Abstrakt
Baggrund
MikroRNA'er (miRNA) er almindeligt studerede ikke-kodning RNA, der modulerer genekspression. MiRNA er dereguleret i forskellige tumorer, herunder gastrisk cancer (GC) og har potentielle diagnostiske og prognostiske implikationer. Formålet med vores undersøgelse var at bestemme miRNA profil i GC væv, efterfulgt af evaluering af deregulerede miRNA i plasma af GC patienter. Brug tilgængelige databaser og bioinformatiske metoder, vi også havde til formål at vurdere de potentielle target gener af bekræftet differentielt udtrykte miRNA og validere disse resultater i GC væv.
Undersøgelsen omfattede 51 GC patienter og 51 kontroller. Indledningsvis screenede vi miRNA ekspressionsprofil i 13 vævsprøver af GC og 12 normale gastriske væv med TaqMan lav densitet array (TLDA). I anden fase blev differentielt udtrykte miRNA valideret i en replikering kohorte hjælp QRT-PCR i vævs- og plasmaprøver. Efterfølgende analyserede vi potentielle target gener af deregulerede miRNA bruger bioinformatik tilgang, bestemmes deres udtryk i GC væv og udført korrelationsanalyse med at målrette miRNA.
Profilering med TLDA afslørede 15 deregulerede miRNA i GC væv sammenlignet med normal gastrisk mucosa. Replication analyse bekræftede, at miR-148a-3p, miR-204-5p, miR-223-3p og miR-375 blev konsekvent dereguleret i GC væv. Analyse af GC patienternes plasmaprøver viste signifikant nedregulering af miR-148a-3p, miR-375 og opregulering af miR-223-3p sammenlignet med raske frivillige. Endvidere bruger bioinformatiske værktøjer vi identificeret mål for replikerede miRNA og udførte sygdom-associeret gen berigelse analyse. I sidste ende, vi vurderet potentielt mål gen BCL2 Vores undersøgelse viste miRNA profil i GC væv og viste, at miR-148a-3p, miR-223-3p og miR-375 er dereguleret i GC plasmaprøver, men disse cirkulerende miRNA viste relativt svag diagnostiske ydeevne som eneste biomarkører. Target gen-analyse viste, at BCL2 Henvisning:. Juzėnas S, Saltenienė V, Kupcinskas J, Link A , Kiudelis G, Jonaitis L, et al. (2015) Analyse af dereguleret microRNA og deres mål Gener i Gastric Cancer. PLoS ONE 10 (7): e0132327. doi: 10,1371 /journal.pone.0132327 Redaktør: Lin Zhang, University of Pennsylvania School of Medicine, UNITED STATES Modtaget den 22. april 2015; Accepteret: 13 Juni 2015; Udgivet: Juli 14, 2015 Copyright: © 2015 Juzėnas et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer Finansiering:. Dette arbejde af JK, LJ, SiJu, LK, blev JS støttes af den Europæiske Socialfond No. VP1-3.1-SMM-07-K-01 -156. Arbejdet med PM er støttet af tyske Forbundsministeriet for Uddannelse og Forskning inden for rammerne af ERA-Net PathoGenoMics. Grant No: BMBF-0315905D. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser Introduktion opdagelsen af microRNA (miRNA) og etablering af deres rolle i molekylære veje har bragt en enorm fremgang i molekylærbiologi [1] [2]. Disse små ikke-kodende RNA'er bestående af ~ 22 bp er involveret i post-transkriptionel regulering af genekspression. MiRNA er kendetegnet ved høj stabilitet i biologiske prøver gør disse molekyler et attraktivt mål i biomarkører forskningsfelt [3] [4]. Akkumulerende beviser for, at miRNA er involveret i større carcinogenese veje [5]. Tidligere undersøgelser har vist, at deregulering af miRNA sker stort set i alle større typer af kræft [5] [6]. Endvidere har miRNA vist sig at have et diagnostisk eller prognostisk betydning og endda potentielle kliniske implikationer for målrettet genterapi hos kræftpatienter [7] [8]. Incidensen af gastrisk cancer (GC) i de vestlige lande har faldet i de seneste årtier; Men denne form for kræft stadig tegner sig for næsten en million af nye tilfælde sygdom på verdensplan og bærer en meget høj dødelighed [9]. Nyere forskning på GC har afsløret mange nye indsigter i patogenesen af denne malignitet. Ikke desto mindre er de nøjagtige mekanismer for malign transformation fra Helicobacter pylori Den afgørende rolle miRNA i GC er blevet vist i forskellige undersøgelser [12]. Volinia et al. har givet en af de første miRNA udtryk profiler i GC væv viser en specifik deregulering mønster [13]. Yderligere undersøgelser har også rapporteret betydelig deregulering af miRNA tilhører miR-17, miR-21, miR-223, miR-135 og mange andre familier. Blandt rapporterede studier i GC væv, mir-21, mir-25, mir-92, mir-223 var de mest konsekvent opreguleres miRNA, mens MIR-375 og MIR-148 var den mest konsekvent nedreguleres [14] [ ,,,0],15] [16]. De fleste af disse undersøgelser har set på miRNA profil hos patienter med GC og parret tilstødende normale gastrisk mucosa [14]. Vigtige undersøgelser har vist, at miRNA allerede dereguleret i tidlige stadier af gastrisk carcinogenese herunder H Målet med vores nuværende undersøgelse var at bestemme miRNA profil i GC væv og sammenligne det med den normale sunde maveslimhinden hjælp bred dækning miRNA TaqMan lav densitet arrays. I yderligere analyse, vi havde til formål at validere vores profilering resultater i væv og plasma af en større gruppe af GC patienter og raske kontrolpersoner af europæisk afstamning. I sidste ende, vi vurderet de potentielle målgener af bekræftede differentielt udtrykte miRNA og udførte sygdomsfri forening gen berigelse analyse af deres målgener. Etik erklæring undersøgelsen blev godkendt af Kaunas Regional Biomedical Research Ethics Committee (protokol nr BE-2-10). Alle patienter underskrev et informeret samtykkeerklæring til at deltage i undersøgelsen. Vævsprøver blev prospektivt indsamlet mellem 2011 og 2014 i departementerne Gastroenterology og Kirurgi, Sygehus litauisk University of Health Sciences (Kaunas, Litauen). Undersøgelsen omfattede i alt 51 kontrolpersoner og 51 GC patienter, som blev inddelt i profileringen (GC, n = 13; kontrol, n = 12) og validering kohorter (GC, n = 38; kontrol, n = 39). Alle individer var af europæisk afstamning. Gastric biopsi prøver blev indhentet fra antral del af maven fra kontrolpersoner, der blev henvist til øvre GI endoskopi grund dyspeptiske symptomer og havde ingen tidligere malignitet. GC vævsprøver blev opnået fra kirurgiske prøver umiddelbart efter resektion fra patienter, der gennemgår primær kirurgi for GC uden præoperativ bestråling og kemoterapi. Gastrisk adenocarcinom i GC patienter blev bekræftet ved histologi og klassificeret i henhold til Lauren i diffus og tarm typer [22]. H forberedelse Tissue prøve og RNA-ekstraktion gastriske vævsprøver blev opbevaret i RNAlater (Ambion, Austin , TX, USA) ved + 4 ° C og 24 timer senere opbevaret ved -80 ° C. 30 mg væv blev homogeniseret i steril tilstand før total RNA-isolering med Mirvana miRNA Isolation Kit (Ambion, Austin, TX, USA) til profilering undersøgelse og miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) til validering undersøgelse ifølge den fabrikanternes instruktioner. Kvaliteten af RNA blev vurderet ved hjælp af NanoDrop 2000 spektrofotometer (Thermo Scientific, USA). Kvalitativ undersøgelse af RNA integritet blev udført ved elektroforese på agarosegel (5%). Plasmaprøver blev indsamlet fra sundhedsmæssige patienter og patienter med GC. Den miRNA udtryk i plasma kohorte bestod af plasmaprøver fra 38 mavecancerpatienter og 39 raske frivillige. Venøst blod blev opsamlet i EDTA-antikoagulation vakuumrør og blev centrifugeret ved 3500 rpm i 15 minutter ved stuetemperatur; separerede plasma blev overført til 1,5 ml rør og anbragt i en -80 ° C fryser til kortvarig opbevaring. Små RNA'er blev ekstraheret fra 200 pi plasma ved hjælp af miRNeasy Serum /plasma Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) i henhold til fabrikantens anvisninger. miRNA profilering blev udført med TaqMan Array menneskelige miRNA Card Et v2.1 som gjorde det muligt at kvantificere 377 menneskelige miRNA katalogiseret i miRBase v20 [23]. Kort fortalt, 350 ng af total RNA blev oprindeligt revers transkriberet under anvendelse af Megaplex RT sat Pool En version 2.1 (Applied Biosystems, Carlsbad, Californien, USA) og 800 pi cDNA produkt blev derefter fyldt på TaqMan Array Humant miRNA Card og kørt på den VIIa 7 Real-Time PCR System (Applied Biosystems). Primær analyse blev udført ved hjælp af VIIa 7 Software (Applied Biosystems) for at få udtryk i form af Ct. Dataanalyse blev udført under anvendelse BioConductor HTqPCR pakke [24]. MiRNA med en Ct-værdi > 37 blev betragtet ikke-amplificeret. MiRNA som ikke blev amplificeret i mere end 25% af prøverne blev anset for at være ringe udtrykkes, og derfor udelukket fra yderligere analyse. Mirna udtryk data normaliseret ved hjælp rang invariant normalisering. NormFinder og geNorm algoritmer blev brugt til at identificere en reference gen fra TLDA data for validering undersøgelse [25]. Ifølge algoritmer miR-127-3p viste laveste Ct varians og blev valgt som reference gen for valideringsundersøgelsen. Nylige undersøgelser viser, at ekspressionsniveauerne af RNU6A og nogle andre små nukleare RNA kan være ustabil i visse væv og betingelser, og kan ikke tjene som bedste reference gener [26] [27] [28] [29]. En nylig publikation har også identificeret miR-127-3p som en god kandidat for reference gen valg [30]. Omvendt transskription (RT ) reaktioner blev udført under anvendelse TaqMan miRNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, Californien, USA) og miRNA-specifikke RT hårnåle-primere (Applied Biosystems, Carlsbad, Californien, USA). Singleplex reaktioner blev udført i et volumen på 7,5 pi. Hver reaktion omfattede 2,08 pi nukleasefrit vand, 0,74 gl 10 × RT buffer, 0,08 pi dNTP'er (100 mM), 1,5 pi 5 × miRNA-specifikke RT-primere, 0,1 pi RNase-inhibitor, 0,5 pi Multiscribe revers transkriptase og en fast mængde miRNA skabelon (2,5 pi). RT blev udført i en thermocycler under følgende betingelser: 16 ° C i 30 min, 42 ° C i 45 minutter og 85 ° C i 5 minutter, efterfulgt af et lastrum ved 4 ° C TaqMan real. -tid PCR-reaktioner blev udført dobbelt reaktioner, omfattende 6,25 pi TaqMan 2 × Universal PCR Master mix med nr AmpErase UNG (Applied Biosystems, Carlsbad, Californien, USA) 0,625 pi 20 × miRNA-specifik primer og probe mix af TaqMan miRNA Assay Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, Californien, USA), 3 pi af revers transkriptionsproduktet og 2,625 pi nuclease frit vand. RT-PCR blev udført ved anvendelse af en 7500 Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Carlsbad, Californien, USA) under følgende betingelser: 95 ° C i 10 minutter, derefter 40 cykler ved 95 ° C i 15 s, 60 ° C i 60 s, efterfulgt af et lastrum ved 4 ° C. Hver prøve blev kørt in duplo. Dataene blev analyseret med automatiske indstillinger for tildeling basislinjen, og de gennemsnitlige Ct og SD-værdier blev beregnet. Ekspressionsniveauet af miRNA i vævet blev normaliseret til MIR-127-3p og ekspressionsniveauet i plasma blev normaliseret til HSA-MIR-16-5p. Resultaterne blev beregnet under anvendelse af ΔΔCT metoden [31]. Data blev analyseret med automatiske indstillinger for tildeling baseline, og de gennemsnitlige Ct og SD-værdier blev beregnet. cDNA for BCL2 lister over validerede target gener af kandidatlandenes miRNA blev opnået fra miRTarbase v4.5 (mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw) og miRecords v4.0 (mirecords.biolead.org) databaser. Gene-sygdom forening data blev hentet fra DisGeNET database (http://www.disgenet.org/). For at identificere GC-associerede gener udtrykket "gastrisk adenocarcinom" (umls: C0278701) blev anvendt som forespørgsel til databasen. Biologiske netværk blev oprettet ved hjælp af Cytoscape v3.2 open source software med CyTargetLinker ansøgning [32]. De kliniske karakteristika mellem grupper blev sammenlignet ved hjælp af χ miRNA udtryk profilering af GC og sund maveslimhinden væv ved TLDA TaqMan Menneskelig miRNA Low-Density array analyse blev udført for at identificere kandidat miRNA udviser ændret ekspression i gastrisk cancer væv. Tissue miRNA profiler fra GC patienter blev sammenlignet med profiler af maveslimhinden fra raske individer. Efter filtrering for lav rigelige miRNA (Ct værdi > 37 og ikke-påviselige i over 25% af prøverne), et sæt af 193 miRNA (fra total 377) forblev til yderligere analyse. En sammenligning af kræft versus normalt væv identificeret 15 differentielt udtrykte miRNA, hvoraf 7 blev opreguleret og 8 blev nedreguleret med FDR justeret p-værdi < 0,01 og fold forandring > 2 (tabel 2). Resultaterne er påvist i vulkan plot (figur 1). Blandt disse, 6 miRNA (miR-135a-5p, miR-148a-3p, miR-204-5p, miR-375, miR-223-3p og miR-155-5p), der viser den højeste betydning og fold ændre værdier, blev udvalgt til valideringsundersøgelsen. Hierarkisk klyngedannelse under euklidisk afstand af udvalgte miRNA normaliseret udtryk data afslørede to undergrupper: Den ene svarer til kontrolgruppen og den anden svarer hovedsagelig til den patientgruppe. (Figur 2). De seks ansøgerlande miRNA udvalgt til kontrol blev kvantificeret ved hjælp af QRT-PCR. For reference gen valg af TLDA data blev analyseret ved hjælp af to forskellige algoritmer (NormFinder og geNorm) for at identificere reference- gener. MIR-127-3p viste højeste udtryk stabilitet på tværs af alle prøverne i TLDA data og på grund af denne funktion miR-127-3p blev valgt som reference gen at normalisere qPCR data. Ekspressionsniveauerne af MIR-148a-3p, MIR-204-5p, MIR-223-3p og MIR-375 viste signifikant differentiel ekspression i den samme retning som i opdagelsen undersøgelse (FDR justeret p < 0,05), mens ingen signifikant forskelle blev påvist i ekspressionsniveauerne af miR-135a-5p og miR-155-5p (FDR justeret p > 0,05, fig 3) Plasma miRNA som potentielle biomarkører for mavekræft Target gen forudsigelse For yderligere at undersøge de mulige mål for miR-148a-3p, miR-204-5p, MIR-223- 3p og miR-375, alle deres eksperimentelt validerede miRNA målgruppen interaktioner blev opnået fra to forskellige databaser (miRTarbase og miRecords). Dataene blev visualiseret i Cytoscape som et biologisk netværk indeholdende alle de nævnte miRNA og deres target interaktioner (Fig 5). Hver interaktion i netværket bestod af to noder, en regulerende miRNA node (rød) og et mål mRNA node (lyserød) tilsluttet via en rettet kant. Samlet set netværket omfattede 593 validerede targets, 419 af dem tildelt miR-375, 88 overdraget til miR-204-5p, 83 overdraget til miR-148a-3p og 21 tildelt miR-223-3p. Netværket analyse viste, at miR-148a-3p og miR-375 havde seks delte mål (MPP5, DNMT3B, PAPD4, RASSF8, PBXIP1 og RAB10), miR-204-5p og miR-375 havde også seks delte mål (SERP1, CTSC , EFNB2, HSP90AA1, TCF12 og IL1RAP), miR-148a-3p og miR-204-5p havde to delte mål (AURKB og Cdc25B), miR-223-3p og miR-148a-3p havde også to delte mål (HSP90B1 og IRS1), mIR-223-3p og mIR-375 havde en delt target (PARP1) og mIR-148a-3p, mIR-204-5p og mIR-375 havde også en delt target (BCL2). Target gener, der var reguleret samtidig af to eller tre miRNA er repræsenteret i appelsin og grønne farver, henholdsvis (figur 5). For at identificere, om sygdommen associeret gener blev signifikant beriget i vores sæt miRNA mål, udførtes berigelse analyse. Først blev listen genet hentet fra DisGeNet database. Som forespørgsel til databasen vi brugte udtrykket "gastrisk adenocarcinom" (umls: C0149826). Efter at bortfiltrere miRNA, lncRNA og gener, som ikke var i miRTarbase og miRecords, 115 gener blev identificeret til at være forbundet med GC. I netværket analyse 20 af GC-associerede gener blev overlappet, 4 (BCL10, YAP1, IGFBP3 og JAG1) af dem tildelt miR-375, 6 (IL8, MMP9, IL1B, CDX2, SERPINE1 og SPARC) tildelt miR-204 -5p, 4 (CDKN1B, APC, NR1I2 og CCKBR) tildelt miR-148a-3p og 2 (STMN1 og IGF1R) tildelt miR-223-3p. Målgener, som var forbundet med GC er repræsenteret i blåt (figur 5). Endelig blev sygdom-associeret gen berigelse analyse udført under anvendelse af et hypergeometriske fordeling-baseret test, som førte til at vurdere, hvorvidt antallet af GC-associerede gener er større end forventet i det sæt af målgener af udvalgte miRNA. Berigelse analyse viste, at GC-associerede gener var betydeligt overrepræsenteret (p < 0,05) i miR-148a-3p, miR-204-5p og miR-223-3p, mens nogen signifikant berigelse blev observeret i MIR-375 målgener (p > 0,05) (tabel 3) BCL2 diskussion Altered miRNA udtryk profiler har. blevet rapporteret i GC vævs- og blodprøver [13] [20] [14] [38]. Nogle af disse deregulerede miRNA har været forbundet med overlevelse, metastatisk adfærd tumor og andre klinisk-patologiske træk af GC [39] [40]. Endvidere har miRNA blevet vist at regulere tumorvækst ved at påvirke proliferation, adhæsion, invasion og migration i GC cellelinier [41]. Endnu vigtigere er, er target gener af deregulerede miRNA i GC involveret i apoptose, cellecyklus og andre vigtige carcinogenese veje [12]. Derfor kan undersøgelse af miRNA og deres mulige målgener i GC tjene til videreudvikling af vigtige alternativer diagnostiske og behandlingsmæssige. Det er klart, at miRNA er vigtige aktører i gastrisk carcinogenese, men vi mangler stadig præcise data om de mekanismer og potentielle kliniske anvendelser af disse molekyler i GC. Vores nuværende undersøgelse havde til formål at bestemme profilen af deregulerede miRNA i GC væv, vurdere dem i plasmaprøver og evaluere potentielle target gener af liberaliserede miRNA. Brug TaqMan miRNA TLDA kort, der omfatter 377 miRNA primere, fandt vi 15 differentielt udtrykte miRNA mellem kræft GC og sunde gastriske væv. Otte miRNA blev nedreguleret (lad-7a-5p, lad-7 g-5p, miR-26b-5p, miR-30b-5p, miR-135a-5p, miR-148a-3p, miR-204-5p, miR -375), mens syv miRNA var opreguleret (miR-146b-5p, miR-155-5p, miR-214-3p, miR-223-3p, miR-224-5p, miR-331-3p og miR- 484). Vores profilering resultater ikke afsløre nogle af de almindeligt liberaliserede miRNA, der tidligere er blevet rapporteret til at blive dereguleret i andre undersøgelser, herunder miR-21-5p, miR-25-3p, miR-92a-3p, miR-29c-3p, og nogle andre [15] [19] [14]. En af de mulige forklaringer på disse manglende miRNA kan være forbundet med meget strenge statistiske kriterier, der blev ansøgt om TLDA analyse af vores data (FDR justerede p-værdi < 0,01 og fold forandring > 2). Desuden kan en vis grad af uoverensstemmelsen i miRNA profilering resultater blandt undersøgelserne skyldes forskelle i anatomiske placering af maven, histologiske undertype, statistisk analyse og især profilering metoder [18]. En undersøgelse foretaget af Mestdagh et al. viser, at forskellige platforme af miRNA profilering har forskellige afsløring satser, specificitet og reproducerbarhed, og at den mest passende platform bør vælges på grundlag af den eksperimentelle indstilling og de specifikke forskningsspørgsmål (Mestdagh et al., 2014). i den anden fase af vores undersøgelse, vi brugte QRT-PCR i replikation kohorte herunder seks mest deregulerede miRNA fra profilering fase (miR-135a-5p, miR-148a-3p, miR-155-5p, miR-204-5p , miR-223-3p og miR-375). Vi viste, at miR-148a-3p, miR-204-5p, miR-223-3p og miR-375 konsekvent blev dereguleret mellem normale og ondartede GC væv. Resultaterne af vores replikation kohorten understøttes af tidligere rapporter. Flere undersøgelser har vist, at MIR-148a-3p signifikant nedreguleret i GC cellelinjer og vævsprøver forhold til de tilstødende normale væv [42] [43]. Lave ekspressionsniveauer af MIR-375 blev også rapporteret af undersøgelser, hypoteser, at MIR-375 var forbundet med gastrisk carcinogenese [44] [16]. Vi identificerede, at MIR-223-3p var signifikant opreguleret i GC væv sammenlignet med normalt væv, som foreslået af flere tidligere rapporter [15] [19]. MIR-204-5p er blevet mindre hyppigt rapporteret i GC miRNA profilering undersøgelser; alligevel, vores resultater er på linje med en tidligere undersøgelse, der viste signifikant nedregulering af denne miRNA i GC væv og GC-cellelinjer [45]. MIR-135a-5p udtryk var lavere i GC væv end i kontrolgruppen; var imidlertid ligner tidligere rapporter [15] den observerede nedregulering tendens og måske har nået krævet betydning med et højere antal personer i grupperne. Det er værd at påpege, at vi ikke finde forskelle for miR-155-5p i vores replikation kohorte sammenligner kontrolpersoner og GC-patienter. Mest sandsynligt dette fund er forbundet med det faktum, at der i den indledende profilering kohorte, kontrolpersoner var H For at undersøge den potentielle rolle for differentielt udtrykte miRNA som biomarkører i GC, analyserede vi dereguleret miRNA i plasmaprøver. Cirkulerende miRNA, især kombinationen af flere miRNA, kan vise sig som lovende biomarkører til diagnosticering af gastrointestinale kræftformer [21]. En undersøgelse foretaget af Zhu et al. påvist, at et panel af fem miRNA kan tjene som en potentiel biomarkør ved detektering tidligt stadium GC [47]. Til dato, rapporterede miRNA profiler i GC serum eller plasma varierer betydeligt blandt separate undersøgelser [21].
DNMT3B
udtryk ved QRT-PCR i GC væv, som korrelerede med at målrette miRNA udtryk.
Konklusioner
DNMT3B
udtryk i GC væv korreleret med deres målretning miRNA udtryk
( H
. pylori
) infektion til kronisk atrofisk gastritis, intestinal metaplasi og GC er stadig dårligt forstået [10 ]. Aktuel hypotese af GC udvikling indebærer kombinerede effekter af bakteriel, vært og ernæringsmæssige faktorer; Men til dato, denne teori foreslår meget få klinisk sunde translationelle konsekvenser [11]. De fleste af GC tilfælde er diagnosticeret i sene stadier af sygdommen, som er forbundet med dårlige patientresultater. Derfor er en af de største fokuserer GC forskning er evalueringen af potentielle molekylære biomarkører, der kan anvendes for tidlige ikke-invasiv diagnostik af denne malignitet.
. pylori
gastritis og præmaligne stadier af gastrisk atrofi og intestinal metaplasi [17] [18]. Interessant nok nogle af miRNA har modsatte deregulering retninger i nærvær af GC, som separate profilering undersøgelser viser signifikant uoverensstemmelse mellem deregulerede miRNA [14]. MIR-9 viste sig at være opreguleret i to undersøgelser [15] [19], mens to andre papirer viste signifikant nedregulering af denne miRNA i GC væv [13] [20]. Disse uoverensstemmelser vedrørende modsatte deregulering resultater for miR-9 og mange andre miRNA er mest sandsynligt knyttet til forskelle i anatomiske placering af GC, histologiske undertype, sygdom fase, profilering platforme, statistisk analyse og mange andre potentielle forstyrrende faktorer. Desuden er størstedelen af aktuelt publicerede undersøgelser om miRNA profil i GC væv dækker emner fra asiatiske lande; i mellemtiden, er stadig sparsomme data om europæiske GC patienter [21].
Materialer og metoder
studiepopulation
. pylori
status blev vurderet i GC og kontrolpersoner ved indirekte ELISA til påvisning af serum-IgG-antigen (Virion /Serion GmbH, Wünrzburg, Tyskland). Kliniske og patologiske karakteristika for de patientkohorter herunder alder, køn og sygdommens stadie er sammenfattet i tabel 1.
Plasma prøveforberedelse og RNA-ekstraktion
miRNA hjælp af TaqMan Low-Density Array
Kvantitativ revers transkription polymerase kædereaktioner (QRT-PCR)
DNMT3B
genekspression analyse blev syntetiseret fra 500 ng af RNA ved hjælp af en High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Carlsbad, Californien, USA). Singleplex reaktioner blev udført i et volumen på 7,5 pi. Hver reaktion omfattede 2,1 pi nukleasefrit vand, 1 pi 10 x RT-puffer, 0,4 pi dNTP'er (100 mM), 1 pi 10 × RT Tilfældige primere, 0,5 pi Multiscribe Revers transkriptase og en fast mængde miRNA skabelon (2,5 pi). RT-PCR blev udført i en thermocycler under følgende betingelser: 25 ° C i 10 minutter, 37 ° C i 120 min og 85 ° C i 5 minutter, efterfulgt af et lastrum ved 4 ° C. Før qPCR cDNA-prøver blev fortyndet 1: 1 med nuclease frit vand og 2 pi anvendes i 10,5 pi RT-qPCR reaktioner sammen med 6,25 pi 2x TaqMan Hurtig Universal Master mix (Life Technologies, Carlsbad, Californien, USA), 0,625 pi 20x TaqMan Gene Expression Assay (Life Technologies, Carlsbad, Californien, USA) og 3,625 pi sterilt vand. RT-qPCR assays blev kørt i tre eksemplarer på en 7900HT Hurtig Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Carlsbad, Californien, USA) under følgende betingelser: 95 ° C i 10 min, derefter 40 cykler af 95 ° C i 15 s, 60 ° C i 60 s, efterfulgt af et lastrum ved 4 ° C. Ekspressionsniveauerne af BCL2
DNMT3B
i vævet blev normaliseret til ACTB
.
Target gen netværksanalyse
Statistisk analyse
2 test og Fishers eksakte test for kvalitative data, og t-test for kvantitative data. Den TLDA data blev analyseret ved hjælp af t-test og Benjamini Hochberg korrektion for falsk opdagelse sats således at forskellen udtryk blev anset for at være betydelig med en p < 0,01. Dataene blev normaliseret ved hjælp rang invariant normalisering [33] og analyseret ved hjælp af HTqPCR pakken. Validerings- og plasma qPCR ekspression data blev analyseret under anvendelse parametrisk Mann-Whitney U-test. En Benjamini Hochberg justeret p < 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. For QRT-PCR-data, de relative ekspressionsniveauer af hvert mål miRNA (log2 relative niveau) blev beregnet efter forskellen i CT-værdier mellem målet miRNA og miR-127-3p i vævsprøver og miR-16-5p i plasmaprøver (ACt) [34]. Hypergeometric test blev anvendt til GC-associeret mål-berigelse analyse. En modtager operating characteristic (ROC) kurve blev genereret for hver miRNA hjælp ACt data. Arealet under kurven (AUC) værdi og 95% konfidensintervaller (CI) blev beregnet for at bestemme specificitet og følsomhed. At analysere diagnostiske værdi af kombinerede ændringer i plasma miRNA niveauer blev den univariate genekspression gennemsnitlig algoritme, der anvendes [35]. ROC-kurver blev genereret under anvendelse ROCR pakke [36]. Alle data analyser blev udført ved hjælp af R-version 3.1.1 software.
Resultater
miRNA validering i GC og sund maveslimhinden væv med QRT-PCR
Sygdom-associeret gen berigelse analyse
DNMT3B
overekspression og omvendt korrelation med at målrette miRNA i mavekræft væv
som en formodet mål for miR-148a-3p, miR-204-5p og miR-375 og DNMT3B
for miR-148a-3p og miR-375. Alle disse miRNA i vores undersøgelse fandtes at være nedreguleret i gastrisk cancer væv. For yderligere at understøtte disse resultater først udtrykket analyse af BCL2
DNMT3B
gener blev udført. Dataene i QRT-PCR viste signifikant stigning i ekspressionsniveauerne af både BCL2
DNMT3B
gener i mavekræft væv. BCL2
viste en 2,7 gange stigning, mens DNMT3B
havde en 16,7-fold stigning i mRNA-niveauer (figur 6). Pearsons korrelation analyse blev udført med henblik på at afsløre forholdet mellem BCL2
og DNMT3B
mRNA og deres målretning miRNA niveauer i normale og ondartede gastrisk væv (Fig 6). En omvendt korrelation blev observeret for begge de forudsagte DNMT3B
-targeting miRNA: MIR-375 (r = -0,49; p = 0,00001) og MIR-148a-3p (r = -0,26; p = 0,0328) . Der blev observeret en negativ korrelation mellem BCL2
og miR-375 (r = -0,32; p = 0,0116), mens der ikke blev fundet sammenhæng mellem BCL2
og miR-148a-3p (r = -0,06; p = 0,6631) eller BCL2
og miR-204-5p (r = -0,02; p = 0,8546)
. pylori
gratis, mens i replikation sæt, nogle af kontrolpersonerne havde positiv serologi for denne bakterie. Det er velkendt, at MIR-155-5p er involveret i inflammatoriske pathways herunder H
. pylori
gastritis [46]; derfor kan dette give en vis forspænding til vores resultater. Vores resultater er i tråd med tidligere undersøgelse af Link et al. (2015), hvor forskellen i ekspressionen af miR-155 i biopsier fra GC sammenlignet med kontroller ikke nåede statistisk signifikans [18]. I replikation fase af vores miRNA profilering undersøgelse valgte vi kun seks miRNA, som viste den højeste biologiske relevans og statistisk signifikans. Vi er enige, at det ville være umagen værd at se på alle betydeligt deregulerede miRNA og det kunne være en potentiel opgave i yderligere undersøgelser.
Stigende risiko for bioforsvar ved syntetisk biologi
Flagende potentielle molekylære forudsigere for reaktion på biologiske terapier ved ulcerøs colitis
Kost med lavt fermenteret kulhydrat forbedrer livskvaliteten for patienter med IBD
Undersøgelse belyser årsagerne til invaliderende tarmsmerter
Strategisering af pædiatrisk sundhedsberedskab til den anden bølge af COVID-19-pandemien
Forskning viser, at tarmparasitangreb reducerer sværhedsgraden af COVID-19
Infliximab kan hindre effektiviteten af nogle COVID-19-vacciner
Da mange lande bliver hårdt ramt af gentagne bølger af alvorlig akut respiratorisk syndrom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) infektion, med tilhørende høje symptomer på coronavirus-sygdom 2019 (COVID-19), fr
Visse bakteriearter kan øge hiv -risikoen hos kvinder,
finder en ny undersøgelse En nylig undersøgelse offentliggjort i Lancet infektionssygdomme, beskriver syv arter af vaginale bakterier, der kan øge risikoen for HIV -infektion betydeligt hos kvinder
Gode nyheder for IBS -syge, da forskere identificerer "tarmkløe"
Flinders University -forskere ved South Australian Health and Medical Research Institute har gjort en vigtig opdagelse om smerterne i tilfælde af irritabel tarmsyndrom (IBS). Billedkredit:B