PLoS ONE: Экспрессия EGF семьи в рака желудка: подавление HER4 и его активирующее Лиганд NRG4

Абстрактный

Рак желудка является одной из основных причин смертности от онкологических заболеваний у мужчин и женщин. В эпидермального фактора роста рецепторов являются EGFR, HER2, HER3 и HER4. Из четырех эпидермального фактора роста рецепторов, EGFR и HER2, хорошо известные онкогены, участвующие в раке желудка. Мало, однако, известно о роли HER3 и HER4 при этом заболевании. Мы получили парные образцы от опухоли и прилегающей нормальной ткани из того же пациента, подвергаемого операции по поводу рака желудка. С помощью RT-КПЦР, мы количественно экспрессию мРНК четырех рецепторов, включая сплайс-изоформ HER4 и всех лигандов, активирующих эти рецепторы. С помощью иммуногистохимии, экспрессия белка HER4 также количественно. Мы обнаружили, что экспрессия HER2 мРНК позитивно регулируется в опухолевой ткани по сравнению с совпадающей нормальной ткани (р = 0.0520). Все лиганды, обладающие сродством к EGFR были повышающей регуляции, тогда как экспрессия EGFR не изменилась. Интересно, что мы обнаружили экспрессию мРНК HER4 (р = 0,0002) и его лиганд NRG4 (р = 0,0009), чтобы быть подавлена ​​в опухолевой ткани по сравнению с согласованной нормальной ткани. HER4 деактивация была продемонстрирована для всех альтернативного сплайсинга изоформ этого рецептора. Эти результаты подтверждают причастность EGFR и HER2 при раке желудка и предложить интересную ассоциацию снижению экспрессии HER4 с развитием рака желудка
<р> Образец цитирования:. Nielsen TO, Фриис-Хансен L, Poulsen SS, Федершпиль B, Соренсен BS (2014) Экспрессия EGF семьи в рака желудка: подавление HER4 и его активирующее лиганда NRG4. PLoS ONE 9 (4): e94606. DOI: 10.1371 /journal.pone.0094606
<р> Редактор: Rupesh Chaturvedi, Университет Вандербильта школа медицины, Соединенные Штаты Америки
<р> Поступила 8 июля, 2013 года; Принято: 19 марта, 2014 года; Опубликовано: 11 апреля 2014
<р> Copyright: © 2014 Nielsen и др. Это статья с открытым доступом распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются

Финансирование:. Датский Рак Общество # R2-A247-09-S2, датский MRC #FSS 09072153. Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи

Конкурирующие интересы:. авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов.

Введение
<р> рак желудка является третьей ведущей причиной смертности от онкологических заболеваний у мужчин и пятой ведущей причиной у женщин. Рак желудка составила около 990000 новых зарегистрированных случаев и 738,000 смертей во всем мире в 2008 году [1]. Заражение хеликобактерной
, диета, курение и употребление алкоголя являются основными факторами, определяющими, влияющие на риск развития рака желудка [2], [3].
<Р> эпидермальный фактор роста (EGF) семьи сложная сеть тирозинкиназы рецепторов и лигандов, взаимодействующих с повлекут за собой различные сигнальные каскады. Семейство включает в себя четыре рецептора EGFR (HER1), HER2 (ErbB2), HER3 (ErbB3), и HER4 (ERBB4) [4]. Альтернативного сплайсинга, HER4 выражается в ряде изоформ. В juxtamembraneous области HER4, включение либо экзон 15b или экзон 16 приводит изоформ Jma или JMB, соответственно [5] - [7]. СОУ изоформы и не изоформы JMB могут быть обработаны, чтобы выпустить растворимый HER4 внутриклеточный домен (ICD), который локализуется в цитоплазме, ядре и митохондриях [8], [9]. Альтернативный сплайсинг в цитоплазматической области HER4 приводит к изоформ CYT1 и CYT2. Пропуск экзона 26 приводит к рецептору (CYT2), не имеющих 16 аминокислот рецептора полной длины (CYT1) [10].
<Р> лиганды семейства EGF являются эпидермальный фактор роста (EGF), трансформирующий фактор роста-альфа (TGF-альфа) и амфирегулином (AR), которые являются специфическими для EGFR; гепаринсвязывающий EGF-подобный фактор роста (HB-EGF), бетацеллюлин (BTC), и эпирегулин (ЭПР), которые связывают как EGFR и HER4; нейрегулин 1 (NRG1) и NRG2, которые связывают как HER3 и HER4; и, наконец, нейрегулин-3 и NRG4, которые являются специфическими для HER4 [11]. При связывании активирующий лиганд, рецепторы делают гомо- и гетеро-димеры. Состав партнеров димеризации и активирующих лигандов определяет сигнал, который будет трансдуцированных внутри клетки [12], [13]. Семейство EGFR играет различные роли в росте и поддержании многочисленных тканей, среди прочего, путем регуляции клеточного деления, апоптоза, дифференцировки и миграции. Дерегуляция сигнализации от этой системы связан с развитием и ростом раковых заболеваний [14] - [17]
<р> EGFR и HER2 хорошо известных онкогенов при раке желудка [18], [19].. Ингибирования HER2 антитело трастузумаб успешно улучшает прогноз при добавлении к химиотерапии у пациентов с HER2-положительным раком желудка продвинутых [20]. Ряд клинических испытаний также были проведены, чтобы проверить пригодность ингибиторов EGFR при раке желудка [21], [22]. HER3 и HER4 потенциально может также иметь важное значение в этиологии рака желудка; Тем не менее, информация об их роли при этом заболевании редка. В самом деле, очень мало известно о паттерном экспрессии полной системы EGF. Из-за интерактивного характера рецепторов эпидермального фактора роста и лигандов, уточнение механизмов регуляции EGF членов семьи с учетом всех требований рецепторов и их лигандов вместе.
<Р> Чтобы исследовать характер экспрессии ЭФР рецепторов и лигандов при раке желудка, мы получили ткани из опухоли и прилегающей нормальной ткани из того же самого пациента, подвергаемого операции по поводу рака желудка. Мы использовали парные образцы ткани, чтобы гарантировать против межиндивидуальную вариации, которая существует в базовом выражении системы EGF. Используя RT-КПЦР, мы количественно экспрессию мРНК четырех EGF рецепторов, включая сплайсинга изоформ HER4 и лигандов, активирующих эти рецепторы.

Материалы и методы

Отбор пациентов и сбор биопсий <бр>

в этом исследовании когорты 38 пациентов, перенесших операцию по поводу аденокарциномы желудка, пищевода или желудочно-пищеводного соединения были последовательно включены в период с июля 2008 года по ноябрь 2009 года Все лица предоставили информированное письменное согласие. Коллекция биопсий была одобрена региональными научными комитетами по этике Зеландии, Дании (номер журнала H-B-2008-049), а также создание биобанке было одобрено Датским агентством по защите данных (журнал номером 2008-41-2138). Биопсии были взяты из обеих опухолевой ткани и нормальной тканью. Все образцы биопсии были рассмотрены опытным патологоанатомом, чтобы подтвердить диагноз. Предварительно определенные клинические данные были получены из медицинских карт и отчетов патологии. Клинические характеристики пациентов приведены в таблице 1.

РНК экстракция
<р> Биопсия были помещены в РНК позже
(Life Technologies, Карлсбад, Калифорния, США) сразу после того, как удаление. РНК <ЕМ> позже
была удалена до выделения РНК, и был добавлен Trizol (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния, США). Образцы ткани гомогенизируют на TissueLyser (Qiagen, Chatsworth, CA, США). РНК из ткани был выделен в соответствии с протоколом изготовления для изоляции Trizol РНК (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния, США). Концентрации РНК были измерены на NanoDrop ND-1000 спектрофотометра. Качество РНК был протестирован на 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния, США) в соответствии с протоколом изготовления.

обратной транскрипции количественной полимеразной цепной реакции (RT-Q-PCR)
<р> кДНК синтезировали из 1 мкг тотальной РНК с использованием большой емкости кДНК с обратной транскрипцией Kit (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния, США). Полученную реакционную смесь разбавляют до общего объема 200 мкл
<р> 1 мкл кДНК использовали для кПЦР с использованием SYBR Green Master Mix (Roche, Базель, Швейцария) на LightCycler Roche 480 по адресу:. 95 ° C, 10 минут; 50 циклов при 95 ° С в течение 10 сек, определенной температуры отжига в течение 10 с, 72 ° С в течение 5 сек; 99 ° С в течение 1 сек; 59 ° С в течение 15 сек; 95 ° С в течение 1 сек; охлаждения до 40 ° С. Последовательности праймеров и температуры отжига приведены в таблице 2.
<р> ген, наиболее подходящий для нормализации определяли путем применения алгоритма Normfinder [23] к количественному концентрации GAPDH, b-актин, YWHAZ, SDHA и HMBS , SDHA оказался лучшим из пяти. Два образца были исключены из анализа из-за отсутствия обнаружения мРНК из любого из эталонных генов.

Иммунологическое
<р> Парафиновые ткани фиксировали в 4% забуференном параформальдегида из 13 представительных пациентов были исследованы иммуногистохимии с использованием C-ErbB-4 /HER-4, кроличьи поликлональные антитела разводили 1/50 в качестве первичного антитела (RB-9045-P1, Thermo Scientific, Уилмингтон, штат Делавэр, США). Для секции извлечения антигена кипятили в микроволновой печи в 10 мМ цитратном буфере, рН 6,0. Иммунореакция визуализировали биотинилированным козьим антикроличьим антителом разбавленного 1/200 (BA-1000, Vector Laboratories, Burlingame, CA, США), а затем предварительно сформированной авидина и биотинилированного пероксидазой макромолекулярная комплекс (ABC), разведенным 1/100 (код NR. PK-4000, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Реакция была разработана с использованием 3,3 -diaminobenzidine и counterstaining проводили с Hemalum Майера. В качестве отрицательного контроля, та же процедура была проведена без какого-либо первичного антитела.
<Р> С помощью Image Pro Plus (MediaCybernetics) интенсивность окрашивания представительных изображений опухоли по сравнению с окружающей слизистой оболочкой ткани оценивали. Два изображения образца опухоли и два изображения, окружающих слизистой оболочки были собраны из каждого образца ткани, и среднее арифметическое этих двух значений рассчитывалась и используется для статистического анализа и черчения. В течение нескольких образцов, только опухолевой ткани или только нормальная слизистая присутствовал и ни в какое сравнение экспрессии HER4 не было возможно для этих тканей. Соединенный Т-тест был использован, чтобы определить, является ли интенсивность опухолевых тканей отличается от интенсивности тканей слизистой оболочки.

Результаты

мРНК экспрессия рецепторов эпидермального фактора роста в желудочном
рака <р> РНК экстрагировали из 38 опухолей и соответствием образцов из соседней нормальной ткани у пациентов, перенесших операцию по поводу рака желудка был использован для RT-КПЦР количественными. Экспрессии мРНК семейства четырех рецепторов эпидермального фактора роста EGFR, HER2, HER3 и HER4 изображен на рисунке 1. Интересно отметить, что рецептор HER4 был подвергнут понижающей в раковой ткани по сравнению с нормальной тканью (р = 0,0004). Для HER2, мы увидели положительную регуляцию этого рецептора в раковую ткань, которая была очень близка к значимым (р = 0,0520). EGFR, и экспрессия мРНК HER3 был врагом изменен в опухолях по сравнению с нормальной тканью.
<Р> HER4 существует в виде различных изоформ в результате альтернативного сплайсинга. Juxtamembranous область может состоять либо из СОУ или JMB, и цитоплазматический область может состоять либо из CYT1 или CYT2. Деактивация наблюдается для полного экспрессии мРНК HER4 в раковой ткани применяется ко всем четырем вариантам рецептора (рис 2).
<Р> Чтобы лучше проиллюстрировать масштабы HER4 понижающей в опухолевой ткани, мы построили HER4 понижающего или повышающая регуляция для каждого отдельного пациента. Выражение HER4 мРНК в ткани опухоли минус экспрессии мРНК HER4 в норме у животных тканей (ΔHER4) изображен на рисунке 3. Значение ниже 0 представляет собой понижающей регуляции. Эта цифра наглядно показывает, что HER4 деактивация очень общий механизм, который имеет место в большинстве больных и независимо от локализации опухоли.

экспрессия мРНК семейства лигандов EGF при раке желудка
<р> TGF -α, амфирегулином и EGF специфически связываются с EGFR. Незначительный уровень экспрессии мРНК была обнаружена для EGF в обоих опухоли и нормальной ткани, и, следовательно, этот лиганд не был рассмотрен для дальнейшего анализа. TGF-α и амфирегулином оба были повышающей регуляции в раковой ткани по сравнению с нормальной тканью (фиг.4А и б). HB-EGF, бетацеллюлин и эпирегулин имеют сродство как EGFR и HER4, и все эти лиганды были также повышалась в раковой ткани (рис 4, г, д). Взятые вместе, это показывает, что все EGFR-активирующих лигандов повышающей регуляции в опухолях.
<Р> Из neuregulins, NRG1 и NRG2 связывают как HER3 и HER4. Мы не наблюдали никаких изменений в экспрессии либо альфа или бета вариантов из NRG1 и NRG2 (цифры 4F, G, H и I). Нейрегулин-3 и NRG4 связывать только HER4. Нейрегулин-3 не претерпела каких-либо изменений в экспрессии от нормального состояния к раковой ткани (рис 4j). Тем не менее, NRG4 была подавлена ​​в раковой ткани по сравнению с нормальной тканью (р = 0,0009) (рис 4k). Это свидетельствует о том, что оба HER4 и его специфического лиганда NRG4 являются понижающей регуляции при раке желудка.
<Р> Чтобы лучше проиллюстрировать масштабы NRG4 понижающей в опухолевой ткани с Д, регистрировалась зависимость NRG4 понижающего или повышающую регуляцию для каждого отдельного пациента. Выражение NRG4 мРНК в ткани опухоли минус экспрессии мРНК NRG4 в норме у животных тканей (ΔNRG4) изображен на рисунке 5.
<р> С учетом всех пациентов, у понижающей регуляции общего HER4 в их опухолевой ткани, в 82% из них NRG4 также снижение экспрессии и у 86% одного или более из EGFR-совместно лигандов (HB-EGF, эпирегулин, бетацеллюлин) был повышающей регуляции. В 36% больных с общей HER4 понижающей, все три EGFR совместно лигандов повышающей регуляции.

Протеин выражение ее с помощью иммуногистохимии

Из-за посттранскрипционных правил, паттерны экспрессии мРНК определяется RT-кПЦР не может представлять собой паттерн экспрессии белка. Для того, чтобы гарантировать, что наблюдаемое снижение экспрессии мРНК HER4 в раковой ткани больных раком желудка также отражается на уровне белка, мы проводили иммуногистохимическое окрашивание на фиксированных формалином в парафин ткани от всех пациентов, включенных в исследование.
<р> Под количественной оценки интенсивности окрашивания HER4 в представительных районах tumor- и окружающие ткани, мы обнаружили, опухолевую ткань, чтобы иметь значительно меньшую интенсивность HER4 окрашивания по сравнению с окружающей нормальной слизистой оболочке (р = 0,0029) (Рисунок 6) .
<р> Типичные микрофотографии окрашиванием представлены на рисунке 7. в нормальной слизистой оболочки желудка был сильный HER4 иммунореакция (рисунок 7 а). Особенно базальная часть цитоплазмы и боковой клеточной мембраны поверхностных эпителиальных клеток были сильно иммунореактивная для HER4 (Рисунок 5 б). Также париетальные клетки показали очень сильную HER4 иммунореактивности (Рисунок 7 С и D). Подслизистой и мышечные слои были отрицательными. В железистых структур особенно париетальные клетки показали очень сильную HER4 иммунореактивности (Рисунки 7 и Г). Отрицательные контроли, выполненные без какого-либо первичного антитела не приводило к окрашиванию.
<Р> В рака желудка мелкие участки с опухолевыми клетками имели положительную иммунную реакцию на HER4 и ткань отрицательной опухоли сильно контрастировало с окрашенном нормальной слизистой оболочки, прилегающей к опухоль (рис 7). В центральных частях опухолевой ткани почти все клетки были полностью отрицательными, кроме небольших скоплений клеток, которые, возможно, имели различные мембраны окрашивания.

Обсуждение
<р> Семейство ЭФР состоит из взаимодействующих сеть рецепторов и лигандов, которые должны быть рассмотрены в целом, чтобы понять регуляцию сигнализации в семье EGF. Мы определили картину регуляции семейства EGF в опухолевой ткани у больных раком желудка, а также совпадающий с нормальной тканью из одних и тех же пациентов.
<Р> Мы нашли сигнальный потенциал EGFR быть повышающей регуляции в опухолевой ткани через повышающую регуляцию всех EGFR активирующих лигандов, и мы также обнаружили положительную регуляцию HER2 в ткани опухоли, которая была очень близка к значимым (р = 0,0520). Это хорошо согласуется с имеющимися данными, которые показывают, что оба EGFR и HER2 связаны с плохим прогнозом при раке желудка [19]. Важность HER2 при раке желудка свидетельствует тот факт, что HER2 ингибирующие антитела Герцептин является единственным одобренным средством для целенаправленного лечения рака желудка [24].
<Р> Для HER3, мы не наблюдали каких-либо экспрессивной положение о уровень мРНК. Тем не менее, несколько исследований по HER3 при раке желудка приписывали роль для HER3 при раке желудка. HER3 было связано с плохой выживаемостью, и выражение положительной HER3 белок был обнаружен с помощью иммуногистохимии в 18,6% образцов желудочного рака по сравнению с только 2,0% от неопухолевых образцов [25] - [27]. Мы не нашли более высокую экспрессию HER3 при раке желудка по сравнению с нормальной ткани в нашем исследовании. Тем не менее, разница в методах, используемых в исследованиях (иммуногистохимии против RT-КПЦР) может объяснить некоторые расхождения в результатах. Кроме того, мы были в состоянии описать картину регуляции у каждого пациента, а не в бассейне онкологических больных и пула контроля лиц, и это также может объяснить разницу в результатах, полученных в двух исследованиях.
<р> Мы обнаружили заметное понижающей регуляции как HER4 и его активирующего лиганда NRG4 в опухолевой ткани. Наши результаты подкрепляется тем фактом, что мы также нашли понижающей регуляции, когда мы использовали дополнительные анализы для количественного определения специфических изоформ HER4. Использование иммуногистохимии, мы подтвердили, что нормальная желудочная ткань положительна для HER4, в то время как раковая ткань имеет очень низкий или нет HER4 окрашивания.
<Р> снижение экспрессии экспрессии мРНК HER4 в опухолевой ткани может быть приписана к уменьшению число клеток, экспрессирующих HER4 или к уменьшению экспрессии HER4 во всех клетках, экспрессирующих HER4. Из наших иммуногистохимических окрашиванием, мы видим, что в желудочном раковых образований только незначительные скопления с опухолевыми клетками имели положительную иммунную реакцию на HER4, в то время как подавляющее большинство опухолевых клеток были негативными. Это указывает на то, что число клеток, экспрессирующих HER4, которая уменьшается в опухолях. В отличие от ткани опухоли, нормальная ткань имела очень сильные immunoreactions к HER4. Интересно, что это особенно слизь клетки, продуцирующие и соляную кислоту по производству теменной клеток, которые экспрессируют белок HER4.
<Р> Роль HER4 в раковой болезни является спорным. При раке мочевого пузыря, RT-КПЦР количественное определение HER4 и его лигандов показывают, что HER4 ассоциируется с лучшей выживаемостью. В частности, совместная экспрессия HER4 вместе со своим специфическим лигандом, NRG4, тесно коррелирует с лучшей выживаемостью [28]. Точно так же, HER4 связано с улучшением общей и безрецидивной выживаемости рака шейки матки [29]. В гортани плоскоклеточного рака, HER4 теряется в конце стадии опухолей [30], и HER4 встречается главным образом в странах с низким и стадии неметастатической ксенотрансплантатов опухолей при раке поджелудочной железы [31].
<Р> С другой стороны, экспрессия белка HER4, как определено с помощью иммуногистохимии был связан с дистальным метастазирования и снижение выживаемости в оральных плоскоклеточного рака [32]. В исследовании колоректального рака, в котором картина экспрессии белка также определяли с помощью иммуногистохимии, пациенты на ранней стадии имели более низкий процент HER4 избыточной экспрессии, чем у пациентов на поздней стадии [33]. В злокачественных опухолей центральной нервной системы, HER4 обладает также роль опухолью содействия [34], [35].
<Р> Не так много известно о роли HER4 при раке желудка. Нет экспрессии мРНК HER4 не был обнаружен в двух желудочных линиях раковых клеток [36]. Экспрессия белка HER4, как обнаружено с помощью иммуногистохимии было обнаружено, коррелирует с ранней стадии, более низкого сорта, а также отсутствие метастазов в лимфатических узлах при раке желудка [25]. Это очень хорошо согласуется с другом исследовании, расследовавшей профили экспрессии генов в долгосрочных выживших с метастатическим раком желудка лечили химиотерапией, в которых авторы указанной возможной роли HER4 повышающую регуляцию у этих пациентов [37]. Вместе с нашими настоящими результатами, эти данные также свидетельствуют о том, что передача сигналов HER4 имеет защитную функцию против канцерогенеза в области желудка. Одно исследование показало, ген HER4 быть часто усиливается при раке желудка [38]. Тем не менее, результаты наших исследований указывают на то, что это не приводит к уровню экспрессии HER4, так как мы нашли понижающей регуляции мРНК HER4 и экспрессии белка, а не положительную регуляцию.
<Р> Даже если мы не нашли выражение EGFR регулироваться, сигнальный потенциал через этот рецептор увеличивается на повышающую регуляцию всех его лигандов. Это включает в себя лиганды совместно с HER4: HB-EGF, бетацеллюлин и эпирегулин. В дополнение к аутокринном активации EGFR, усиление активности этих лигандов потенциально приводит к увеличению активности HER4. Активация EGFR пути действительно путь для клеток становится все более канцерогенным. Тем не менее, принимая во внимание HER4 иметь анти-канцерогенные функции, сопутствующее активации этого рецептора остановит пролиферативную преимущество активации EGFR. Можно предположить, что этот потенциал активации HER4 избегают сопутствующей понижающей рецептора и его специфического лиганда NRG4.
<Р> У пациентов с раком мочевого пузыря, комбинированный HER4 /NRG4 блок сигнализации может быть ингибирующее рост, а совместная экспрессия HER4 вместе с NRG4 сильно коррелируют с лучшей выживаемостью, если эти два белка действуют вместе, а не по отдельности [28].
<р> Мы также провели анализ, чтобы сравнить выражение HER4 на выживание пациента. Мы сделали наблюдать тенденцию к высокой экспрессии HER4 коррелирует с лучшей выживаемостью (результаты не показаны), тем не менее, из-за ограничений в количестве пациентов, включенных в исследование, этот результат не был найден, чтобы быть существенным и дальнейшие исследования будут иметь чтобы выяснить, если корреляция между экспрессией HER4 и выживаемости можно найти в рак желудка. Корреляцию уровня экспрессии рецепторов эпидермального фактора роста в присутствии метастазов в лимфатических и инвазии опухоли показал только к HER2 коррелируют обратно к этим параметрам, тогда как корреляция не была обнаружена для оставшегося семейства EGF (результаты не показаны).
<р> В заключение, наши результаты показывают новую роль для HER4 при раке желудка. Интересно, что мы обнаружили, как HER4 и его специфического лиганда NRG4 быть подавлена ​​в раковой ткани. Это сопровождается повышением сигнализации потенциала EGFR через повышающую регуляцию всех его лигандов и повышающей регуляции HER2.

• PLoS ONE: микроРНК-338 угнетает рост, инвазию и метастазирование рака желудка с помощью таргетирования NRP1 Expression
• PLoS ONE: Co-Поставка доксорубицина и SATB1 shRNA от термочувствительного магнитной катионных липосом для рака желудка…