Magenkrebs ist eine Hauptursache der durch Krebs verursachten Todesfälle bei Männern und Frauen. Den epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptoren sind EGFR, HER2, HER3 und HER4. Von den vier epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptoren, EGFR und HER2 sind bekannt bei Magenkrebs beteiligt Onkogene. Kleine, aber ist bekannt über die Rolle von HER3 und HER4 bei dieser Krankheit gespielt. Wir erhielten Proben aus dem Tumor und dem benachbarten normalen Gewebe von dem gleichen Patienten, der einer Operation für Magenkrebs gepaart. Verwendung von RT-qPCR quantifizierten wir die mRNA-Expression der vier Rezeptoren einschließlich der HER4 Splicing-Isoformen und alle Liganden dieser Rezeptoren aktivieren. Verwendung von Immunhistochemie, die Proteinexpression von HER4 wurde quantifiziert. Wir fanden, dass HER2-mRNA-Expression in Tumorgewebe im Vergleich zu dem angepassten normalen Gewebes (p = 0,0520) hochreguliert wurde. Alle Liganden mit Affinität für EGFR wurden hochreguliert, während die Expression von EGFR unverändert war. Interessanterweise fanden wir die mRNA-Expression von HER4 (p = 0,0002) und sein Ligand NRG4 (p = 0,0009) im Tumorgewebe herunterreguliert werden, im Vergleich zu dem angepassten normalen Gewebe. HER4 Herunterregulierung wurde für alle alternativ gespleißte Isoformen dieses Rezeptors demonstriert. Diese Ergebnisse unterstützen die Beteiligung von EGFR und HER2 bei Magenkrebs und schlagen eine interessante Assoziation von reduzierten HER4-Expression mit der Entwicklung von Magenkrebs
Citation:. Nielsen, Friis-Hansen L, Poulsen SS, Federspiel B, Sorensen BS (2014) Expression des EGF-Familie in Magenkrebs: das Herunterregulieren von HER4 und seine aktivierenden Liganden NRG4. PLoS ONE 9 (4): e94606. doi: 10.1371 /journal.pone.0094606
Editor: Rupesh Chaturvedi, Vanderbilt University School of Medicine, Vereinigte Staaten von Amerika
Empfangen: 8. Juli 2013; Akzeptiert: 19. März 2014; Veröffentlicht: 11. April 2014
Copyright: © 2014 Nielsen et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden
Finanzierung:. Dänischen Krebs Society # R2-A247-09-S2, dänische MRC #FSS 09072153. die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung zu veröffentlichen oder um die Herstellung des Manuskripts
Konkurrierende Interessen:. die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen.
Einführung
Magenkrebs ist die dritthäufigste Ursache der durch Krebs verursachten Todesfälle bei Männern und die fünfthäufigste Ursache bei Frauen. Magenkrebs entfielen rund 990.000 neu registrierten Fälle und 738.000 Todesfälle weltweit im Jahr 2008 [1]. Eine Infektion mit Helicobacter pylori Der epidermale Wachstumsfaktor (EGF) Familie ein komplexes Netzwerk von Tyrosinkinase-Rezeptoren und Liganden interagieren verschiedene Signalkaskaden zu induzieren. Die Familie umfasst die vier Rezeptoren EGFR (HER 1), HER2 (ErbB2), HER3 (ErbB3) und HER4 (ErbB4) [4]. Durch alternatives Spleißen wird HER4 in einer Anzahl von Isoformen exprimiert. Im juxtamembraneous Bereich HER4, Aufnahme von entweder Exon 15b oder Exon 16 Ergebnisse in den Jma oder JMB Isoformen bzw. [5] - [7]. Die JMA Isoform und nicht der JMB-Isoform kann eine lösliche HER4 intrazelluläre Domäne (ICD), die im Zytoplasma, Zellkern lokalisiert, und Mitochondrien [8], [9] zu veröffentlichen verarbeitet werden. Alternatives Spleißen in der zytoplasmatischen Region HER4 entstehen die CYT1 und Cyt2 Isoformen. Skipping von Exon 26 führt zu einem Rezeptor (Cyt2) fehlen 16 der Aminosäuren des Volllängen-Rezeptor (CYT1) [10]. Die Liganden des EGF-Familie sind epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), transformierenden Wachstumsfaktor-α (TGF-α) und Amphiregulin (AR), der für EGFR spezifisch sind; Heparin-bindender EGF-ähnlicher Wachstumsfaktor (HB-EGF), Betacellulin (BTC) und Epiregulin (EPR), die sowohl EGFR und HER4 binden; Neuregulin 1 (NRG1) und NRG2, die sowohl HER3 und HER4 binden; und schließlich NRG3 und NRG4, die spezifisch sind für HER4 [11]. Wenn eine aktivierende Ligandenbindung, machen die Rezeptoren Homo- und Hetero-Dimere. Die Zusammensetzung der Dimerisierung Partner und aktivierenden Liganden bestimmt das Signal innerhalb der Zelle transduziert werden [12], [13]. Die EGFR Familie spielt verschiedene Rollen in das Wachstum und die Pflege von zahlreichen Geweben unter anderem durch Regulierung der Zellteilung, Apoptose, Differenzierung und Migration. Die Deregulierung der Signalisierung von diesem System ist mit Entwicklung und das Wachstum von Krebserkrankungen [14] - [17] EGFR und HER2 sind bekannte Onkogene bei Magenkrebs [18], [19].. Der HER2 hemmenden Antikörper Trastuzumab verbessert erfolgreich Prognose, wenn sie der Chemotherapie bei Patienten mit fortgeschrittenem HER2-positivem Magenkrebs hinzugefügt [20]. Einige klinische Studien haben auch die Verwendbarkeit von EGFR-Inhibitoren in Magenkrebs [21], [22] zu testen, durchgeführt. HER3 und HER4 könnte möglicherweise auch wichtig sein, in der Ätiologie von Magenkrebs; aber Informationen über ihre Rolle bei dieser Krankheit ist spärlich. Tatsächlich ist wenig über die Expressionsmuster des vollständigen EGF-System bekannt. Auf Grund des interaktiven Charakters der EGF-Rezeptoren und Liganden, die Klärung der Mechanismen der Regulation der EGF Familienmitglieder Anforderungen unter Berücksichtigung aller Rezeptoren und deren Liganden zusammen. Um das Expressionsmuster der EGF-Rezeptoren und Liganden untersuchen in Magenkrebs, erhalten wir Gewebe aus dem Tumor und dem benachbarten normalen Gewebe von dem gleichen Patienten, der einer Operation für Magenkrebs. Wir verwendeten Proben gepaart Gewebe gegen die interindividuellen Schwankungen, um sicherzustellen, dass in der Basislinie Expression des EGF-System vorhanden ist. Mit RT-qPCR, wir quantifiziert, um die mRNA-Expression der vier EGF-Rezeptoren, einschließlich der HER4 Splicing-Isoformen und die Liganden dieser Rezeptoren aktivieren. Die Patientenauswahl und Sammlung von Biopsien In dieser Kohortenstudie, 38 Patienten für das Adenokarzinom des Magens, der Speiseröhre oder gastroösophagealen Übergang wurden nacheinander aufgenommen von Juli 2008 bis November 2009. Alle Personen zur Verfügung gestellt, eine informierte schriftliche Genehmigung einer Operation unterziehen. Sammlung von Biopsien wurde von den regionalen wissenschaftlichen Ethik-Kommissionen von Seeland, Dänemark (Zeitschrift Nummer H-B-2008-049) genehmigt, und die Einrichtung einer Biobank wurde von der dänischen Datenschutzbehörde (Journal Nummer 2008-41-2138) zugelassen. Biopsien wurden sowohl aus Tumorgewebe und dem benachbarten normalen Gewebe entnommen. Alle Biopsie-Proben wurden von einem erfahrenen Pathologen die Diagnose zu bestätigen. Vordefinierte klinischen Daten wurden aus medizinischen Charts und Pathologie Berichte extrahiert. Die klinischen Charakteristika der Patienten sind in Tabelle 1 RNA-Extraktion Biopsien in RNA platziert wurden später cDNA wurde aus 1 ug gesamt-RNA unter Verwendung von High Capacity cDNA Reverse Transkription-Kit (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) synthetisiert. Das endgültige Reaktionsgemisch wurde auf ein Gesamtvolumen von 200 uL verdünnt 1 ul cDNA für qPCR verwendet wurde SYBR green-Master-Mix (Roche, Basel, Schweiz) auf einem Roche LightCycler 480 bei Verwendung. 95 ° C, 10 Minuten; 50 Zyklen von 95 ° C für 10 sec, Annealing spezifischen Temperatur für 10 sec, 72 ° C für 5 Sekunden; 99 ° C für 1 sec; 59 ° C für 15 sec; 95 ° C für 1 sec; Abkühlen auf 40 ° C. Die Primersequenzen und Glühtemperaturen sind in Tabelle 2 angegeben Das Gen am besten geeignet für die Normierung bestimmt wurde durch die Normfinder Algorithmus Anwendung [23] zu den quantifizierten Konzentrationen von GAPDH, β-Actin, YWHAZ, SDHA und HMBS . SDHA drehte das Beste der fünf erwiesen. Zwei Proben wurden von den Analysen, da kein Nachweis von mRNA, die aus einem der Referenzgene ausgeschlossen. Paraffin eingebettetem Gewebe in 4% gepuffertem Paraformaldehyd aus 13 repräsentativen Patienten fixiert wurden untersucht durch Immunhistochemie c-erbB-4 /HER-4, Kaninchen polyklonalen Antikörper 1/50 als der primäre Antikörper (RB-9045-P1, Thermo Scientific, Wilmington, DE, USA) verdünnt. Für Antigen-Retrieval-Schnitte wurden in 10 mM Citratpuffer, pH 6,0 in Mikrowellenofen gekocht. Die Immunreaktion von biotinyliertem Ziege-Anti-Kaninchen-Antikörper, verdünnt 1/200 sichtbar gemacht wurde (BA-1000, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA), gefolgt von einem vorgeformten Avidin und biotinylierter Meerrettich-Peroxidase-Komplex makromolekulares (ABC), verdünnt 1/100 (Code nr. PK-4000, Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Die Reaktion wurde durch die Verwendung von 3,3 -diaminobenzidine entwickelt und Gegenfärbung wurde mit Mayers Hämalaun durchgeführt. Als Negativkontrolle wurde das gleiche Verfahren ohne primären Antikörper durchgeführt. Mit Bild-Pro Plus (MediaCybernetics), um die Färbungsintensität der repräsentativen Bilder des Tumors im Vergleich zu den umgebenden Gewebes Schleimhaut geschätzt. Zwei Bilder von Tumorprobe und zwei Bilder der umliegenden Mukosa wurden aus jeder Gewebeprobe gesammelt und der Durchschnitt der beiden Werte wurde berechnet und für statistische Auswertungen und Plotten verwendet. Für ein paar Proben war nur Tumorgewebe oder nur normale Schleimhaut vorhanden und kein Vergleich von HER4-Expression war für diese Gewebe möglich. Gepaart t-Test wurde verwendet, um festzustellen, ob die Intensität der Tumorgewebe von der Intensität der Schleimhaut Gewebe unterschiedlich war.
, Ernährung, Rauchen und Alkoholkonsum sind entscheidend das Risiko von Magenkrebs [2] zu beeinflussen, [3].
Materialien und Methoden
(Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) unmittelbar nach Entfernung. RNA später
wurde vor der RNA-Isolierung entfernt und Trizol (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) gegeben. Die Gewebeproben wurden auf einem Tissuelyser (Qiagen, Chatsworth, CA, USA) homogenisiert. RNA aus Gewebe wurde nach dem Protokoll des Herstellers isoliert für Trizol RNA-Isolierung (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). RNA-Konzentrationen wurden auf einem Nanodrop ND-1000 Spektrophotometer gemessen. RNA-Qualität auf einem 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) gemäß dem Protokoll des Herstellers getestet.
reverse Transkription quantitative Polymerase-Kettenreaktion (RT-q-PCR)
Immunostaining
Ergebnisse
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