PLoS ONE: Ekspression af EGF familie i Gastric Cancer: nedregulering af HER4 og dens Aktivering ligand NRG4

Abstrakt

Gastrisk kræft er en væsentlig årsag til kræft-relaterede dødsfald i både mænd og kvinder. De epidermal vækstfaktor receptorer er EGFR, HER2, HER3 og HER4. Af de fire epidermale vækstfaktorreceptorer, EGFR og HER2 er velkendte onkogener involveret i gastrisk cancer. Little, dog er kendt om den rolle, som HER3 og HER4 spillet i denne sygdom. Vi opnåede parret prøver fra tumoren og det tilstødende normale væv fra den samme patient, der gennemgår kirurgi for mavekræft. Anvendelse af RT-qPCR, kvantificeret vi mRNA-ekspression af de fire receptorer, herunder de HER4 splejsnings- isoformer og alle ligander aktiverende disse receptorer. Brug af immunhistokemi blev proteinet ekspression af HER4 også kvantificeres. Vi fandt, at HER2-mRNA-ekspression blev opreguleret i tumorvævet sammenlignet med den matchede normale væv (p = 0,0520). Alle ligander med affinitet for EGFR blev opreguleret, mens ekspressionen af ​​EGFR var uændret. Interessant nok fandt vi mRNA ekspression af HER4 (p = 0,0002) og dens ligand NRG4 (p = 0,0009), der skal nedreguleres i tumorvævet sammenlignet med den matchede normalt væv. HER4 nedregulering blev påvist for alle alternativt splejsede isoformer af denne receptor. Disse resultater understøtter inddragelsen af ​​EGFR og HER2 i mavekræft og foreslå en interessant sammenslutning af reduceret HER4 udtryk med udvikling af mavekræft

Henvisning:. Nielsen TO, Friis-Hansen L, Poulsen SS, Federspiel B, Sørensen BS (2014) Ekspression af EGF familie i Gastric Cancer: nedregulering af HER4 og dens Aktivering ligand NRG4. PLoS ONE 9 (4): e94606. doi: 10,1371 /journal.pone.0094606

Redaktør: Rupesh Chaturvedi, Vanderbilt University School of Medicine, USA

Modtaget: Juli 8, 2013; Accepteret: 19 marts 2014; Udgivet: 11 April, 2014

Copyright: © 2014 Nielsen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Danske Cancer Samfundet # R2-A247-09-S2, danske MRC #FSS 09072153. de finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. det forfattere har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser.

Introduktion

mavekræft er den tredje hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald hos mænd og den femte hyppigste årsag hos kvinder. Mavekræft udgjorde ca. 990.000 nye registrerede tilfælde og 738.000 dødsfald på verdensplan i 2008 [1]. Infektion med Helicobacter pylori
, kost, rygning og alkoholforbrug er vigtige determinanter der påvirker risikoen for at få mavekræft [2], [3].

epidermal vækstfaktor (EGF) familie er et komplekst netværk af tyrosinkinasereceptorer og ligander vekselvirker at inducere forskellige signalleringskaskader. Familien omfatter fire receptorer EGFR (HER1), HER2 (ErbB2), HER3 (ErbB3), og HER4 (ErbB4) [4]. Ved alternativ splejsning, er HER4 udtrykkes i en række isoformer. I juxtamembraneous område i HER4, optagelse af enten exon 15b eller exon 16 resultater i JMA eller JMB isoformer henholdsvis [5] - [7]. JMA isoform og ikke den JMB isoformen kan behandles for at frigive en opløselig HER4 intracellulært domæne (ICD), som lokaliseres i cytoplasma, kerne, og mitochondrier [8], [9]. Alternativ splejsning i den cytoplasmatiske region af HER4 giver anledning til CYT1 og CYT2 isoformer. Skipping af exon 26 resulterer i en receptor (CYT2) mangler 16 af aminosyrerne i fuld-længde receptor (CYT1) [10].

ligander af EGF-familien er epidermal vækstfaktor (EGF), transformerende vækstfaktor-α (TGF-α), og amphiregulin (AR), som er specifikke for EGFR; heparinbindende EGF-lignende vækstfaktor (HB-EGF), betacellulin (BTC), og epiregulin (EPR), der binder både EGFR og HER4; neuregulin 1 (NRG1) og NRG2 der binder både HER3 og HER4; og endelig NRG3 og NRG4 der er specifikke for HER4 [11]. Når binding af en aktiverende ligand, receptorerne gør homo- og hetero-dimerer. Sammensætningen af ​​dimerisering partnere og aktiverende ligander bestemmer signal, der skal transduceres inde i cellen [12], [13]. EGFR familien spiller forskellige roller i vækst og vedligeholdelse af mange væv, bl.a. ved at regulere celledeling, apoptose, differentiering og migration. Deregulering af signalering fra dette system er forbundet til udvikling og vækst af kræft [14] - [17]

EGFR og HER2 er velkendte onkogener i gastrisk kræft [18], [19].. HER2 hæmmende antistof trastuzumab succes forbedrer prognosen når tilføjet til kemoterapi til patienter med HER2-positiv avancerede gastrisk kræft [20]. er også blevet gennemført en række kliniske forsøg for at teste anvendeligheden af ​​EGFR-hæmmere i gastrisk kræft [21], [22]. HER3 og HER4 kan potentielt også være vigtig i ætiologien af ​​mavekræft; dog oplysninger om deres roller i denne sygdom er sparsom. Faktisk lidt om ekspressionsmønsteret af det komplette anlæg EGF. På grund af den interaktive karakter af EGF-receptorer og ligander, afklaring af mekanismerne i regulering af EGF familiemedlemmer krav overvejer alle receptorer og deres ligander sammen.

For at undersøge ekspressionsmønsteret af EGF-receptorer og ligander i gastrisk cancer, opnået vi væv fra tumoren og det tilstødende normale væv fra den samme patient, der gennemgår kirurgi for mavekræft. Vi brugte parret vævsprøver for at sikre mod den inter-individuelle variation, der eksisterer i baseline udtryk for EGF-systemet. Brug RT-qPCR, vi kvantificeret mRNA ekspressionen af ​​de fire EGF-receptorer, herunder HER4 splejsning isoformer og ligander aktivering disse receptorer.

Materialer og metoder

Patient udvælgelse og indsamling af biopsier

i denne kohorte undersøgelse blev 38 patienter, der gennemgår operation for adenokarcinom i maven, spiserøret eller gastroøsofageal krydset hinanden medtaget fra juli 2008 til november 2009. Alle personer forudsat en informeret skriftligt samtykke. Indsamling af biopsier blev godkendt af de regionale videnskabsetiske komiteer i Region Sjælland, Danmark (journalnummer H-B-2008-049), og etablering af en biobank blev godkendt af Dansk Data Protection Agency (journalnummer 2008-41-2138). Biopsier blev taget fra både tumorvæv og tilstødende normalt væv. Alle biopsi prøver blev gennemgået af en erfaren patolog at validere diagnosen. Pre-definerede kliniske data blev udtrukket fra medicinske diagrammer og patologi rapporter. De kliniske karakteristika for patienterne er angivet i tabel 1.

RNA-ekstraktion

Biopsier blev anbragt i RNA senere
(Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) straks efter fjernelse. RNA senere
blev fjernet før RNA-isolering, og Trizol (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) blev tilsat. Vævsprøverne blev homogeniseret på en Tissuelyser (Qiagen, Chatsworth, CA, USA). RNA fra væv blev isoleret i overensstemmelse med producentens protokol for Trizol RNA-isolering (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). RNA-koncentrationer blev målt på et NanoDrop ND-1000 spektrofotometer. RNA kvalitet blev testet på en 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) ifølge producentens protokol.

revers transkription kvantitativ polymerasekædereaktion (RT-Q-PCR)

cDNA blev syntetiseret fra 1 pg totalt RNA ved anvendelse af høj kapacitet cDNA Reverse Transcription Kit (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Den endelige reaktion blev fortyndet til et samlet volumen på 200 pi

1 pi cDNA blev anvendt til qPCR hjælp SYBR green Master mix (Roche, Basel, Schweiz) på et Roche LightCycler 480 på:. 95 ° C, 10 min; 50 cykler ved 95 ° C i 10 sek, specifik annealing temperatur i 10 sek, 72 ° C i 5 sek; 99 ° C i 1 sek; 59 ° C i 15 sekunder; 95 ° C i 1 sek; afkøling til 40 ° C. Primer sekvenser og annealing temperaturer er angivet i tabel 2.

Genet bedst egnet til normalisering blev bestemt ved at anvende Normfinder algoritmen [23] til de kvantificerede koncentrationer af GAPDH, β-actin, YWHAZ, SDHA, og HMBS . SDHA viste sig at være den bedste af de fem. To prøver blev udelukket fra analyserne på grund af ingen påvisning af mRNA fra nogen af ​​de reference- gener.

Immunfarvning

Paraffin-indlejrede væv fikseret i 4% buffered paraformaldehyd fra 13 repræsentative patienter blev undersøgt af immunhistokemi ved hjælp af C-erbB-4 /HER-4, kanin polyklonalt antistof fortyndet 1/50 som det primære antistof (RB-9045-P1, Thermo Scientific, Wilmington, dE, USA). For antigen hentning snit blev kogt i mikroovn i 10 mM citratbuffer, pH 6,0. Immunreaktionen blev visualiseret ved biotinyleret gede-anti-kanin-antistof fortyndet 1/200 (BA-1000, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA), efterfulgt af en foruddannet avidin og biotinyleret peberrodsperoxidase makromolekylære kompleks (ABC) fortyndet 1/100 (Code nr. PK-4000, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Reaktionen blev udviklet ved anvendelse af 3,3 -diaminobenzidine og kontrastfarvning udførtes med Mayers Hemalum. Som en negativ kontrol blev den samme procedure udført uden primært antistof.

Brug Image Pro Plus (MediaCybernetics) farvningsintensiteten af ​​repræsentative billeder af tumoren versus det omgivende mucosavæv blev estimeret. To billeder af tumor prøve og to billeder af de omkringliggende slimhinde blev indsamlet fra hver vævsprøve og gennemsnittet af de to værdier blev beregnet og anvendt til statistisk analyse og plotning. For et par prøver, kun tumorvæv eller kun normal slimhinde var til stede, og ingen sammenligning af HER4 udtryk var muligt for disse væv. Parret t-test blev anvendt til at bestemme, om intensiteten af ​​tumorvæv var forskellig fra intensiteten af ​​slimhinden væv.

Resultater Salg

mRNA-ekspression af EGF-receptorerne i gastrisk cancer

RNA ekstraheret fra 38 tumorer og matches prøver fra den tilstødende normale væv fra patienter, som gennemgik operation for blev anvendt mavekræft til RT-qPCR kvantificeringer. MRNA ekspression af fire EGF-familien receptorer EGFR, er HER2, HER3 og HER4 afbildet i figur 1. Interessant nok blev den HER4 receptor underkastes nedregulering i cancervævet sammenlignet med det normale væv (p = 0,0004). For HER2, så vi en opregulering af denne receptor i kræft væv, der var meget tæt på at være signifikant (p = 0,0520). EGFR og HER3 mRNA-ekspression var un-ændret i tumorerne sammenlignet med normalt væv.

HER4 eksisterer som forskellige alternativt splejsede isoformer. Den juxtamembranous region kan bestå af enten JMA eller JMB, og den cytoplasmatiske region kan bestå af enten CYT1 eller CYT2. Den observerede for total HER4 mRNA-ekspression i cancervævet anvendes på alle fire varianter af receptoren (figur 2) nedregulering.

For bedre at illustrere størrelsen af ​​HER4 nedregulering i tumorvævet, vi plottet HER4 ned- eller opregulering for hver enkelt patient. Den HER4 mRNA-ekspression i tumorvævet minus HER4 mRNA-ekspression i de overensstemmende normalt væv (ΔHER4) er afbildet i figur 3. En værdi under 0 repræsenterer en nedregulering. Dette tal viser tydeligt, at HER4 nedregulering er en meget generel mekanisme, der finder sted i de fleste af patienterne, og uanset tumor lokalisering.

mRNA ekspressionen af ​​EGF-familien ligander i mavekræft

TGF -α, amphiregulin, og EGF specifikt binder EGFR. blev fundet en ubetydelig mRNA udtryk niveau for EGF i både tumor og normalt væv, og dette ligand blev derfor ikke anset for yderligere analyse. TGF-α og amphiregulin blev begge opreguleret i cancervævet sammenlignet med det normale væv (figur 4a og b). HB-EGF, betacellulin og epiregulin har affinitet for både EGFR og HER4, og alle disse ligander blev også opreguleret i cancervævet (figurerne 4 c, d, og e). Tilsammen viser dette, at alle EGFR-aktiverende ligander er opreguleret i de tumorer.

Af de neuregulins, NRG1 og NRG2 binder både HER3 og HER4. Vi observerede ingen ændring i ekspression af enten α eller p varianter af NRG1 og NRG2 (fig 4F, G, H og I). NRG3 og NRG4 kun binde HER4. NRG3 ikke undergår nogen ændring i udtryk fra normal til kræft væv (figur 4j). Imidlertid NRG4 blev nedreguleret i cancervævet sammenlignet med det normale væv (p = 0,0009) (fig 4k). Dette viser, at både HER4 og dens specifikke ligand NRG4 er nedreguleret i gastrisk cancer.

For bedre at illustrere størrelsen af ​​NRG4 nedregulering i tumorvævet, vi plottet NRG4 ned- eller opregulering for hver enkelt patient. Den NRG4 mRNA-ekspression i tumorvævet minus NRG4 mRNA-ekspression i de overensstemmende normalt væv (ΔNRG4) er afbildet i figur 5.

I betragtning af alle de patienter, der viser nedregulering af total HER4 i deres tumorvæv, i 82% af disse NRG4 var også nedregulering og i 86% af en eller flere af de EGFR-delte ligander (HB-EGF, epiregulin, betacellulin) blev opreguleret. I 36% af patienterne med total HER4 nedregulering, blev alle tre af EGFR delte ligander opreguleret. Salg

Protein ekspression af HER ved immunhistokemi

På grund af post-transskriptionelle forskrifter, de mRNA ekspressionsmønstre bestemt ved RT-qPCR måske ikke repræsenterer proteinekspression mønster. For at sikre, at den observerede nedgang i HER4 mRNA-ekspression i cancervævet af patienter med gastrisk cancer også afspejles på proteinniveauet, udførte vi immunhistokemisk farvning på formalinfikseret paraffinindlejret væv fra alle patienter inkluderet i undersøgelsen.

Ved en kvantificering af HER4 farvningsintensitet i repræsentative områder af tumor- og det omgivende væv, fandt vi tumorvævet at have signifikant mindre HER4 farvningsintensitet i forhold til den omgivende normale slimhinder (p = 0,0029) (figur 6) .

Repræsentative mikrofotografier af de farvninger er præsenteret i figur 7. i den normale gastriske mucosa var der en stærk HER4 immunreaktion (figur 7a). Især den basale del af cytoplasmaet og den laterale cellemembran overfladen epitelceller var stærkt immunreaktive for HER4 (figur 5 b). Også parietalcellerne udviste meget stærk HER4 immunreaktivitet (figur 7 c og d). Submucosa og muskellag var negative. I de kirtelstrukturer viste især parietalcellerne meget stærk HER4 immunreaktivitet (fig 7 c og d). Negative kontrol uden primært antistof resulterede ikke i nogen farvning.

I de gastriske cancere kun mindre områder med tumorceller havde en positiv immunreaktion til HER4, og den negative tumorvæv i stærk kontrast med den farvede normal slimhinde støder op til tumor (figur 7). I de centrale dele af tumorvævet næsten alle celler var fuldstændigt negative bortset fra små klynger af celler, som kunne have haft en særlig membran farvning.

Discussion

EGF-familien er sammensat af et interagerende netværk af receptorer og ligander, der skal overvejes som en helhed for at forstå reguleringen af ​​signalering i familien Globaliseringsfonden. Bestemte vi reguleringen mønster af EGF-familien i tumorvæv fra patienter med mavekræft samt den matchede tilstødende normale væv fra de samme patienter.

Vi fandt signalering potentiale EGFR at være opreguleret i tumorvævet gennem opregulering af alle EGFR aktiverende ligander, og vi fandt også opregulering af HER2 i tumorvæv, der var meget tæt på at være signifikant (p = 0,0520). Dette er i god overensstemmelse med eksisterende data, viser, at både EGFR og HER2 er associeret med dårlig prognose i gastrisk cancer [19]. Betydningen af ​​HER2 i mavekræft fremgår af det faktum, at HER2 hæmmende antistof Herceptin er den eneste godkendte middel til målrettet behandling af gastrisk kræft [24].

For HER3, vi ikke observere nogen udtryksmæssige forordning om mRNA-niveauet. Imidlertid har nogle undersøgelser om HER3 i gastrisk cancer tilskrives en rolle for HER3 i mavekræft. HER3 er blevet forbundet med ringe overlevelse, og positivt HER3 proteinekspression blev påvist ved immunhistokemi i 18,6% af gastrisk cancer prøver sammenlignet med kun 2,0% af nontumorous prøver [25] - [27]. Vi kunne ikke finde en højere HER3 udtryk i mavekræft i forhold til normalt væv i vores undersøgelse. en forskel i de metoder, der anvendes i studier (immunhistokemi vs RT-qPCR), kan dog redegøre for nogle af de forskelle i resultaterne. Desuden kunne vi beskrive reguleringen mønster i hver patient i stedet for i en pulje af kræftpatienter og en pulje af kontrolpersoner, og det kan også udgøre en forskel i de opnåede resultater i de to undersøgelser.

Vi fandt en markant nedregulering af både HER4 og dets aktiverende ligand NRG4 i tumorvæv. Vores resultater styrkes af, at vi også fundet en nedregulering når vi brugte yderligere analyser til at kvantificere de specifikke isoformer af HER4. Brug af immunhistokemi, bekræftede vi, at den normale gastriske væv er positiv for HER4, hvorimod kræft væv har meget lav eller ingen HER4 farvning.

nedsat ekspression af HER4-mRNA-ekspression i tumorvæv kan tilskrives et fald i antal celler, der udtrykker HER4 eller til et fald i HER4-ekspression i alle de HER4 udtrykkende celler. Fra vores immunhistokemiske farvninger, vi observerer, at i mavens kræft kun mindre klynger med tumorceller haft en positiv immunreaktion til HER4, mens det store flertal af tumorceller var helt negativ. Dette indikerer, at det er antallet af celler, der udtrykker HER4 der er faldet i tumorerne. I modsætning til tumorvævet, det normale væv havde meget stærke immunreaktioner til HER4. Interessant er det især slim-producerende celler og saltsyre-producerende parietale celle, der udtrykker HER4 protein.

rolle HER4 i cancersygdom er kontroversiel. I blærekræft, RT-qPCR kvantificering af HER4 og dets ligander viser, at HER4 er forbundet med bedre overlevelse. Især er det co-ekspression af HER4 sammen med sin specifik ligand, NRG4, stærkt korreleret med bedre overlevelse [28]. Ligeledes er HER4 forbundet med bedre samlet og sygdomsfri overlevelse i livmoderhalsen kræft [29]. I larynx planocellulært karcinom, er HER4 tabt i sene fase tumorer [30], og HER4 hovedsageligt findes i lav-trins og ikke-metastatiske xenotransplantattumorer i bugspytkirtelkræft [31].

På den anden side, HER4-proteinekspression som bestemt ved immunhistokemi er blevet forbundet med den distale metastase og en nedsat overlevelsesrate i orale pladecellecarcinomer [32]. I en undersøgelse af kolorektal cancer, hvor proteinekspression mønster blev også bestemt ved immunhistokemi, patienter tidlige fase havde en lavere procentdel af HER4 overekspression end patienter sene stadier [33]. I maligniteter af centralnervesystemet, HER4 også besidder en tumor-fremmende rolle [34], [35].

Ikke meget er kendt om den rolle, HER4 gastrisk kræft. Ingen HER4 mRNA-ekspression blev påvist i to gastrisk cancer cellelinjer [36]. HER4-proteinekspression som påvist ved immunhistokemi har vist sig at korrelere med tidlig fase, lavere kvalitet, og fravær af lymfeknudemetastaser i gastrisk cancer [25]. Det er i meget god aftale med en anden undersøgelse, der undersøgte genekspression profiler i de lange overlevende fra metastatisk mavekræft behandles med kemoterapi, hvor forfatterne angivet en mulig rolle HER4 opregulering i disse patienter [37]. Sammen med vores nuværende resultater indikerer disse data endvidere, at HER4 signalering har en beskyttende funktion mod carcinogenese i det gastriske region. En undersøgelse fandt HER4 gen, som skal ofte forstærket i gastrisk kræft [38]. Men resultaterne af vores undersøgelser viser, at dette ikke oversætte til det HER4 udtrykket niveau siden vi fandt en nedregulering af HER4 mRNA og protein udtryk snarere end en opregulering.

Selv om vi ikke finde udtryk for EGFR skal reguleres, er den signalering potentiale gennem denne receptor forøges ved opregulering af alle dets ligander. Dette omfatter ligander deles med HER4: HB-EGF, betacellulin og epiregulin. Ud over autokrine EGFR aktivering, opregulering af disse ligander potentielt resulterer i øget aktivitet af HER4. Aktivering af EGFR-vejen er faktisk en måde for cellerne at blive stadig mere kræftfremkaldende. Men i betragtning HER4 at have anti-kræftfremkaldende funktioner, ville en samtidig aktivering af denne receptor standse proliferative fordel af EGFR-aktivering. Man kunne spekulere, at denne potentielle aktivering af HER4 undgås ved samtidig nedregulering af receptoren og dens specifik ligand NRG4.

Hos patienter med blærekræft, kan den kombinerede HER4 /NRG4 signalering enhed være væksthæmmende, og co-ekspression af HER4 sammen med NRG4 er yderst korreleret til bedre overlevelse, hvis de to proteiner virker sammen i stedet for hver for [28].

Vi har også foretaget en analyse for at sammenligne HER4 udtryk til patient overlevelse. Vi gjorde observere en tendens til høj HER4 udtryk bliver korreleret til en bedre overlevelse (resultater ikke vist), men på grund af en begrænsning i antallet af patienter inkluderet i studiet, blev dette resultat ikke fundet at være betydelig og yderligere undersøgelser vil have at belyse, om en korrelation mellem HER4 ekspression og overlevelse kan findes i gastrisk cancer. En korrelation af ekspressionsniveauet af EGF-receptorerne være tilstedeværelsen af ​​lymfeknudemetastaser og tumorindtrængen viste kun HER2 at korrelere inverst til disse parametre hvorimod ingen korrelation blev fundet for den resterende EGF-familien (resultater ikke vist).

Som konklusion tyder vore resultater en ny rolle for HER4 i gastrisk cancer. Interessant, fandt vi både HER4 og specifik ligand NRG4 skal nedreguleres i kræft væv. Dette ledsages af en øget signalering potentiale EGFR gennem opregulering af alle dets ligander og en opregulering af HER2.

• PLoS ONE: MicroRNA-338 Hæmmer vækst, invasion og metastase af Gastric Cancer ved Målretning NRP1 Expression
• PLoS ONE: Co-Levering af doxorubicin og SATB1 shRNA af varmefølsom Magnetisk kationiske liposomer for mavekræft Therapy