät luotiin käyttäen ROCR paketti [36]. Kaikki tiedot analyysit suoritettiin käyttäen R-versiossa 3.1.1 ohjelmisto.

Tulokset

miRNA ilmentymisen profilointiin GC ja terveen mahalaukun limakalvon kudoksen TLDA

TaqMan Human miRNA Low-Density array analyysi tehtiin tunnistamiseksi ehdokas miRNA esillä muuttunut ilmentyminen mahasyövässä kudoksessa. Tissue miRNA profiileja GC potilaita verrattiin profiilit mahalaukun limakalvon terveistä yksilöistä. Suodattamisen jälkeen alhaisen runsas miRNA (Ct-arvo > 37 ja ei-havaittavissa yli 25% näytteistä), joukko 193 miRNA (total 377) pysyivät edelleen analyysiä. Vertaaminen syöpä- ja normaalissa kudoksessa tunnistettu 15 ilmentyvät eri miRNA, joista 7 säädelty ja 8 alas-säädellä FDR säädetty p-arvo < 0,01 ja taita muutos > 2 (taulukko 2). Tulokset osoitetaan tulivuori kuvaaja (kuvio 1). Näistä 6 miRNA (miR-135a-5p, miR-148a-3p, miR-204-5p, miR-375, miR-223-3p ja miR-155-5p), jolla on suurin merkitys ja taita muutosarvoja valittiin validointitutkimuksessa. Hierarkkinen klusterointi alle Euclidean päässä valittujen miRNA normalisoitu ilmaisu paljastivat kaksi alaryhmää: yksi vastaa kontrolliryhmässä ja toinen vastaava pääasiassa potilaalle ryhmään. (Kuvio 2).

Mirna validointi GC ja terveen mahalaukun limakalvon kudoksen qRT-PCR

Kuusi ehdokasta miRNA valittu tarkastettavaksi kvantitoitiin käyttäen qRT-PCR. Vertailukohtana geeni Valinnan TLDA analysoitiin käyttämällä kahta eri algoritmeja (NormFinder ja geNorm) tunnistamiseksi viite geenejä. MiR-127-3p osoitti korkein ilmaus vakautta kaikissa näytteiden TLDA tietoja ja koska tämä ominaisuus miR-127-3p valittiin viittaus geeni normalisoida qPCR tietoja. Ilmentymistasojen miR-148a-3p, miR-204-5p, miR-223-3p ja miR-375 osoitti merkittävää ero ilmentymistä samaan suuntaan kuin löytö tutkimuksessa (FDR säädettiin p < 0,05), kun taas mitään merkittävää eroja havaittiin ekspressiotasot miR-135a-5p ja miR-155-5p (FDR säädettiin p > 0,05; kuvio 3).

Plasma miRNA mahdollisina biomarkkereita mahasyövän

in GC kudoksen validoitu miR-148a-3p, miR-204-5p, miR-223-3p ja miR-375 valittiin lisäanalyysiä plasmanäytteissä. Suhteellisten tasojen ehdokas mRNA: iden yksittäiset näytteet määritettiin käyttämällä qRT-PCR (Kuva 3). MIR-16-5p käytettiin endogeenisen ohjaus normalisoimiseksi ekspressiotasoja ehdokas miRNA. Tähän mennessä käydyissä valinnassa sopivin viittaus geenien miRNA profilointi tutkimuksia varten on käynnissä. Perinteisesti käytetty pieni ydin- RNA: iden (RNU6A, RNU44, RNU48 ja muut) saattavat olla epästabiili plasmassa ja voi vinouttaa kokeiluun. Olemme suorittaneet perusteellisen kirjallisuuden analyysin ennen valintaa miR-16-5p viitteenä geeni. Aiemmat tutkimukset ovat tunnistaneet miR-16-5p kuin endogeeninen kontrolli miRNA, joita voitaisiin käyttää tarkka viittaus geeni johtuen sen suhteellisen vakaana ilmentymistaso seerumin [37] [21]. Ilmaisu tasot miR-148a-3p ja miR-375 osoitti merkittäviä alassäätöä GC plasmasta kun taas miR-223-3p oli merkitsevästi sääteli (FDR säädetty p < 0,05). Mitään merkittäviä eroja ei havaittu ekspressiotasot miR-204-5p (kuvio 3). Tutkia ominaisuudet differentiaalisesti ilmaistuna miRNA mahdollisina biomarkkerit GC, ROC-käyrä analyysi. ROC käyrät miR-148a-3p, miR-375 ja miR-223-3p osoittivat AUC-arvo 0,349 (95% CI, ,289-+0,408), 0,32 (95% CI, 0,261-0,377) ja 0,671 (95% CI , +0,614-+0,731), vastaavasti (kuvio 4). Vuonna univariate geenien ilmentymisen keskiarvo analyysi alassäädetty miR-148a-3p ja miR-375, tuloksena ROC-käyrä oli AUC-arvo 0,711 (95% CI 0,657-,769), mikä vastaa kohtalainen erottaminen GC ja kontrollinäytteitä (kuvio 4). Erityispiirteiden mukaisesti ehdokas miRNA on esitetty kuvassa 4.

Target geenin ennustaminen

tutkimiseksi edelleen mahdollisia tavoitteita miR-148a-3p, miR-204-5p, miR-223- 3p ja miR-375, kaikkien niiden kokeellisesti vahvistettu miRNA-kohteen vuorovaikutuksista saatiin kahdesta eri tietokannoissa (miRTarbase ja miRecords). Aineisto visualisoida Cytoscape biologinen verkko, joka sisältää kaikki mainitut miRNA ja kohteen vuorovaikutuksista, (kuvio 5). Jokainen vuorovaikutus verkossa koostui kaksi solmua, sääntelyn miRNA solmu (punainen) ja kohde-mRNA solmu (vaaleanpunainen) kytketty yksi suunnattu reuna. Kaiken verkon mukana 593 validoitu tavoitteet, 419 heistä osoitettu miR-375, 88 määrätty miR-204-5p, 83 määrätty miR-148a-3p ja 21 osoitetaan miR-223-3p. Verkko-analyysi osoitti, että miR-148a-3p ja miR-375 oli kuusi yhteisiä tavoitteita (MPP5, DNMT3B, PAPD4, RASSF8, PBXIP1 ja RAB10), miR-204-5p ja miR-375 oli myös kuusi yhteisiä tavoitteita (SERP1, CTSC , EFNB2, HSP90AA1, TCF12 ja IL1RAP), miR-148a-3p ja miR-204-5p oli kaksi yhteisten tavoitteiden (AURKB ja CDC25B), miR-223-3p ja miR-148a-3p oli myös kaksi yhteisten tavoitteiden (HSP90B1 ja insuliinireseptorisubstraatti 1), miR-223-3p ja miR-375 oli yksi yhteinen tavoite (PARP1) ja miR-148a-3p, miR-204-5p ja miR-375 oli myös yksi yhteinen tavoite (BCL2). Kohdegeenien jotka säädellään yhtä aikaa kahdella tai kolmella miRNA ovat edustettuina oranssi ja vihreä väri, vastaavasti (kuvio 5).

sairauteen liittyvän geenin rikastaminen analyysi

Jotta voitaisiin tunnistaa onko tauti -associated geenejä merkittävästi rikastettu meidän joukko miRNA tavoitteita, rikastus analyysi. Ensinnäkin geeni luettelo on haetaan DisGeNet tietokannasta. Kuten kyselyn tietokannan olemme käyttäneet termiä "mahalaukun adenokarsinooman" (umls: C0149826). Suodattamisen jälkeen miRNA, lncRNA ja geenit, jotka eivät olleet miRTarbase ja miRecords, 115 geenit tunnistettiin liittyvän GC. Verkossa analyysi 20 GC liittyvien geenien asetettiin päällekkäin, 4 (BCL10, YAP1, IGFBP3 ja JAG1) heistä osoitettu miR-375, 6 (IL8, MMP-9, IL1B, CDX2, SERPINE1 ja SPARC) osoitetaan miR-204 -5p, 4 (CDKN1B, APC, NR1I2 ja CCKBR) osoitetaan miR-148a-3p ja 2 (STMN1 ja IGF1 R) osoitetaan miR-223-3p. Kohdegeenien jotka liittyivät GC ovat edustettuina sinisellä (kuva 5). Lopuksi, sairauteen liittyvän geenin rikastaminen analyysi suoritettiin käyttäen hypergeometrisen jakelu-pohjainen testi, joka johti sen arvioimiseksi määrä GC liittyvien geenien on odotettua suurempi joukko kohdegeenien valittujen miRNA. Väkevöiminen analyysi paljasti, että GC liittyvien geenien olivat merkittävästi yliedustettuna (p < 0,05) miR-148a-3p, miR-204-5p ja miR-223-3p, kun taas mitään merkittävää rikastumista havaittu miR-375 kohdegeenien (p > 0,05) (taulukko 3).

BCL2
ja DNMT3B
yli-ilmentyminen ja käänteinen korrelaatio kohdistaminen miRNA mahasyövän kudoksissa

Euroopan bioinformatical seulonta potentiaalisten miRNA tunnistettujen tavoitteiden BCL2
otaksutuksi tavoitteeksi miR-148a-3p, miR-204-5p ja miR-375 ja DNMT3B
mir-148a-3p ja miR-375. Kaikki nämä miRNA tutkimuksessamme todettiin olevan alassäädetty mahasyövän kudoksessa. Edelleen tukevat näitä tuloksia, ensimmäinen ilmaus analyysi BCL2
ja DNMT3B
geenit tehtiin. Tiedot qRT-PCR osoitti merkittävää kasvua ekspressiotasoja sekä BCL2
ja DNMT3B
geenien mahasyövässä kudoksessa. BCL2
osoitti 2,7-kertaisen kasvun, kun taas DNMT3B
oli 16,7-kertainen mRNA-tasot (kuvio 6). Pearsonin korrelaatio analyysi suoritettiin, jotta paljastaa väliset suhteet BCL2
ja DNMT3B
mRNA: iden ja niiden kohdistaminen miRNA tasoilla normaalissa ja syöpä- mahan kudoksissa (kuvio 6). Käänteinen korrelaatio havaittiin sekä ennustetun DNMT3B
-targeting miRNA: miR-375 (r = -0,49; p = 0,00001), ja miR-148a-3p (r = -0,26; p = 0,0328) . Negatiivinen korrelaatiota ei havaittu BCL2
ja miR-375 (r = -0,32; p = 0,0116), kun taas mitään suhdetta välillä havaittiin BCL2
ja miR-148a-3p (r = -0,06; p = 0,6631) tai BCL2
ja miR-204-5p (r = -0,02; p = 0,8546).

keskustelu

Altered miRNA ekspressioprofiileja on on raportoitu GC kudos- ja verinäytteet [13] [20] [14] [38]. Jotkut näistä vapautettu miRNA on yhdistetty selviytymisen, metastaattisen käyttäytymisen kasvaimen ja muiden kliinis-GC [39] [40]. Lisäksi miRNA on osoitettu säätelevän kasvaimen kasvua vaikuttamalla lisääntymistä, tarttuvuus, invaasion ja muuttoliikkeen GC solulinjoissa [41]. Vielä tärkeämpää on, kohdegeenien vapautetuilla miRNA GC ovat mukana apoptoosin, solusyklin ja muut tärkeät syövän syntymistä reittejä [12]. Siksi tutkimus miRNA ja niiden mahdollisia kohdegeenien GC voivat toimia kehittää edelleen tärkeitä diagnosoinnin ja hoidon vaihtoehtoja. On ilmeistä, että miRNA ovat merkittäviä toimijoita mahasyövän, mutta meiltä puuttuu yhä tarkkoja tietoja mekanismeista ja mahdollisia kliinisiä sovelluksia näiden molekyylien GC.

Tämän tutkimuksen tavoitteena oli selvittää profiilia vapautetuilla miRNA GC kudokset, arvioida niitä plasmanäytteissä ja arvioida mahdollisia kohdegeenien vapautettu miRNA. Käyttämällä TaqMan miRNA TLDA kortteja, johon kuuluu 377 miRNA alukkeita, löysimme 15 ilmentyvät eri miRNA välillä syöpä- GC ja terve mahalaukun kudoksia. Kahdeksan miRNA olivat alassäädetty (let-7a-5p, let-7 g-5p, miR-26b-5p, miR-30b-5p, miR-135a-5p, miR-148a-3p, miR-204-5p, miR -375), kun taas seitsemän miRNA oli säädelty (miR-146b-5p, miR-155-5p, miR-214-3p, miR-223-3p, miR-224-5p, miR-331-3p ja asennuspalveli- 484). Meidän profilointitulosten ei paljastanut joitakin yleisesti vapautettu miRNA, joita on aiemmin raportoitu vapautettu muissa tutkimuksissa, mukaan lukien miR-21-5p, miR-25-3p, miR-92a-3p, miR-29c-3p, ja toiset [15] [19] [14]. Yksi mahdollisista selityksistä nämä puuttuvat miRNA saattaa liittyä erittäin tiukan tilastollisen kriteerit, jotka haettiin TLDA analysointiin tietojemme (FDR oikaistu p-arvo < 0,01 ja taita muutos > 2). Lisäksi jonkin verran eroja miRNA profilointi tulosten joukossa tutkimusten saattaa johtua eroista anatominen sijainti mahassa, histologinen alatyyppi, tilastollinen analyysi ja erityisesti profilointi menetelmiä [18]. Tekemässä tutkimuksessa Mestdagh et al. osoittaa, että eri alustoilla on miRNA profilointi on eri havaitseminen hinnat, spesifisyys ja toistettavuus, ja että sopivin alustan olisi valittava sen perusteella, kokeellisten asetus ja erityiset tutkimuskysymykset (Mestdagh et al., 2014).

toisessa vaiheessa Tutkimuksemme käytimme qRT-PCR replikointi kohortissa joista kuusi vapaimpiin miRNA päässä profiloinnin vaihe (miR-135a-5p, miR-148a-3p, miR-155-5p, miR-204-5p , miR-223-3p ja miR-375). Osoitimme, että miR-148a-3p, miR-204-5p, miR-223-3p ja miR-375 oli johdonmukaisesti vapautui välillä normaalin ja syöpä- GC kudoksiin. Tulokset meidän lisääntymään kohortin tukevat aikaisempien raporttien. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että miR-148a-3p merkittävästi säädellä vähentävästi GC solulinjoissa ja kudosnäytteitä verrattuna viereiseen normaaleissa kudoksissa [42] [43]. Alhainen ekspressiotasot miR-375 on myös raportoitu tutkimuksista, olettamalla että miR-375 liittyi mahasyövän [44] [16]. Havaitsimme, että miR-223-3p oli merkitsevästi säädellään ylöspäin GC kudoksessa verrattuna normaaliin kudokseen, minkä useat aiemmissa raporteissa [15] [19]. MiR-204-5p on harvemmin raportoitu GC miRNA profilointi tutkimukset; kuitenkin tuloksemme ovat sopusoinnussa aiemman tutkimuksen, joka osoitti merkittävää säätely alaspäin tämän miRNA GC kudosten ja GC solulinjat [45]. MiR-135a-5p ilmentyminen oli matalampi GC kudoksissa kuin verrokeilla; kuitenkin havaittu alassäätöä suuntaus oli samanlainen Aiempien raporttien [15] ja ehkä saavuttanut tarvitaan merkityksellistä suurempi määrä yksilöiden ryhmissä. On syytä huomauttaa, että emme havainneet eroja miR-155-5p meidän lisääntymään kohortissa vertaamalla verrokeilla ja GC potilaita. Todennäköisesti tämä havainto liittyy siihen, että vuonna alkuarvioinnissa kohortin verrokeilla oli H
. pylori
vapaa, kun taas replikoinnin joukko, jotkut verrokeilla oli positiivinen serologia tätä bakteeria. On hyvin tunnettua, että miR-155-5p on mukana tulehduksellinen reittejä, mukaan lukien H
. pylori
gastriitti [46]; Siksi, tämä saattaa antaa tietty bias tuloksemme. Tuloksemme ovat linjassa aiempien tutkimuksessa Link et al. (2015), jossa ero ilmaus miR-155 koepalat GC kontrolleihin verrattuna ei ollut tilastollisesti merkitsevä [18]. Vuonna replikointi vaiheessa meidän miRNA profiloinnin tutkimuksessa valittu vain kuusi miRNA, joka osoitti korkeimman biologista merkitystä ja tilastollista merkittävyyttä. Olemme yhtä mieltä siitä, että olisi syytä tarkastella kaikkia merkittävästi vapautettu miRNA ja joka voisi olla potentiaalinen tehtävä lisätutkimuksia.

tutkimiseksi mahdollinen rooli ilmentyvät eri miRNA biomarkkereina GC, analysoimme vapautettiin miRNA vuonna plasmanäytteet. Kiertävä miRNA, erityisesti yhdistelmä useiden miRNA, voi esittää lupaavina biomarkkereita diagnosoimiseksi ruoansulatuskanavan syöpien [21]. Tutkimus Zhu et al. osoittivat, että paneelin viisi miRNA voi toimia mahdollisena biomarkkereiden havaitsemisessa aikaisessa vaiheessa GC [47]. Tähän mennessä raportoitu miRNA profiileja GC seerumissa tai plasmassa vaihtelee huomattavasti eri erillisiä tutkimuksia [21].

• PLoS ONE: Prediction Malli mahasyövän insidenssi Korean Väkiluku
• PLoS ONE: roolit DPY30 in leviämisen ja Liikkuvuus mahasyöpä- Cells