Genomic Kopienzahl Aberrationen (CNAs) in haben Magenkrebs wurde bereits ausgiebig von Array komparative genomische Hybridisierung (Array-CGH) Analyse charakterisiert. Jedoch Beteiligung von genomischer CNAs in dem Prozess der submuköse Invasion und Lymphknotenmetastasen in frühen Magenkrebs ist noch wenig verstanden. In dieser Studie, dieses Problem zu lösen, haben wir für insgesamt 59 Tumorproben von 27 Patienten mit submuköse-invasive Magenkrebs (SMGC), analysiert ihre genomische Profile von Array-CGH, und verglichen sie zwischen gepaarte Stichproben der Schleimhaut (MU) und submuköse (SM) Invasion (23 Paare) und SM-Invasion und Lymphknoten (LN) Metastasierung (9 Paare). Anfänglich wir diese Übernahme von bestimmten CNA Hypothese (s) ist für diese Prozesse wichtig. Jedoch beobachteten wir keinen signifikanten Unterschied in der Anzahl von genomischen CNAs zwischen paarigen MU und SM, und zwischen den paarigen SM und LN. Darüber hinaus waren wir keine CNAs speziell mit SM-Invasion oder LN Metastasierung zu finden. Unter den 23 untersuchten Fällen hatten 15 ein ähnliches Muster der Genomprofil zwischen SM und MU. Interessanterweise 13 der 15 Fälle zeigten auch einige Unterschiede in der genomischen Profile. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Mehrzahl der SMGCS bestehen aus heterogenen Subpopulationen aus demselben klonalen Ursprungs abgeleitet. Vergleich von genomischen CNAs zwischen SMGCS mit und ohne LN Metastasierung ergab, dass die Verstärkung von 11q13, 11q14, 11q22, 14q32 und Amplifikation von 17q21 wurden häufiger bei metastasierendem SMGCS, was darauf hindeutet, dass diese CNAs auf LN Metastasierung von Magenfrühkarzinomen in Zusammenhang stehen. Zusammenfassend deuten unsere Daten, dass die Erzeugung von genetisch unterschiedlichen Subklone, anstatt Erwerb spezifischer CNA bei MU, um den Prozess der submuköse Invasion integriert ist, und dass Subklone, die Verstärkung von 11q13 erwerben, 11q14, 11q22, 14q32 oder Amplifikation von 17q21 sind wahrscheinlich metastasierendem werden
Citation. Kuroda A, Tsukamoto Y, Nguyen LT, Noguchi T, Takeuchi I, Uchida M, et al. (2011) Genomic Profilieren von Submuköse-Invasive Magenkrebs von Array-basierten Comparative Genomic Hybridization. PLoS ONE 6 (7): e22313. doi: 10.1371 /journal.pone.0022313
Herausgeber: Giuseppe Novelli, Universität Tor Vergata in Rom, Italien in
Empfangen: 25. Februar 2011; Akzeptiert: 19. Juni 2011; Veröffentlicht am: 21. Juli 2011
© 2011 Kuroda et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden
Finanzierung:. Diese Forschung wurde teilweise durch das Ministerium für Bildung, Wissenschaft, Sport und Kultur Japans und Grants-in-Aid für junge Wissenschaftler (B), Nr 20790286 (http://www.mext.go.jp) unterstützt und die Research Fund im Ermessen des Präsidenten, Oita University (http://www.oita-u.ac.jp/english/index.html). Keine zusätzliche externe Finanzierung wurde für diese Studie aufgenommen. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung
Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen
Einführung
Magenkrebs bleibt eine der tödlichsten Krankheiten, trotz seiner stetig rückläufigen Trend weltweit. Insgesamt Sterblichkeit aufgrund von Magenkrebs wird geschätzt, jährlich 700.000 Fälle zu sein (10,4% aller krebsbedingten Todesfälle), 2. Ranking nur nach Lungenkrebs [1]. Klinisches Ergebnis ist besser, wenn die Tumorzellen auf die Schleimhaut beschränkt sind. Sobald jedoch die Tumorzellen durch die Muscularis mucosa passieren, wird das klinische Ergebnis schlechter, da das Risiko von Lymphknotenmetastasen, die eine der wichtigsten prognostische Faktoren bei Magenkrebs ist, erhöht sich signifikant auf 18% oder mehr, verglichen mit weniger als 4%, wenn die Tumorzellen auf die Schleimhaut beschränkt bleiben [2], [3]. Daher wird ein besseres Verständnis der in den Prozess der submukösen invasion Mechanismen erforderlich ist.
Es ist derzeit bekannt, dass vielstufige Akkumulation von genetischen Anomalien für den Beginn und das Fortschreiten von verschiedenen Krebsarten verantwortlich ist [4]. Tatsächlich wurde berichtet, dass die Gesamtzahl von genomischer Aberrationen steigt mit der Tumorprogression in verschiedenen Arten von Tumoren [5]. Wir fanden auch, dass die Frequenzen der Gewinne bei 20q, 20p12, 1q42, 3q27 und 13q34 und Verluste bei 4q34-qter, 4p15, 9p21, 16q22, 18q21 und 3p14, die bei Magenkrebs häufig festgestellt worden war, in AGC häufiger waren als in EGC [6]. Inzwischen hat es vor kurzem berichtet worden, dass, im Verlauf der Tumorprogression, eine einzelne Tumorzelle Ursprungs mehrere in genetisch unterschiedlichen Subpopulationen durch den Erwerb einer Vielzahl von genomischen Aberrationen entwickelt. Die sich ergebende Tumormasse, die aus genetisch heterogen Subpopulationen besteht, wird als eine Vielzahl von Umweltselektionsdruck resistent werden [7], [8], [9], [10].
Array-basierten vergleichende genomische Hybridisierung (Array-CGH) liefert Informationen über genomische Kopienzahl Aberrationen (CNAs) über das gesamte Genom [11]. Außerdem ist CGH auch anwendbar auf die Untersuchung von intratumoralen genomischen Heterogenität [12], [13], [14], [15]. Obwohl mehrere Gruppen verwendet haben Array CGH Regionen zu identifizieren onkogenen oder tumorunterdrückende Beherbergung Gene bei Magenkrebs [6], [16], [17], [18], [19], [20], [21], [22 ], [23], [24], [25], CNAs im Zusammenhang bestimmt noch nicht die Invasion und die frühe Phase der Lymphknotenmetastasen zu submuköse. Darüber hinaus wurden für jeden Tumor nur eine Probe analysiert, da die meisten früheren Studien von CNAs in Magenkrebs, Einzelheiten der Heterogenität der genomischen Profile innerhalb eines einzigen Magenkrebs sind weitgehend unklar geblieben.
In dieser Studie untersuchten wir die Einbeziehung der genomischen CNAs in dem Prozess der submuköse Invasion und Lymphknotenmetastasen in frühen Magenkrebs. Zu diesem Zweck haben wir für Tumorproben aus verschiedenen Teilen desselben Tumors separat analysierten ihre genomische Profile durch array CGH, und verglichen die genomischen Profile zwischen gepaarte Stichproben der Schleimhaut (MU) und submuköse (SM) Abschnitte und SM Abschnitt und Lymphe Knoten (LN) Metastasierung. Darüber hinaus wird durch die CNAs zwischen metastasierenden und nicht-metastasierenden submuköse-invasive Magenkrebs (SMGC) zu vergleichen, wir der Kandidat CNAs identifiziert im Zusammenhang mit LN Metastasierung von Magenfrühkarzinomen.
Ethikerklärung
Diese Studie wurde von der Ethikkommission der Oita University Hospital (Zulassungsnummer P-05-04) zugelassen. Schriftliche Einwilligung nach Aufklärung wurde von allen Patienten und /oder deren Familien erhalten.
Siebenundzwanzig SMGCS wurden operativ in Oita University Hospital reseziert. Gewebeschnitte wurden aus Formalin-fixiertem, in Paraffin eingebettetem Gewebe geschnitten und gefärbt mit Hämatoxylin-Eosin (HE) für die histologische Analyse und mit Toluidinblau (Wako, Osaka, Japan) für die Extraktion von genomischer DNA (1A). Mit der Laser-Mikrodissektion sammelten wir 1 bis 3 Proben aus der MU, SM und /oder metastasierten LN Teil des gleichen SMGC Gewebe getrennt. Als Ergebnis konnten wir insgesamt 59 Proben von 27 Patienten (Tabelle 1) zu erhalten. Alle Proben enthalten einen Anteil von Tumorzellen, 70% der Gesamt überschreitet. Genomische DNA wurde nach der Standard-Proteinase-K-Verdau-Methode extrahiert, gefolgt von Phenol /Chloroform-Extraktion. Nicht-neoplastische Magengewebe von den gleichen Patienten wurde als normale Kontrolle.
Array-CGH-Analyse verwendet wurde mit 44 K Oligonukleotid CGH-Arrays durchgeführt (Agilent Technologies Inc. , Palo Alto, CA). Labeling und Hybridisierung wurden gemäß dem Protokoll, das von Agilent Technologies Inc. Kurz vorgesehen durchgeführt, 0,85-2 ug Tumor-DNA und einer gleichen Menge von Kontroll-DNA wurden verdaut mit AluI und RsaI (Promega, Madison, WI, USA) für 24 h bei 37 ° C. Die verdaute Tumor und die Kontroll-DNA wurden mit Cy5-dUTP und Cy3-dUTP markiert jeweils ein genomisches DNA Labeling Kit Plus (Agilent) verwendet, gereinigt mit Microcon YM-30-Filter (Millipore, Billerica, MA, USA) und eingeengt auf 80,5 ul. Gleiche Mengen von Tumor- und Kontroll DNAs wurden anschließend vereinigt und gemischt mit menschlichem Cot-1-DNA, gelöst in Hybridisierungspuffer (Agilent Oligo aCGH Hybridization Kit; Agilent Technologies), denaturiert und für 24 h bei 65 ° C auf die CGH-Array hybridisiert. Glasobjektträger wurden gewaschen und dann gescannt in Übereinstimmung mit den Anweisungen des Herstellers.
Microarray-Bilder wurden mit Merkmalsextraktion v.9.5.3.1 analysiert (Agilent Technologies) mit linearen Normalisierung (Protokoll CGH-v4_95_Feb07) und die daraus resultierenden Daten wurden in DNA-Analytik v.4.0.81 (Agilent Technologies) importiert. Folgende Normalisierung der Rohdaten, die log2ratio von Cy5 (Tumor) zu Cy3 (Kontrolle) wurde berechnet. Aberrant Regionen wurden durch das ADM-2-Algorithmus bei einem Schwellenwert von 8,0 festgelegt. Zur Erkennung von Gewinnen und Verlusten, setzen wir die Werte der Parameter für Abbildungsfehler Filter wie: minimale Anzahl von Sonden in der Region 2, minimale absolute durchschnittliche log2ratio für Region 0,26, maximale Anzahl von anomalen Regionen 10000, und den Prozentsatz Penetranz pro Merkmal 0. In ähnlicher Weise zu erkennen Amplifikationen und Deletionen, setzen wir die Werte von Parametern für die Verirrung Filter wie: minimale Anzahl von Sonden in der Region 2, durch Sonden erzeugten minimalen absoluten durchschnittlichen log2ratio für den Bereich 1.0, maximale Anzahl von anomalen Regionen 10000, und den Prozentsatz Penetranz pro Funktion 0. Daten kartiert wurden auf die X- und Y-Chromosomen eliminiert. Genomic Positionen der Sonden und aberrant Regionen wurden auf der Basis der UCSC März 2006 menschliche Referenzsequenz (hg18) (NCBI bauen 36 Referenzsequenz). Alle Daten sind MIAME konform (http://www.mged.org/Workgroups/MIAME/miame.html) und die Rohdaten wurden in der MIAME-konformen GEO-Datenbank (http hinterlegt: //www.ncbi.nlm.nih gov /geo /, Zugangsnummer GSE26800). Eine Übersicht über das Versuchsanordnung ist in 1B gezeigt. Zum Vergleich von CNAs zwischen Abschnitten MU und SM gekoppelt, wählten wir 23 Fälle von insgesamt 27 (1B, a und b), da die genomischen Profile beider Abschnitte in diesen Fällen erfolgreich analysiert worden waren. Ähnlich zum Vergleich von CNAs zwischen paarigen SM und LN Abschnitte, wählten wir 9 der 12 Fälle mit einem LN Abschnitt (1B, c und d). Weiterhin verglichen wir die Frequenzen von CNAs zwischen den Fällen mit und ohne Metastasierung LN (1B, e und f).
Immunhistochemie wurde durchgeführt, wie zuvor beschrieben [21] unter Verwendung von anti- EGFR (1:100; Dako, Glostrup, Dänemark), anti-CTTN (1:200; Abcam, Cambridge, MA, USA) und Anti-ErbB2 (1:800; Cell Signaling Technology, Berverly, MA, USA) Antikörper.
die statistische Analyse
Gekoppelte t-Test und der exakte Test nach Fisher verwendet. Die Unterschiede in P Ergebnisse
. ≪ 0,05 wurden als statistisch signifikant betrachtet
Ernährung und Ernährung beeinflussen das Mikrobiom der Dickdarmschleimhaut
Rohes Heimtierfutter ein Risiko für Mensch und Tier
CED weitaus häufiger als erwartet,
Antibiotikaresistenz verdoppelt sich in nur zwei Jahrzehnten
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