PLoS ONE: Die Überexpression von eukaryotischen Translation Initiation Factor 5A2 (EIF5A2) korreliert mit einer Zelle Aggressivität und Schlechte Überleben in der Magenkrebs

Abstrakt

eukaryontischen Translationsinitiationsfaktor 5A2 (EIF5A2) spielt eine wichtige Rolle in der Tumorprogression und Prognose Auswertung. Allerdings gibt es wenig Informationen über seine mögliche Rolle bei Magenkrebs zur Verfügung. Diese Studie soll die Funktion von EIF5A2 in der Tumorprogression und seine möglichen Mechanismen zu untersuchen. EIF5A2 Expression wurde in menschlichen Magenkrebszelllinien, die unsterblich gemacht Magenschleimhaut epithelialen Zelllinie (GES-1) und menschlichen Magenkrebsgewebe und umgeworfen durch RNA-Interferenz oder upregulated durch EIF5A2 Plasmidtransfektion gemessen. Die Zellproliferation, Migration und Invasion wurden bewertet In-vitro-
. Die Downstream-Ziele von EIF5A2 wurden mittels Western Blot untersucht. EIF5A2 und seine potentielle Ziel Metastase-associated protein 1 (MTA1) Expression wurden in 160 Paare von menschlichen Magenkrebs und angrenzenden Nicht-Tumorproben mittels Immunhistochemie (IHC) -Färbung, und ihre Korrelation mit klinisch-pathologischen Eigenschaften und Überleben untersucht wurde untersucht. Preissturz von EIF5A2 oder in MTA1
eine scheinbare Unterdrückung der HGC27 Zellproliferation, Migration und Invasion verursacht. Nach dem Zuschlag von EIF5A2
in HGC27 Zellen wurden E-Cadherin Ebenen nach oben reguliert und Vimentin, Cyclin D1, Cyclin D3, C-MYC und MTA1 Spiegel wurden nach unten reguliert. Hochregulation von EIF5A2 in MKN45 Zellen resultierte in der Umkehrung. IHC Ergebnisse zeigten eine positive Korrelation zwischen EIF5A2 und MTA1 Expression in Magenkrebs ( P
< 0,001). Sowohl EIF5A2 und MTA1 Überexpression wurden mit pT-Stadium korreliert ( P
= 0,018 und P
= 0,042), pN Stufe ( P
= 0,037 und P
= 0,020) und lymphovascular Invasion ( P
= 0,016 und P
= 0,044). EIF5A2 oder MTA1 Überexpression war signifikant mit schlechten Gesamtüberleben und die krankheitsfreie Überleben (Alle P
< 0,05). Multivariate Analysen EIF5A2 als unabhängiger Prädiktor für sowohl das Gesamtüberleben identifiziert ( P
= 0,012) und das krankheitsfreie Überleben ( P
= 0,008) bei Magenkrebs-Patienten. Unsere Ergebnisse zeigen, dass EIF5A2 upregulation spielt eine wichtige Rolle bei der onkogenen Magenkrebs. EIF5A2 können eine neue Prädiktor für schlechte Überleben darstellen und ist ein potenzielles therapeutisches Ziel für Magenkrebs

Citation:. Meng Q-B, Kang W-M, Yu J-C, Liu Y-Q, Ma Z-Q, Zhou L, et al. (2015) Die Überexpression von eukaryotischen Translation Initiation Factor 5A2 (EIF5A2) korreliert mit einer Zelle Aggressivität und Schlechte Überleben in der Magenkrebs. PLoS ONE 10 (3): e0119229. doi: 10.1371 /journal.pone.0119229

Academic Editor: Juni Li, Sun Yat-sen University Medical School, CHINA

Empfangen: 22. Januar 2014; Akzeptiert: 29. Januar 2015; Veröffentlicht: 20. März 2015

Copyright: © 2015 Meng et al. Dies ist ein offener Zugang Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons Attribution verteilt, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, sofern der Autor und Quelle gutgeschrieben

Finanzierung: Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse aus der Beijing Municipal Natural science Foundation (Nr 7.132.209), Provinz Hubei Gesundheit und Familie wissenschaftliches Forschungsprojekt (Nr WJ2015MB137) und Major Wissenschaft und Technologie-Projekte in Beijing City (Nr D141100000414004) zu planen. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Magenkrebs (GC) ist ein hoch metastatische Erkrankung und einer der letalen der gastrointestinalen Tumoren. [1] Trotz der Fortschritte in der chirurgischen und zytotoxische Therapien für GC, die derzeit verfügbaren Therapien an Patienten mit fortgeschrittenem GC sind sehr begrenzt. [2, 3] neue therapeutische Strategien zu entwickeln, ist es von entscheidender Bedeutung ist es, die molekularen Mechanismen aufzuklären, die die invasive und metastatische Eigenschaften von GC-Zellen fördern.

eukaryotischen Translationsinitiationsfaktor 5A2 (EIF5A2) befindet sich an menschliche Chromosom 3q26.2, und ist ein Mitglied der eIF5A
Genfamilie. [4] die Überexpression von EIF5A2
mRNA in bestimmten menschlichen Krebszellen, im Gegensatz zu Überexpression auf menschlichen Hoden beschränkt und Teile des Gehirns, schlägt EIF5A2
ist ein potenzielles Onkogen. [4] Frühere Studien fanden heraus, dass EIF5A2 in vielen menschlichen Krebsarten wie duktalen Adenokarzinom des Pankreas, Eierstockkrebs, Darmkrebs und Melanome hepatozellulären Krebs, Lungenkrebs, überexprimiert und zu einer schlechten Überleben von Krebspatienten Zelle und /oder Krebs korreliert Aggressivität. [5-11] Jüngste Studien haben gezeigt, dass EIF5A2 karzinogenen Fähigkeiten durch seine Aktivierung des EIF5A2-MTA1 /C-MYC Achse [8]. jedoch wenig Informationen über EIF5A2 Proteinexpression, ihre prognostische Bedeutung und mögliche onkogene Rolle in der menschlichen GC zur Verfügung.

Folglich untersuchten wir zunächst die Expression von EIF5A2
in menschlichen GC-Zelllinien und ihre mögliche Rolle bei der Zellproliferation, Migration und Invasion. Als nächstes identifiziert wir mögliche Downstream-Zielproteine, die Auswirkungen der EIF5A2 Verarmung oder upregulation auf die zellulären Funktionen von GC-Zellen aufzuklären. Schließlich untersuchten wir die Korrelation von EIF5A2 und MTA1 Expression in menschlichen GC und seine Bedeutung für klinisch-pathologischen Faktoren und das Überleben bei Patienten GC.

Materialien und Methoden

Ethik Statement

Die Studie von der Ethikkommission der PUMCH, chinesische Akademie der Medizinischen Wissenschaften und Peking Union Medical College, Beijing, China, und eine schriftliche Einverständniserklärung genehmigt wurde, wurde von jedem Patienten erhalten.

Patienten und Proben

GC Gewebe und abgestimmt benachbarten nicht-Tumorgewebeproben wurden von 160 aufeinanderfolgenden Patienten, die chirurgische Resektion für primäre GC in Peking Union Medical College Hospital (PUMCH) zwischen Januar 2002 und Dezember 2006 unterzog sich keinem der Patienten eine neoadjuvante Chemotherapie oder Strahlentherapie erhalten. Die Überlebensdaten wurden auf der Grundlage sowohl der Patientenakten und Telefon-Follow-up erhalten. Die mediane Nachbeobachtungszeit betrug 53 Monate (Bereich 1-113 Monate). Weitere zwei Paare von frischem GC Geweben und nicht-kanzeröse Gewebe Magenschleimhaut wurden von Patienten erhalten, die chirurgische Resektion für schlecht differenziertes Adenokarzinom des Magens bei PUMCH 2014
unterzog

Wir definierten lymphovascular invasion als das Vorhandensein von Tumorzellen Emboli innerhalb von Räumen durch eine deutlich sichtbar Endothelauskleidung in der Peripherie des Tumorschnitten umgeben. [12, 13] die Patienten wurden nach der 7. Ausgabe der Klassifikations AJCC TNM statt für Karzinome des Magens. [14] Lauren histotype wurde in Darm- und Diffuse- geteilt gemischte Kategorien. [15]

Zellkultur

Fünf Typen von humanen GC-Zelllinien wurden aus dem Zellzentrum von Shanghai Institute erhalten für Biologische Wissenschaften (AGS und MGC803, Shanghai, China) und das Zellzentrum des Instituts für Medizinische Grundlagenwissenschaften (MKN45, SGC7901 und HGC27, Beijing, China). Die verewigte Magenschleimhaut epithelialen Zelllinie GES-1 wurde von Peking ComWin Biotech Co., Ltd (Beijing, China) erhalten. Alle Zellen wurden in RPMI 1640-Medium mit 10% fötalem Rinderserum (FBS, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) bei 37 ° C in einer befeuchteten Luftatmosphäre mit 5% CO _{2. Die Zellen in der logarithmischen Wachstumsphase wurden für weitere Experimente verwendet.}

Sturz EIF5A2 oder MTA1 durch kleine interferierende RNAs (siRNAs)

Die siRNA spezifisch gegen EIF5A2 und MTA1 [16] und ihre nicht-Targeting Kontroll-siRNA (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) wurden für diese Studie chemisch synthetisiert. Die EIF5A2 siRNA-Sequenzen waren wie folgt:
: 5'-GGAUCUUAAACUGCCAGAATT-3 ', 5'-UUCUGGCAGUUUAAGAUCCTT-3';: 5'-GGUUCACCUUGUUGGAAUUTT-3 ', 5'-AAUUCCAACAAGGUGAACCTT-3; und: 5'-GCUUCCAGCACUUACCCUATT-3 ', 5'-UAGGGUAAGUGCUGGAAGCTT-3; die nicht-Targeting-Steuerung (NC1) siRNA: 5'-UUC UCC GAA CGU GUC ACG UTT-3 '; 5'-ACG CAC UGA GUU CGG AGA ATT-3 '). Die MTA1 siRNA Sequenzen (Target 2 siRNA, T2-siRNA) waren: 5'-GCUGAGAGCAAGUUAAAGCdTdT-3 ', 5'-GCUUUAACUUGCUCUCAGCdTdT-3') und FAM-markierte siRNA (AM4620) wurde als Non-Targeting-Kontroll-siRNA (NC2 verwendet ).

Vierundzwanzig Stunden nach der in sechs-Well-Platten Plattierung wurden GC-Zellen, die mit 100 pmol EIF5A2-siRNA, MTA1-siRNA oder siRNA steuern Lipofectamine 2000 Transfektionsreagenz (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA mit ) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die Zellen wurden für Western-Blot bei 48 h nach der Transfektion geerntet.

Plasmidkonstruktion und transiente Transfektion

EIF5A2 Expressionsvektor (plRES2-EGFP-EIF5A2) von Life Technologies synthetisiert. Die Zellen wurden mit plRES2-EGFP-EIF5A2 oder der Kontroll-Plasmid unter Verwendung von Lipofectamin 2000 (Life Technologies) transfiziert gemäß den Anweisungen des Herstellers.

Real-time quantitative RT-PCR

Die Gesamt-RNA isoliert wurde mit TRIzol-Reagenz (Life Technologies) gemß dem Protokoll des Herstellers. PCR wurde unter Verwendung der Sequenzen für EIF5A2 ausgeführt: vorwärts: 5'-AACTGCCAGAAGGTGAACTAGG-3 '; Reverse: 5 'GTTTCCGTTTATTTGCAGGGT-3' und die Sequenzen für MTA1: vorwärts: 5'-CCGGGCCTGCGAGAGCTGTTACAC-3 '; Reverse: 5'-CACGGCTTCCAGCGGCTTGCGTAC-3 '. PCR wurde unter Verwendung UltraSYBR Mixture (CWbio.Co.Ltd) durchgeführt nach dem Protokoll des Herstellers. Die reverse Transkription wurde durchgeführt, eine PrimeScript RT Master Mix Kit (Takara Biotechnology Co. Ltd., Dalian, China). Verwendung eines SYBR Premix Ex Taq II-Kit (Takara Biotechnology Co. Ltd.) Die cDNA-Produkte wurden auf Echtzeit-PCR unterzogen. Echtzeit-PCR wurde in einem StepOnePlus Real-Time-PCR-System (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) mit dem folgenden Programm durchgeführt: 15 Sekunden 95 ° C für 10 Minuten, gefolgt von 40 Zyklen von 95 ° C und 60 ° C für 1 Minute. GAPDH
mRNA in jeder Probe als endogene Kontrolle quantifiziert.

Western-Blot

Die Proteinkonzentration wurde ein BCA-Protein-Assay-Kits (Thermo Scientific Pierce) quantifiziert. Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) wurde verwendet Zelllysaten zu trennen. Proteine ​​wurden auf PVDF-Membranen übertragen und blockiert mit Tris-gepufferter Kochsalzlösung und 0,1% Tween 20 (TBST) mit 5% Rinderserumalbumin, und dann mit den folgenden primären Antikörpern inkubiert bei 4 ° C über Nacht: Kaninchen-anti-EIF5A2 oder -C- MYC (1: 1000; Epitomics, USA, KatalogȪ9-1 oder 1472-1), Kaninchen-Anti-MTA1, -E-Cadherin oder -vimentin (1: 1000; Cell Signaling, USA, Catalogȴ7, 3195 oder 5741 ) oder Maus-anti-GAPDH (1: 1000; Santa Cruz, Catalog # sc-25778). Die Membranen wurden dreimal mit TBST gewaschen und mit Meerrettich-Peroxidase (HRP) inkubiert -konjugiertem anti-Kaninchen- oder anti-Maus-Sekundärantikörper (1: 3000; Santa Cruz, USA, Katalog # sc-2004 oder sc-2005) für 1 h bei Raumtemperatur. Die Proteinbanden wurden mittels ECL-Nachweisreagenzien (Pierce, USA) sichtbar gemacht. Die relative Proteinexpressionsniveaus waren normiert auf GAPDH.

Zellproliferationsassays

Die Verbreitung von HGC27 und MKN45 Zellen wurde unter Verwendung eines Zellzählung Kit-8 (CCK-8) (Dojindo, Japan geprüft ) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Kurz gesagt, 24 h nach der Transfektion mit siRNA oder Plasmid wurden die Zellen in einer Dichte von 1 × 10 ausgesät ^{4 Zellen /Vertiefung in Platten mit 96 Vertiefungen und kultiviert für 0, 24, 48 und 72 h. Dann werden in den unterschiedlichen Zeitpunkten 10 ul CCK-8 Lösung wurde 2 h in jede Vertiefung und inkubiert. Die Absorption wurde bei 450 nm auf einem Plattenleser lesen.}

Transwell Assays

Die Migrations- und invasive Fähigkeit von GC-Zellen wurde 24-Well Transwell-Zellkulturkammern (8.0μm Porengröße erkannt verwenden, Costar , Cambridge, MA, USA) nach den Anweisungen des Herstellers. Für die Zellinvasionstest wurden die Membranen Einsatz vorbeschichtet mit Matrigel (BD, San Diego, CA, USA). Für die Zellmigrationstest wurde keine Matrigel verwendete. Bei 24 h nach der Transfektion wurden die Zellen in einer geeigneten Dichte ausgesät (HGC27, 5 x 10 ^{5 /ml; MKN45, 1 × 10 7 /ml) in der oberen Kammer und kultiviert in OPTI-MEM (GIBCO, USA) ohne FBS für weitere 24 h. Die Zellen wurden zur Migration in Richtung des Mediums RPMI 1640 20% FBS enthält, in der unteren Kammer erlaubt. Die nicht wandernde Zellen auf der oberen Membranoberfläche wurden mit einer Baumwollspitze entfernt und die wandernde an der unteren Membranoberfläche haftenden Zellen wurden mit 4% Paraformaldehyd fixiert und mit H & E. Die Zahl der Invasion Zellen wurden in fünf zufällig ausgewählten Feldern unter einem Mikroskop gezählt.}

Immunhistochemie (IHC) Färbung und Beurteilung

IHC-Färbung auf 5 um dicke Abschnitte von in Paraffin eingebetteten Proben durchgeführt wurde. Monoklonale Kaninchen-Anti-Human-Antikörper EIF5A2 (Epitomics, USA, KatalogȪ9-1), Kaninchen-Anti-Human-Antikörper MTA1 (Cell Signaling, USA, Katalogȴ7) und PV-6000 Polymer Detection System (ZSBG-BIO, China) waren verwendet, um mit den Anweisungen des Herstellers entsprechend Färbung. Kurz gesagt, gleitet mit Paraffinschnitte wurden mit Xylol und rehydriert mit Ethanol deparaffinisiert. Endogene Peroxidaseaktivität wurde 10 min mit 3% Wasserstoffperoxid blockiert. Für Antigen Retrieval, Objektträger wurden mikrowellenbehandelt und in einem 0,01 M Citratpuffer (pH 6,0) für 10 min gekocht und anschließend mit 0,1% Trypsin bei 37 ° C für 5 min inkubiert. (: 100 Verdünnung 1) für 1,5 h bei 37 ° C in einer befeuchteten Kammer die Objektträger wurden mit monoklonalem Kaninchen-Anti-human EIF5A2 oder MTA1 Antikörper inkubiert. Als Negativfärbung Kontrolle wurde primärer Antikörper mit unspezifischen Kaninchen-IgG ersetzt. Zwei unabhängige Pathologen bewertet die immunhistochemische Färbung von EIF5A2 und MTA1. Ein semi-quantitativen Scoring-Methode wurde mit Bezug auf die vorherige Studie verwendet. [7]

Die statistische Analyse

Alle Analysen SPSS 12.0 Software durchgeführt wurden (Chicago, IL, USA). Der McNemar-Test wurde zum Vergleich von EIF5A2 oder MTA1 Färbung in der menschlichen GC und benachbarten nicht-Tumorproben verwendet. Der Chi-Quadrat-Test verwendet wurde, Unterschiede zwischen kategorischen Variablen zu vergleichen, während die gepaart, zweiseitigen Student t
-Tests wurden verwendet, um Unterschiede zwischen den kategorischen Variablen zu vergleichen. Die Korrelation zwischen EIF5A2 und MTA1 wurde mit der Spearman-Rank-Test analysiert. Für univariate Überlebensanalyse wurden Überlebenskurven von dem Log-Rank-Test mit der Kaplan-Meier-Methode und verglichen aufgebaut. Die Cox-Proportional-Hazards-Modell mit multivariaten Analysen wurde verwendet, um die unabhängige prognostische Faktoren zu untersuchen. Alle P
Werte waren zweiseitig, und P
Werte von < 0,05 wurden als statistisch signifikant zu sein. Alle Experimente wurden zumindest in technischen und biologischen Triplikaten durchgeführt.

Ergebnisse

• PLoS ONE: Auswirkungen der intratumoralen Expression von Fluoropyrimidin-Stoffwechselenzyme auf Behandlung-Resultate der adjuvanten S-1-Therapie in Gastric Cancer
• PLoS ONE: Aberrant CCR4 Expression in Tumorinvasion von Lymphknoten-negativen menschlichen Magen Cancer