Ploche ONE: microRNA-9 Potláča proliferácie, invázie a metastázy Žalúdočné nádorových buniek prostredníctvom zacielenia na cyklin D1 a Ets1

Abstract

Nedávne dôkazy ukazujú, že zmenená microRNA-9 (MIR-9) expresie sa podieľa na progresiu rakoviny žalúdka. Avšak, presné úlohy a príslušné mechanizmy Mir-9 v proliferácie, invázie a metastázy karcinómu žalúdka stále neznámy. V tejto štúdii sa zistilo, že mier-9, že je down-regulovaná a negatívne koreluje s expresiou cyklin D1 a v-ets erytroblastóza vírusu E26 onkogénu homológov 1 (Ets1) v žalúdočnej rakovinových tkanivách a bunkových líniách. Analýza Bioinformatika odhalil predpokladané MIR-9 väzobné miesta v 3'-nepřekládané oblasti (3'-UTR) cyklin D1 a Ets1 mRNA. Ektopická expresia alebo porazený MIR-9 za následok citlivo zmenené expresie cyklín D1, Ets1 a ich následných cieľov fosforylovaný retinoblastomovými a matričnej metaloproteinázy 9 v kultivovaných bunkových línií karcinómu žalúdka SGC-7901 a AGS. V luciferázového reporterového systému, MIR-9 priamo zameraná na 3'-UTR cyklin D1 a Ets1, a tieto účinky boli zrušené mutácií väzbové miesta MIR-9. Nadmerná expresia MIR-9 potlačil proliferáciu, inváziu a metastázovaniu SGC-7901 a AGS bunky in vitro stroje a in vivo
. Obnova MIR-9-sprostredkovanej down-regulácia cyklin D1 a Ets1 o prechodnú transfekciu, zachránil rakovinové bunky z poklesu proliferácie, migrácie a invázie. Navyše, anti-MIR-9 inhibítor podporoval proliferáciu, migráciu a inváziu buniek karcinómu žalúdka, zatiaľ čo klepanie dole cyklin D1 alebo Ets1 čiastočne phenocopied účinky Mir-9 over-expresie. Tieto údaje naznačujú, že mier-9 potláča expresiu cyklin D1 a Ets1 cez väzobné miesta na ich 3'-UTR, čím dochádzalo k inhibícii proliferácie, invázie a metastáz rakoviny žalúdka

Citácia :. Zheng L, Qi T, D Yang, Qi M, Li D, X Xiang et al. (2013) microRNA-9 Potláča proliferácie, invázie a metastázy žalúdočné nádorových buniek prostredníctvom zacielenia na cyklin D1 a Ets1. PLoS ONE 8 (1): e55719. doi: 10,1371 /journal.pone.0055719

Strih: Alejandro H. Corvalan, Pontificia Universidad Católica de Chile, Chile

prijatá: 14.septembra 2012; Prijaté: 29. decembra 2012; Uverejnené: 31.januára 2013

Copyright: © 2013 Zheng et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Financovanie :. Podporované Národná prírodná Science Foundation of China (No. 30600278, 30772359 Nie, No. 81071997, 81072073 Nie, No. 81272779), Program pre nové storočie vynikajúce talenty v University (NCET-06-0641), Scientific Research Foundation pre vrátil Overseas Chinese učenci (2008-889) a základný výskum fondy pre centrálnu univerzity (2012QN224). Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu

Konkurenčné záujmy: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

karcinóm žalúdka je štvrtou najčastejšou rakovinou na svete [1]. Napriek zlepšeniu chirurgických a multimodálne terapia, prognóza pokročilou rakovinou žalúdka zostáva chudobný vzhľadom k opakovaniu, invázie a metastáz, pričom miera prežitia 5 rokov nižší ako 30% [1]. Lepšie znalosti z mechanizmov podkladových progresiu nádoru je zaručené, objavovať nové vzory pre diagnostiku a liečbu rakoviny žalúdka [2]. MikroRNA (miRNA), nedávno identifikovaná kategórie malých a vysoko konzervovaných nekódovacích RNA, sa môžu podieľať na post-transkripčný regulácia génovej expresie prostredníctvom čiastočné komplementárne väzby s nepřekládané oblasti na 3 '(3'-UTR) cieľovej mRNA, čo vedie translačný represie alebo mRNA degradácia [3]. Objavujúce sa dôkazy ukazujú, že miRNA sa zúčastňuje biologických procesov spojených s apoptózy, proliferácie, diferenciácie, invázia a metastázy, zatiaľ čo deregulácia, ktorá má zásadný význam pre iniciáciu a postupu rakoviny [3]. V súčasnej dobe je naliehavo potrebné skúmať úlohu miRNA a ich cieľových génov v progresii nádoru u experimentálnych modeloch.

V ľudskej rakoviny žalúdka, množstvo miRNA boli hlásené ako aberantne nadmerne exprimované alebo down-regulované v priebehu progresie rakoviny žalúdka, vrátane MIR-21, [4], MIR-15b [5], MIR-16 [5], a mier-101 [6]. Tieto miRNA hrať onkogénne alebo nádorovo supresívnej úloha v regulácii bunkového rastu, migrácie a invázie potlačením svoje cieľové gény. Napríklad onkogénne Mir-21 je aberantne nadmerne exprimovaný u karcinómu žalúdka a zvyšuje proliferáciu a invazivitu buniek karcinómu žalúdka zacielením reverzie indukujúce cysteín bohaté na proteín kázal motívy [4]. Medzitým, Mir-15b a mier-16 sú down-regulované u karcinómu žalúdka, a prispievajú k mnohopočetné liekovej rezistencie buniek karcinómu žalúdka moduláciou apoptózy pomocou zacielenia B-bunkovej leukémie /lymfómu 2 [5]. Mier-101 je down-regulovaná v karcinómu žalúdka tkanív a bunkových línií, zatiaľ čo ektopická expresia MIR-101 významne inhibuje proliferáciu, migráciu a inváziu buniek karcinómu žalúdka zameraním zvýraznenie Zeste homológy 2, cytochróm c oxidázy podjednotky II a myeloidných bunkovej leukémie sekvencie 1 [6]. Z tohto dôvodu bolo ohnisko ďalej preskúmať expresiu a funkciu miRNA v nádorovom biológie rakoviny žalúdka.

microRNA-9 (MIR-9) sa prvýkrát identifikovaný ako jeden z rozhodujúcich regulátorov pre rozvoj , fyziológie a patológie nervovej sústavy v rôznych organizmov, vrátane Drosophila
, daní pruhované a cicavcov [7] - [9]. Rad ďalšie štúdie ukázali, že zmenená expresia MIR-9 je spojený s rozvoji a progresiu rakoviny [10] - [14]. Predchádzajúce štúdie naznačujú, že mier-9 je významne down-regulovaný u karcinómu žalúdka, z čoho vyplýva jeho potenciálnu úlohu v progresii nádoru [15] - [18]. To je tiež uvedené, že mier-9 môžu modulovať proliferáciu buniek karcinómu žalúdka prostredníctvom zacielenia na chvostovej typu homeoboxový 2 (CDX2) [19] a NF-kappa B (NF-kB) [16]. Avšak, presné funkcie a súvisiace mechanizmy Mir-9 v progresii karcinómu žalúdka ešte vyžadujú ďalšie skúmanie. V tejto štúdii sme demonštrovať, prvýkrát, že mier-9 priamo zameriava na cyklin D1 a v-ets erytroblastóza vírusu E26 onkogénu homológov 1 (Ets1), a potláča proliferáciu, inváziu a metastázovaniu buniek karcinómu žalúdka v vitro stroje a in vivo
.

Výsledky

MIR-9 bol down-regulované a negatívne koreluje s expresiou cyklin D1 a Ets1 v žalúdku rakovinových tkanív a bunkové línie

Pre zistenie expresie MIR-9, rakoviny žalúdka, rakovina žalúdka tkaniva a okolitom normálnom sliznice boli zhromaždené z 86 primárnych prípadov. Real-time kvantitatívne PCR reverznej transkripcie (RT-PCR), bolo zistené, že mier-9 bola down-regulované v žalúdočných rakovinových tkanivách, než je v priľahlej non-neoplastických sliznice ( P
= 0,001, obr. 1A). Mir-9 výraz bol v žalúdočných prípadov rakoviny výrazne nižšie s hlbším žalúdočnej steny invázie ( P Hotel <0,001), lymfatických uzlín ( P Hotel <0,001), vzdialených metastáz ( P
= 0,022), a pokročilé štádium TNM ( P
= 0,01) (tabuľka S1). Na rozdiel od toho sa zistili vyššie cyklin D1 a úrovne Ets1 transkriptov v žalúdočných rakovinových tkanivách ( P Hotel &0,0001 a P
. ≪. 0,0001, respektíve obr 1B a obr 1C). Došlo k inverzný korelácia medzi MIR-9 prejavu a cyklin D1 hladiny transkriptov v žalúdočných rakovinových tkanív ( P
. ≪ 0,001, obr 1D). Okrem toho, inverzný korelácia medzi MIR-9 prejavu a úrovní Ets1 transkriptov bolo tiež uvedené v týchto rakovinových tkanivách ( P
. ≪ 0,001, obr 1e). Nižšia Mir-9 a vyššie hladiny expresie transkriptov cyklin D1 a Ets1 boli pozorované v žalúdočných rakovinové bunkové línie, ako tie, ktoré v normálnej žalúdočnej epitelových GES-1 buniek [20] (viď obr. 1F). Imunohistochemické farbenie bolo vykonané pozorovať expresiu cyklin D1 a Ets1 v týchto rakovinových vzoriek (viď obr. S1). Jadrová cyklin D1 bola pozorovaná u 26/86 (30,2%) prípadoch, zatiaľ čo jadrová energia a cytoplazmy farbenie Ets1 bolo pozorované u 58/86 (67,4%) prípadoch (tabuľka S1). Imunoreaktivita cyklin D1 a Ets1 bola významne vyššia u prípadov rakoviny žalúdka hlbší žalúdočnej steny invázie ( P Hotel &0,001 a P
= 0,001), lymfatických uzlín ( P Hotel < 0,001 a P Hotel <0,001), vzdialených metastáz ( P Hotel < 0,001 a P Hotel <0,001), a pokročilé štádium TNM ( P Hotel < 0,001 a P
= 0,004) (tabuľka S1). Nižšia MIR-9 expresie bola pozorovaná u žalúdočných rakovinových tkanív s vyšším immunostaining cyklin D1 ( P Hotel <0,0001, obr 1G.) Alebo Ets1 ( P
. ≪ 0,0001, obr 1H ). Tieto výsledky ukazujú, že mier-9 bola down-regulované a negatívne koreluje s expresiou cyklin D1 a Ets1 v karcinómu žalúdka tkanivách a bunkových líniách.

MIR-9 down-regulované expresie cyklín D1 a Ets1 prostredníctvom pošty -transcriptional represie

Ak chcete skúmať hypotézu, že mier-9 môžu ovplyvniť expresiu cyklin D1 a Ets1 u karcinómu žalúdka, výpočtová predikcia bola vykonaná databáz miRNA. Potenciálnych väzobných miest pre mier-9 s vysokým komplementarity boli zaznamenané na základniach 2974-2995 na cyklin D1 3'-UTR a 2648-2670 zo Ets1 3'-UTR (obr. 2A). Vyšetrovať priame účinky Mir-9 na expresiu cyklin D1 a Ets1 v nádorových bunkách žalúdka, sme vykonali cez expresie miRNA experimenty. Stabilná transfekcia MIR-9 prekurzoru do SGC-7901 a AGS bunky viedlo k zvýšeniu hladín MIR-9 (obr. S2). Western blot, RT-PCR v reálnom čase kvantitatívne RT-PCR preukázané, že zvýšená expresia MIR-9 viedlo k zníženiu proteínu a transkripčný hladiny cyklin D1 a Ets1 v žalúdočnej nádorových bunkách, ako sú prenesené s negatívnym kontrolným vektorom (mock) ( obr. 2B, obr. 2C a obr. 2D). Okrem toho hladiny fosforylovaného retinoblastomem (pRb, následný efektor cyklin D1) [21] a matrix metaloproteinázy 9 (MMP-9, následný gén Ets1) [22] boli znížené v Mir-9 exprimujúcich rakovinových buniek (obr. 2B, obr. 2C a obr. 2D). Ďalej skúmať supresívny úlohu Mir-9 v expresiu cyklin D1 a Ets1 sme vykonali porazený pokusy MIR-9 transfekcia anti-MIR-9 alebo inhibítory negatívna kontrola (anti-NC) do GES-1, SGC -7901 a AGS buniek. Transfekcia inhibítora proti-MIR-9, samozrejme znižuje endogénne MIR-9 expresiu (Obr. S3A), a up-regulované úrovne proteínu cyklín D1, PRB, Ets1 a MMP-9, než ktoré sú prenesené s anti-NC (obr. 2E a obr. S4A). Real-time kvantitatívne RT-PCR analýzy ukázali, zvýšených úrovní transkriptov cyklin D1, Ets1 a MMP-9 v kultivovaných bunkách transfekciou s anti-MIR-9 inhibítor, kedy v porovnaní s tými, prenesené s anti-NC (obr. 2F a obr. S4B). Celkovo tieto výsledky preukázali, že Mir-9 výrazne inhibuje expresiu cyklin D1 a Ets1 cez post-transkripčné represie.

MIR-9 priamo cielené cyklin D1 a Ets1 v rakovinových bunkách žalúdku

určiť, či MIR-9 by mohla potlačiť expresiu cyklin D1 a Ets1 zacielením svojich väzobné miesta v 3'-UTR, PCR produkty, ktoré obsahujú intaktné cieľové miesta alebo mutáciu MIR-9 rozpoznávacie sekvencie osiva (obr. 3A) boli vložené do reportér luciferázy vektor. Tieto plazmidy boli transfekovány do buniek karcinómu žalúdka stabilne transfekciou s negatívnym kontrolným vektorom (mock) alebo MIR-9 prekurzora. Renilla
Luciferase aktivity normalizovanej tým svetlušiek boli významne znížené v SGC-7901 a AGS buniek stabilne transfekciou MIR-9 prekurzora (obr. 3B), a tieto účinky boli zrušené mutácií putativní MIR-9 väzbové miesta v rámci 3'-UTR cyklin D1 a Ets1 (obr. 3B). Okrem toho, knockdown MIR-9 s anti-MIR-9, inhibítorov zvýšila luciferázové aktivity v GES-1, SGC-7901 a AGS buniek (obr. 3C a obr. S4C), zatiaľ čo mutácia MIR-9 rozpoznávacieho miesta zrušená týchto účinkov (obr. 3C a obr. S4C). Tieto výsledky ukazujú, že mier-9 priamo a konkrétne v styku s cieľovými miestami v 3'-UTR cyklin D1 a Ets1.

MIR-9 potlačil proliferáciu in vitro
rakoviny žalúdka bunky prostredníctvom cielenia cyklin D1

Vzhľadom k vyššie dôkazy ukázali, že mier-9 inhibuje D1 výraz cyklin a kombinuje fakty, ktoré cyklin D1 hrá kľúčovú úlohu v progresii bunkového cyklu a proliferácie rakovinových buniek [21], ďalej sme skúmali účinky mir-9 nadmernou expresiou a cieľového génu obnovy na kultivovaných buniek karcinómu žalúdka. Western blot a real-time kvantitatívne RT-PCR ukázala, že transfekcia cyklin D1, ale nie Ets1, zachránil MIR-9-indukovaná down-regulácia cyklin D1 (viď obr. 4A a obr. 4B). V teste tvorby kolónií, MIR-9 nadmernú expresiu tlmí rast SGC-7901 a AGS buniek, v porovnaní s tými transfekovány negatívne kontrolné vektor (makety) (obr. 4C). Prietoková cytometria ukázala, že mier-9 nadmernej expresie indukované zastavenie bunkového cyklu v G _{0 /G 1 fáza SGC-7901 a AGS buniek (obr. 4D). Okrem toho, transfekcia cyklin D1, ale nie Ets1, do SGC-7901 a AGS buniek obnovil inhibíciu proliferácie a zastavenie bunkového cyklu indukované nadmernej expresie MIR-9 (obr. 4C a obr. 4D). Na druhú stranu sme skúmali účinky MIR-9 Knockdown na GES-1, SGC-7901 a AGS buniek. Zavedenie anti-MIR-9 inhibítora do týchto buniek za následok zvýšenú schopností v proliferáciu (Obr. S3B) a progresie bunkového cyklu (Obr. S3C). Tieto výsledky ukazujú, že Mir-9 pozoruhodne potlačený in vitro
proliferáciu a progresiu bunkového cyklu rakovinových buniek žalúdka cez zacielenie cyklin D1.}

MIR-9 oslabený in vitro
migrácie a invázie buniek karcinómu žalúdka prostredníctvom cielenia Ets1

Vzhľadom k tomu, predchádzajúce štúdie naznačujú dôležité úlohy Ets1 pri invázii a metastázovaniu rakovinových buniek [23], [24], budeme ďalej vyšetrovať účinky spätných 9 nadmernou expresiou a cieľového génu obnovy na migráciu a inváziu rakoviny žalúdka SGC-7901 a AGS buniek. Western blot a real-time kvantitatívne RT-PCR ukázali, že transfekcia Ets1, ale nie cyklin D1, zachránil MIR-9-indukovaná down-regulácia Ets1 (obr. 5A a obr. 5B). V transwell migračného testu, rakovinové bunky žalúdočné stabilne transfekované MIR-9, predzvesť prezentované poškodený migračná kapacitu ako tie transfekovány negatívne kontrolné vektor (makety) (obr. 5c). V Matrigel teste invázie, MIR-9 nadmernej expresie tlmí invazivitu SGC-7901 a AGS buniek (obr. 5d). Okrem toho, transfekcia Ets1, ale nie z cyklin D1, do SGC-7901 a bunkové línie AGS obnovil MIR-9-meditaed inhibíciu na migráciu a inváziu (obr. 5C a obr. 5D). Ďalej sme skúmali účinky MIR-9 Knockdown na GES-1, SGC-7901 a AGS buniek. Transfekcia inhibítora proti-MIR-9 za následok zvýšenú migráciu a inváziu týchto buniek (Obr. S3D a obr. S3E). Tieto výsledky ukazujú, že Mir-9 výrazne oslabený in vitro
migrácie a invázie buniek karcinómu žalúdka prostredníctvom cielenia Ets1.

MIR-9 tlmí rast a metastázovaniu rakovinových buniek žalúdka in vivo

Ďalej sme skúmali účinnosť mir-9 proti rastu nádorov a metastáz in vivo
. Stabilná transfekcia MIR-9 prekurzoru do SGC-7901 alebo AGS buniek viedlo k zníženiu rastu a hmotnosť podkožných štepov nádorov u athymických holých myší, v porovnaní s tými, stabilne transfekované s negatívnou kontrolnou vektor (mock) (obr. 6A a obr. 6B ). Okrem toho, expresia cyklin D1, Ets1 a nadväzujúce MMP-9 bola znížená o stabilný transfekcia MIR-9 prekurzora (Obr. 6C). Priemerná hustota nádoba CD31-pozitívne, bola znížená v nádoroch vytvorených injekciou nádorových buniek stabilne transfekciou MIR-9 prekurzora (obr. 6D). V experimentálnych štúdiách metastáz, SGC-7901 alebo AGS bunky stabilne prenesené s Mir-9 prekurzorov stanovených štatisticky menej pľúcnych metastatických kolónií než makety skupiny (obr. 6E). Tieto výsledky naznačujú, že mier-9 inhiboval rast a metastázovaniu buniek karcinómu žalúdka in vivo
.

Vyradenie cyklin D1 a Ets1 phenocopied Mir-9 nadmernej expresie sprostredkovanú inhibíciu na proliferáciu , migrácia a invázia nádorových buniek žalúdka in vitro

Vzhľadom k vyššie uvedenej výsledky ukázali negatívne reguláciu cyklin D1 a výrazu Ets1 podľa mir-9, my sme predpokladali, že vyraďujúce cyklin D1 a Ets1 mohlo vyvíjať podobné účinky na kultivovaných buniek karcinómu žalúdka. Malé interferujúce RNA (siRNA) zameraná na oblasť kódujúce cyklin D1 a Ets1, Si-CCND1 a Si-Ets1, boli navrhnuté a prenesené do SGC-7901 a AGS buniek. Transfekcia si-CCND1 a Si-Ets1 viedlo k zníženiu expresie cyklín D1, pRb, Ets1 a MMP-9 v nádorových bunkách žalúdka, v danom poradí, v porovnaní s tými, prenesené šifrovacím siRNA (Si-SCB) (obr. 7A, obr . 7D a obr. S5). Vyradenie cyklin D1 potlačila proliferáciu a navodenú zástavu bunkového cyklu v G _{0 /G 1 fáza v SGC-7901 a AGS buniek (obr. 7B a obr. 7c). Okrem toho, Vyradenie Ets1 v SGC-7901 a AGS buniek viedlo k zníženiu schopnosti migrácie a invázie (obr. 7E a obr. 7F). Tieto výsledky naznačujú, že porazený z cyklin D1 a Ets1 phenocopied (majúci podobné fenotypy k) MIR-9 over-expresie v inhibíciu proliferácie, migrácie a invázie nádorových buniek žalúdka in vitro
.}

Diskusia

bolo dobre známe, že mier-9 profil expresie v karcinómu spolieha na tkanivovej distribúcii. V primárnych nádorov mozgu, MIR-9 je zvýšená a funguje ako základný faktor v karcinogenéze nervovej [10]. Mier-9 je tiež nadmerne exprimovaný pri karcinóme krčka maternice [11], čo svedčí o jeho nádorový promótor úlohu v rozvoji a progresii nádorov. Avšak, mier-9 je down-regulovaná v mnohých ľudských nádorov, vrátane rakoviny pankreasu [12], rakoviny vaječníkov [13] a kolorektálnym karcinómom [14], a je spojená s malígny progresiu karcinómu prsníka [25] a kolorektálnym karcinómom ( 14). Luo et al.
Zaznamenal down-reguláciu Mir-9 do 24 vzoriek karcinómu žalúdka [15], ktorá bola následne potvrdená v 9 [16], 72 [17] a 13 [18] rakovina žalúdka prípady. Avšak, Inoue et al.
Ohlásil upregulaci MIR-9 u 5 pacientov s karcinómom žalúdka podľa miRNA poľa v reálnom čase na báze PCR [26], a toto zistenie v inom Mir-9 profilom expresie môže byť spôsobená heterogénnosti obmedzených vzoriek. V tejto štúdii sme ukazujú, že mier-9 je významne down-regulované v 86 primárnych vzoriek s karcinómom žalúdka, ako v okolitom normálnom tkanív, čo je v súlade s predchádzajúcimi poznatkami [15] - [18]. Dôležité je, že sme tiež potvrdzujú, že mier-9 expresie je nepriamo spojená s štádiách, inváziu a metastázy karcinómu žalúdka. U ľudí, zrelý MIR-9 je kódovaný troma nezávislými gény, MIR-9-1, 9-2 a mier-MIR-9-3, umiestnenie na chromozómoch 1, 5 a 15, v danom poradí [27]. Predchádzajúce štúdie ukazujú, že down-regulované MIR-9 expresie v karcinómu žalúdka, je v dôsledku aberantne hypermetylace z promotorové oblasti MIR-9 kódujúcich génov [17]. Podobne, aberantne hypermetylace MIR-9 rodinných génov je tiež obsiahnutá v niektorých primárnych nádorov lymfatických uzlín, ako je rakovina hrubého čreva, rakoviny pľúc, rakoviny prsníka, melanómu a [14], [28]. Dôležité je, že súčasná štúdia uvádzala inverzný koreláciu medzi MIR-9 úrovniach a expresie cyklín D1 a Ets1 v žalúdku rakovinových tkanív, čo znamená, že cyklin D1 a Ets1 môže byť negatívne regulovaný MIR-9.

Funkcia a cieľové gény Mir-9 sú tumor-špecifické a závislé na bunkovej kontextu. Mier-9 je schopný potlačiť E-cadherinu expresie pri karcinóme prsníka [29], čo vedie k nukleárnej translokácii beta-kateninu a jeho väzbu s transkripčných faktorov T-buniek, faktor /lymfoidné enhancer faktor 1, a následnou up-regulované transkripcie gény, ktoré uľahčujú bunkovú proliferáciu a angiogenézu [29]. Nútené MIR-9 expresie v bunkových líniách rakoviny prsníka má tiež za následok významné zmeny expresie mnohopočetných génov v súvisiacich s p53 apoptotické dráhy [30]. Prostredníctvom priameho cielenia NF-kB, ektopickej expresie MIR-9 inhibuje in vitro stroje a in vivo
rast ovariálnych nádorových buniek [31] a rastu a metastázy melanómu [32] , V neuroblatoma, zvýšená expresia MIR-9 inhibuje inváziu, metastázy, a angiogenézu nádorových buniek prostredníctvom zacielenia matrix metaloproteinázy 14 [33]. Wan et al.
Uvádzajú, že zvýšená expresia MIR-9 inhibuje in vitro stroje a in vivo
rast adenokarcinómom žalúdka bunkové línie MGC803 prostredníctvom potláčaní NF-kB na úrovni post-transkripčný [16]. Avšak, v nedávnej štúdii, Rotkrua et al.
Je uvedené, že mier-9 môžu byť zapojené do žalúdka karcinogenéze prostredníctvom down-reguláciu CDX2, a porazený Mir-9 znížená in vitro
šírenie rakoviny žalúdka MKN-45 bunkách [19], zatiaľ čo ich výsledky nemusia byť ďalej posilnený mir-9 over-expresie génov, cieľ záchranu a in vivo
štúdiách. Okrem toho, že je v súčasnej dobe sporné, či CDX2 hrá onkogénne alebo nádorového supresor úlohu v žalúdočnej karcinogenéze [34], [35]. Navyše potenciálnej role Mir-9 v invázii a metastázy karcinómu žalúdka neboli dosiaľ objasnené. To znamená, že funkcia a priame ciele Mir-9 v žalúdočné rakovina oprávňujú na ďalšie vyšetrovanie.

V tejto štúdii sme ukázali, že nadmerná expresia MIR-9 tlmí proliferáciu, migráciu a inváziu buniek karcinómu žalúdka, ktorý bol podobný tomu cyklin D1 alebo Ets1 príklepu, čo naznačuje potenciálny aplikácie MIR-9 ako cieľ pre liečivá rakoviny žalúdka. Okrem toho, naše dáta potvrdila, že mier-9 zameraná priamo cyklin D1 a Ets1 do buniek karcinómu žalúdka prostredníctvom 3'-UTR luciferázového reporterového testu. Vzhľadom k tomu, nedávny dôkaz ukazuje, že niektoré miRNA môžu alternatívne modulovať génovú expresiu interakciou s promotérov [36] - [38], potenciálny role Mir-9 v regulácii transkripcie cyklin D1 a Ets1 prostredníctvom interakcie s predkladateľmi zostávajú nejasné a vyžadujú naše ďalšie vyšetrovanie. Cyklin D1 je preto-onkogén, ktorý patrí do rodiny G _{1 cyklin, a hrá dôležitú úlohu v bunkovom cykle G 1 S prechodu väzbou svojim partnerom cyklin dependentné kinázy 4 a 6 fosforylovať a inaktiváciu RB proteín [21]. Nadmerná expresia cyklin D1 je skorý udalosť v karcinogenézy v konečníku, pažeráka a žlčníka rakoviny ľudskej [39], a je prognostickým indikátorom spojené so zlou prežitie v pažeráku, rakoviny prsníka, rakoviny močového a [39]. Cyklin D1 over-expresie v ľudských rakovín je objasnený pomocou niekoľkých mechanizmy vrátane genomových zmien, post-transkripčný reguláciu, a post-translačný stabilizáciu proteínu [39]. Nedávne dôkazy ukazujú, že mier-16-1 potláča cyklin D1 výraz v post-transkripčný úrovni väzbou jeho 3'-UTR v lymfómom z plášťových buniek [40]. V tejto štúdii, naše výsledky ukazujú, že mier-9-sprostredkovanú inhibíciu na bunkový cyklus progresie a bunkovú proliferáciu bol zachránený obnovenie cyklin D1 expresie v nádorových bunkách žalúdka, čo naznačuje, že identifikácia cyklin D1 ako cieľový gén MIR-9, môže vysvetliť, prinajmenšom čiastočne, prečo zvýšená expresia MIR-9 potláča proliferáciu buniek karcinómu žalúdka.}

Ets1, člen rodiny ETS transkripčných faktorov, sa viaže na špecifické sekvencie DNA, ktoré obsahujú GGAA /T core motív [22], a podieľa sa na inváziu a metastázovaniu nádorov prostredníctvom transkripčný regulácia niekoľkých génov zodpovedných za extracelulárnej matrix remodelácie, migráciu a inváziu, ako matrix metaloproteinázy a aktivátora plazminogénu urokinázou [22]. K dnešnému dňu, rastúci počet klinických štúdií preukázali dôležité úlohy Ets1 vo vývoji nádoru a progresie rôznych pevných nádorov [23], [24]. Predchádzajúce štúdie ukazujú, že expresia Ets1 súvisí s klinicko vlastnosťou rakoviny žalúdka, vrátane nádoru a infiltrácia lymfatických uzlín alebo distálnej metastáz, čo svedčí o jeho kritickú úlohu v invázii a metastázy karcinómu žalúdka [41]. Avšak, mechanizmy na Ets1 over-expresie v karcinómu žalúdka zostáva veľkou neznámou. Nedávne štúdie ukazujú, post-transkripčný reguláciu Ets1 pomocou Mir-125b v bunkách rakoviny prsníka [42], a mier-200b v endotelových bunkách [43]. V tejto štúdii sme preukázali, že ako priamy cieľ MIR-9, Ets1 bola up-regulovaný u karcinómu žalúdka a prispel k migrácii a invázii nádorových buniek. Vyradenie Ets1 čiastočne phenocopied účinky MIR-9 nadmernej expresie v žalúdočnej nádorových bunkových línií, zatiaľ čo obnova Ets1 expresie zachráneného rakovinové bunky od MIR-9-sprostredkovanú inhibíciu na migráciu a inváziu, odhaľuje nový post-transkripčný regulačný mechanizmus z Ets1 podľa Mir-9 a jej klinické potenciálov v karcinómu žalúdka.

v súhrne sme preukázali, prvýkrát, že mier-9 potláča expresiu cyklin D1 a Ets1 prostredníctvom priameho zacielenia na ich 3 ' -UTR, čím dochádzalo k inhibícii proliferácie, invázie a metastáz nádorových buniek žalúdka. Táto štúdia rozširuje naše znalosti o regulácii cyklin D1 a Ets1 na posttranskripční úrovni miRNA, a naznačujú, že mier-9 môžu byť potenciálnymi hodnôt ako nový terapeutický cieľ pre rakovinu žalúdka.

Materiály a metódy

vzoriek tkaniva pacienta

oprávnenie na uskutočnenie tejto štúdie bola získaná z Institutional Review Board of Tongji Medical College (schvaľovacieho čísla: 2010-S003). Parafínu vložené a čerstvé vzorky 86 primárnych prípadov rakoviny žalúdka boli získané z Ústavu chirurgie, Nemocnica únie Tongji Medical College. Ich patologická diagnóza bola preukázaná najmenej dvoma patológmi. Demografické a klinicko-patologické údaje o všetkých pacientov boli zhrnuté v tabuľke S1. bola tiež získaná priľahlý žalúdočnej sliznice, ktoré sú obsiahnuté žiadne makroskopické nádor a nenádorových oblasti boli následne overené mikroskopické histológie. Čerstvé nádorové vzorky a priľahlé non-neoplastických sliznice boli spojené a skladované pri -80 ° C až do použitia.

Imunohistochémia

Imunohistochemické farbenie bolo vykonané, ako bolo opísané skôr [44], s protilátkami špecifickými pre cyklin D1, Ets1, MMP-9 a CD31 (abca Inc., Cambridge, MA, 1: 200 riedenie). Negatívne kontroly zahŕňali paralelné časti ošetrené s vynechaním primárnej protilátky, navyše k susednému úseku rovnakého bloku, v ktorom sa primárna protilátka nahradený králičie polyklonálne IgG (abca Inc.) ako izotypovo kontroly. Stupeň reaktivita bola hodnotená najmenej dvoma patológmi bez znalosti klinicko vlastností nádorov. Stupeň pozitivity bol pôvodne klasifikovaný podľa percenta pozitívnych nádorových buniek, ako nasledujúce: (-) < 5% buniek pozitívne, (1+) 6-25% buniek pozitívne, (2+) 26 až 50% buniek pozitívnych a (3+) > 50% buniek pozitívne. Sklíčka so stredne pozitívny (2+) alebo silná pozitívna (3+) reaktivity bola klasifikovaná ako majúce "vysokú výraz", zatiaľ čo sklíčka so záporným (-) alebo slabo pozitívna (1+) reaktivita boli klasifikované ako majúce "nízku expresiu" .

Western blot

bunkového proteínu sa extrahuje 1 x bunka lyzačného pufra (Promega, Madison, WI). Proteínu (50 ug) z každej vzorky bol podrobený 4-20% prefabrikovaných polyakrylamidovom gélu (Bio-Rad, Hercules, CA) elektroforézou a prenesené na nitrocelulózové membrány (Bio-Rad). Pre cyklin D1, Ets1, MMP-9, pRb a β-aktínu (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) detekcia, primárna protilátka riedenie boli 1: 500, 1: 500, 1: 500, 1: 500 a 1: 1000, v danom poradí, a následne 1: 3000 zriedením kozieho anti-králičieho chrenovou peroxidázou značené protilátky (Bio-Rad). Vylepšená chemoluminiscenčný substrát kit (Amersham, Piscataway, NJ) bol použitý na detekciu chemiluminscent signálov s autorádiografiou filmu (Amersham).

RT-PCR v reálnom čase kvantitatívne RT-PCR

Celkom RNA bola izolovaná pomocou RNeasy Mini Kit (Qiagen Inc., Valencia, CA). Reverzný transkripcie reakcie boli vykonané s Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche, Indianapolis, IN). PCR priméry pre cyklin D1, Ets1, MMP-9 a P-aktínu boli navrhnuté Premier Primer 5,0 softvér (tabuľka S2). RT-PCR bola vykonaná, ako bolo opísané skôr [44]. Real-time kvantitatívne RT-PCR sa SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, CA) bola vykonaná za použitia ABI Prism 7700 Sequence Detector (Applied Biosystems). Fluorescenčné signály boli zhromaždené v priebehu predĺženej fázy, boli vypočítané hodnoty Ct vzoriek, a hladiny transkriptov cyklin D1, Ets1 a MMP-9 boli normalizované na tie, beta-aktínu o 2 ^{-ΔΔCt metódy.}

Kvantifikácia MIR-9 prejavu

hladiny zrelého mir-9 v primárnych tkanív a bunkové línie boli stanovené pomocou Bulg slučka ™ miRNA qPCR Primer Set (RiboBio Co. Ltd, Guangzhou, Čína). Potom, čo bola syntetizovaná cDNA s primerom kmeňové slučkové miRNA-špecifické, kvantitatívne PCR bola vykonaná s špecifickými primermi (tabuľka S2). Hladiny MIR-9 boli normalizované k tým U6 snRNA.

miRNA cieľ predikcie

Mirna ciele boli predpovedal pomocou algoritmov Miranda, miRDB, RNA22 a Targetscan [45]. Pre identifikáciu génov bežne predikované štyri rôzne algoritmy, výsledky predpokladaných cieľov sa pretína s použitím miRWalk [46].

Bunková kultúra a transfekcia

ľudských bunkových línií karcinómu žalúdka (SGC-7901 a MKN-74) a SV40-transformovanej, normálne a netumorogenní žalúdočné epitelové GES-1 bunky [20] boli získané zo Type Culture Collection čínskej akadémie vied (Shanghai, Čína). Rakovina žalúdka u bunkové línie AGS (CRL-1739) bol zakúpený forma American Type Culture Collection (Rockville, MD). Bunky boli pestované v RPMI1640 médiu (Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD), doplnenom 10% fetálneho hovädzieho séra (Life Technologies, Inc.), penicilínu (100 U /ml) a streptomycínom (100 ug /ml). Bunky boli udržiavané pri 37 ° C vo zvlhčenej atmosfére 5% CO _2.

• Ploche ONE: pridružení medzi Zníženie Plasma adiponektínu úrovniach a riziko bakteriálnej infekcie po rakovinou žalúdka chirurgia
• Ploche ONE: Expresia AFP a STAT3 sa podieľa na arsenitým indukovanej apoptózy a inhibíciu proliferácie v AFP produkujúce rakovina žalúdka Cells