PLoS ONE: Die Überexpression von Nuclear apoptoseinduzierende Faktor 1 die Proteomik Profil von menschlichen Magenkrebszelle MKN45 Altered und Zellzyklusarrest in G1 /S-Phase induziert

Abstrakt

Nuclear Apoptose-induzierenden Faktor 1 (NAIF1) wurde zuvor Apoptose zu induzieren berichtet. Darüber hinaus wurde die Expression von NAIF1 signifikant herunterreguliert in menschlichen Magenkrebsgewebe im Vergleich zu angrenzenden normalen Geweben. Jedoch, durch die der Mechanismus der NAIF1 Gen Apoptose induziert wird nicht vollständig verstanden. Unsere Ergebnisse zeigen, dass NAIF1 minimal in allen getesteten Magenkrebszelllinien exprimiert wurde. Unsere Daten zeigen auch, dass NAIF1 in den Kernen der Zellen durch Überwachung der grünen Fluoreszenz von NAIF1-GFP-Fusionsprotein unter Verwendung von fluoreszierenden konfokale Mikroskopie als erkannt lokalisiert ist. Als nächstes wurde eine vergleichende Proteomik-Ansatz verwendet, um die differentielle Expression von Proteinen zwischen Magenkrebszelllinien MKN45 /NAIF1 zu identifizieren (-) und MKN45 /NAIF1 (+). Wir fanden fünf Proteine ​​(Proteasom 26S-Untereinheit 2, Proteasom 26S-Untereinheit 13, NADH-Dehydrogenase Fe-S-Protein-1, Chaperon enthält TCP1 Untereinheit 3 ​​und Thioredoxinreduktase 1), die hochreguliert und drei Proteine ​​waren (Ribonukleasehemmers 1, 14-3- 3-Protein epsilon-Isoform und Apolipoprotein AI-bindendes Protein), die nach unten reguliert wurden in den MKN45 überexprimierenden Zellen NAIF1. Wir entdeckten auch, dass NAIF1 konnte Zellzyklusarrest in G1 /S-Phase durch die Veränderung der Expression von Zellzyklusproteine ​​cyclinD1, cdc2 und p21 induzieren. Die differentiell exprimierten Proteine ​​hier identifiziert werden an verschiedene zelluläre Programmen denen Zellzyklus, Apoptose und Signaltransduktion Regulierung und legen nahe, dass NAIF1 ein Tumorsuppressor in Magenkrebs sein kann. Unsere Forschung liefert den Beweis, dass die Rolle der, wie NAIF1 Funktionen bei Magenkrebs erläutert

Citation:. Yang M, Zhong J, Zhao M, Wang J, Gu Y, Yuan X et al. (2014) Die Überexpression von Nuclear apoptoseinduzierende Faktor 1 die Proteomik Profil von menschlichen Magenkrebszelle MKN45 Altered und induzierten Zellzyklusarrest in G1 /S-Phase. PLoS ONE 9 (6): e100216. doi: 10.1371 /journal.pone.0100216

Editor: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesu ', Italien in

Empfangen: 27. Oktober 2013; Akzeptiert: 23. Mai 2014; Veröffentlicht: 13. Juni 2014

Copyright: © 2014 Yang et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Diese Forschung wurde von der National Key Grundlagenforschung Programm von China (2007CB914700) unterstützt. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Magenkrebs ist eine der häufigsten bösartigen Tumoren in der Welt verursacht etwa 8% und 10% der jährlichen Krebsfälle und Todesfälle auf. Nach der weltweiten Epidemie Bericht der Weltgesundheitsorganisation, fast eine Million Magenkrebsfälle und 738.000 Todesfälle geschätzt im Jahr 2008 stattgefunden haben [1], [2]. Viele Anstrengungen wurden in klinischen genommen; die Mortalität von Patienten mit Magenkrebs ist jedoch noch so hoch wie 70% [2]. Ein Grund für diese hohe Mortalität ist, dass Magenkrebs-Patienten sind oft erst im fortgeschrittenen Stadium diagnostiziert, die zu spät ist, eine wirksame Behandlung zu gewährleisten. Daher ist es offensichtlich, dass die Notwendigkeit, neue Biomarker und wirksame Strategien zur Früherkennung und Behandlung von Magenkrebs zu finden.

Proteomics in vielen Forschungsbereichen verwendet wurde, einschließlich der Krebsforschung. Gemeinsame Proben in Proteomanalyse für die Krebsforschung umfassen Gewebe und Blut von Krebspatienten sowie Krebszelllinien mit unterschiedlichen Hintergründen oder verschiedenen Behandlungen [3] - [6]. Diese Proteom-Analysen wurden verwendet, um die Entstehung und Entwicklung von Krebs zu untersuchen oder zu diagnostischen Biomarkern zu suchen. Die Ergebnisse, die wir durch Proteom-Verfahren erhalten sind nicht nur durch direkte Regulierung der Transkriptionsebene, sondern auch das widerspiegeln post-translationale Modifikationen von Proteinen [3], [7]. Deshalb können wir sowohl Expression und Regulation von Protein mit Proteom-Analysen analysieren. Trotz viele neue Techniken, 2-dimensionale Elektrophorese gekoppelt mit der Massenspektrometrie hat die am häufigsten verwendete Methode zur Proteomanalyse blieb.

Das menschliche Gen, das für Kern Apoptose-induzierenden Faktor 1 (NAIF1) auf dem Chromosom 9q34.11 befindet . NAIF1 kodiert für ein Protein mit einer Myb
-ähnlichen Domäne an ihrem N-terminalen Region [8], [9]. Frühere Studien haben in menschlichen Krebszelllinien HeLa, dass die Überexpression von NAIF1 gezeigt und MKN45 induziert Apoptose [8], [10]. . Darüber hinaus Luo et al
festgestellt, dass NAIF1 deutlich im normalen Magengewebe exprimiert wird, während seine Expression herunterreguliert oder bei Magenkrebs Gewebe verloren ( P <
0,001). Darüber hinaus war NAIF1 Ausdruck höher in gut differenzierten ( P
= 0,004) als in moderately- oder schlecht differenzierten Magenkrebs [10]. Allerdings ist die Rolle der NAIF1 in das zelluläre Protein-Expressionsprofil Regulierung unbekannt.

In der vorliegenden Studie haben wir Proteom-Technologie auf Basis von 2-dimensionalen Elektrophorese in Kombination mit MALDI-TOF-Massenspektrometrie zur Identifizierung von Proteinen mit der damit verbundenen beschäftigt biologischen Funktionen von NAIF1. Die Proteinexpressionsprofile der Magenkrebs-Zelllinie, MKN45 mit oder ohne NAIF1 Überexpression wurden analysiert und verglichen mit 24 cm pH 3-10 NL Bereich immobilisierten pH-Gradienten (IPG) Streifen. Um diese Daten zu bestätigen, ermittelten wir RNA Expressionsniveaus aller unterschiedlich exprimierte Proteine ​​und drei Proteine ​​wurden durch Western-Blotting nachgewiesen. Unsere Ergebnisse zeigen, dass NAIF1 Zellzyklusarrest in G1 /S-Phase induziert durch die Expression von cyclinD1, cdc2 und p21-Protein reguliert wird. Die Ergebnisse unserer Studie zu einem besseren Verständnis der führen kann, wie NAIF1 arbeitet Apoptose bei der Induktion und auch Licht auf die Diagnose und Therapie von Magenkrebs in die Zukunft werfen kann.

Materialien und Methoden

Zellkultur und Transfektion

menschlichen Magenkrebszelllinien MKN45, BGC823, AGS und SGC7901 wurden aus der Tumorzell Bank of Chinese Academic of Medical Sciences und kultiviert in flüssigem Dulbecco-Minimalmedium (DMEM), erhalten mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (FBS), 100 IU /ml Penicillin, 100 ug /ml Streptomycin bei 37 ° C in einem befeuchteten 5% CO _{2 -Atmosphäre. DNA-Transfektion wurde mit der X-tremegene HP DNA Transfektionsreagenz (Roche, Schweiz) durchgeführt gemäß den Anweisungen des Herstellers.}

Expressionsplasmide

Die Expressionsplasmide pEGFP-N1-NAIF1, die ein Ausdruck NAIF1-GFP-Fusionsprotein, und pEGFP-N1, das wurde das grün fluoreszierende Protein (GFP) exprimiert wurde freundlicherweise von Dr. Qing Luo zur Verfügung gestellt [10].

Zellzyklus
Verteilungsanalyse

Exponentiell wachsende Zellen wurden mit dem pEGFP-N1-Vektor oder dem pEGFP-N1-Plasmid transfiziert NAIF1. Die Zellen wurden bei 24 h oder 48 h nach der Transfektion geerntet, und 1 × 10 ^{6 Zellen wurden für 1 h zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und mit 4% Paraformaldehyd bei 4 ° C gewaschen. Nach der Zentrifugation wurden die Zellpellets in Färbungslösung resuspendiert (0,05 mg /ml Propidiumiodid (PI), 0,2 mg /ml RNase und 0,1% Triton X-100) bei 4 ° C für 15 min im Dunkeln. Durchflusszytometrie-Analyse für GFP und PI wurde unter Verwendung eines BD LSR II Zellanalysator ausgeführt (BD, San Jose, CA, USA). PI-Fluoreszenz wurde unter der GFP positiven Zellpopulation gemessen und die Verteilungen der Zellzyklen wurden unter Verwendung von ModFit LT3.2 Software analysiert. Drei separate Proben wurden hergestellt und alle Proben wurden in dreifacher Ausführung durchgeführt.}

Die Quantifizierung der Apoptose

Die Quantifizierung der Apoptose wurde durchgeführt unter Verwendung des PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I (BD). Kurz gesagt, wurden BGC823 oder MKN45-Zellen mit dem Vektor pEGFP-N1 transfiziert oder pEGFP-N1-Plasmid NAIF1. Folgenden 24 h oder 48 h nach der Transfektion wurden die Zellen geerntet, gewaschen mit kaltem PBS zweimal und dann mit Bindungspuffer (10 mM Hepes /NaOH (pH 7,4), 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl _{2) resuspendiert . Die resuspendierten Zellen wurden mit Phycoerythrin (PE) konjugiertes Annexin V (AV) und 7-Amino-Actinomycin (7-AAD) inkubiert und dann durch die Strömungsmess Zytometrie die BD LSR II Zelle Analyzer. Vier unterschiedliche Zellpopulationen konnten in einem Dot-Plot erkannt werden:, Frühphasen apoptotischen Zellen (AV ^{+ /7-AAD lebensfähige Zellen (- - /7-AAD AV ) - ), der Spätphase der apoptotischen Zellen (AV + /7-AAD +) und nekrotischen Zellen (AV - /7-AAD +). Ein Minimum von 10.000 GFP-positiven Zellen wurden pro Probe und die Daten gezählt wurde als Prozentsatz der apoptotischen Zellen (AV + /7-AAD berichtet - und AV + /7-AAD + ) der Gesamtzahl der Zellen. Drei unabhängige Probenpräparationen wurden hergestellt und alle Proben wurden in dreifacher Ausführung wiederholt.}}

Die konfokale Scanning

Achtundvierzig Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen dreimal mit PBS gewaschen und mit 4% Paraformaldehyd für 15 Minute bei Raumtemperatur. Um die Permeabilität der Zellmembran zu verbessern, wurden Zellen mit 0,5% Triton X-100, gefolgt von einer Inkubation mit 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI), um die Kerne färben. Zelluläre Verteilung von NAIF1 wurde durch die Überwachung der grünen Fluoreszenz des NAIF1-GFP-Fusionsprotein mit einem Leica Microsystems Heidelberg GmbH Mikroskop analysiert.

Proteinpräparat für 2-DE

Für jede Probe 5 × 10 ^{6 Zellen wurden in 1 ml Lyse-Puffer (7 M Harnstoff, 2 M Thioharnstoff, 2% CHAPS, 20 mM DL-Dithiothreitol (DTT), 1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF), 30 mM Natriumfluorid, geerntet und lysiert, und 0,25 mg /ml RNase A) für 1 h bei Raumtemperatur und dann 30 min bei 4 ° C zentrifugiert. bei 12.000 Umdrehungen pro Minute. Der Überstand wurde in ein neues Röhrchen überführt und konzentriert mit 0,1 M NH _{4COOH. Lysis-Puffer wurde zu einem Endvolumen von 800 ul zugegeben, und die Proteinkonzentration wurde unter Verwendung eines Bradford-Assay bestimmt (Tiangen, Beijing, China).}}

Zweidimensionale Elektrophorese

Zweidimensionale Elektrophorese wie zuvor beschrieben durchgeführt wurde [5]. Kurz gesagt, die 1 mg Proteine ​​wurde auf 450 &mgr; l mit Puffer verdünnt Rehydratation (7 M Harnstoff, 2 M Thioharnstoff, 2% CHAPS und 20 mM DTT). IPG-Streifen (IPG, 24 cm, pH 3-10, NL, GE begrenzt.) Wurden 18 Stunden bei Raumtemperatur mit den rehydratisierten Proben rehydratisiert. Die Proteine ​​wurden mit einem Ettan IPGphorIII (GE, CT, USA), die nacheinander für 1 h bei 100 V, 1 h bei 250 V, 1 h bei 500 V, 1 h bei 1000 V, 1 h bei 3000 v einer isoelektrischen Fokussierung unterzogen, 1 h bei 5000 V, 2 h bei 8000 V und 6 h bei 8000 v insgesamt 80 kvh zu erhalten. Nach der isoelektrischen Fokussierung wurden die IPG-Streifen, äquilibriert mit Äquilibrierungspuffer I (6 M Harnstoff, 150 mM Tris-HCl (pH 8,8), 30% Glycerin, 2% SDS, 1% DTT) für 15 min. gefolgt von einer zweiten Inkubation mit einem anderen Äquilibrierungspuffer II (6 M Harnstoff, 150 mM Tris-HCl (pH 8,8), 30% Glycerin, 2% SDS, 2,5% Jodacetamid) für 15 min. Die zweite Dimension der SDS-PAGE wurde mit 12,5% SDS-PAGE-Gelen durchgeführt, die Ettan DALT SIX vertikale Systeme (GE) mit.

Gel-Färbung und Bildanalyse

Die SDS-PAGE Gele wurden bei der Festsetzung-Puffer (10% CH _{3COOH, 40% C 2 H 5OH, und 50% ddH 2 O) für 30 Minuten fixiert. Die Gele wurden dann in ddH 2 O für 10 min gewaschen. 3 Mal und mit Coomassie Blau G-250.}

Die Gele mit einem Bildscanner mit Magic Software gescannt wurden, um die Spotmuster zu bewerten. Imagemaster Platin-Software (Version 5.0) wurde eingesetzt, um die Gel-Bilder zu analysieren. Die Spots, die sowohl von der Steuer Gel und NAIF1 Gel beobachtet wurden, wurden analysiert und die Intensität jedes Spots wurde durch Berechnung des Spotvolumen quantifiziert nach dem Gelbild zu normalisieren. Die quantitative Analyse der Gelbilder (drei Replikaten /Probe) wurden entnommen und Flecken mit einer statistisch signifikant Unterschiede (t-Test, * P
< 0,05). Wurden zur Identifizierung ausgeschnitten und verdaut

Protein in 50 mM NH _{4HCO 3 /Acetonitril (50/50) und getrocknet durch Vakuum Zentrifugation Identifikationen}

Differentiell exprimierte Proteinspots wurden extrahiert und entfärbt. Die Gelstücke wurden dann über Nacht mit 10 ng /ml Trypsin (Promega, WI, USA) in 50 mM NH _{4HCO 3 Puffer bei 37 ° C verdaut. Die Trypsin-Flüssigkeit wurde in ein sauberes Röhrchen überführt, mit 100 ul 60% Acetonitril /0,1% Trifluoressigsäure verdünnt und für 15 min mit Ultraschall behandelt, dreimal. All die aufgenommene Flüssigkeit wurde gesammelt und im Vakuum getrocknet und bei -80 ° C gelagert. Die eluierten Peptide wurden unter Verwendung eines Bruker Ultra MALDI-TOF /TOF mit der SCOUT Quelle von BGI-Peking ausgestattet analysiert. Die Ergebnisse der Massenspektrum gegen Säugetier-Sequenzen aus dem NCBInr (nicht redundant) Datenbank für einen Peptidmassenfingerabdruck Identifizierung gegen wurden.}

RNA-Isolierung, RT und Real-time-PCR-Q

Gesamt-RNA unter Verwendung von TRIzol-Reagens (Invitrogen) entsprechend dem Protokoll des Herstellers extrahiert. cDNA wurde durch reverse Transkription unter Verwendung von 1 &mgr; g Gesamt-RNA mit Oligo (dT) synthetisiert _{18 Primer und M-MuLV Reverse Transkriptase (Takara).}

Bei Reverse-Transkriptions-PCR-Primer für NAIF1 und β-Aktin waren wie folgt: NAIF1 Sinne 5'- AGCCACGGTCACCCTGACACA-3 'und Antisense, 5' CGTGTCTGCATGCTGGGCCAT-3 '; ß-Aktin Sinne 5'- GGGCACGAAGGCTCATCATT-3 'und Antisense, 5' AGCGAGCATCCCCCAAAGTT. Alle Primer wurden unter Verwendung von NCBI Blast und gekauft von Sangon, Beijing.

Die quantitative PCR wurde mit dem SYBR Green qPCR Kit durchgeführt (Takara, Japan) mit einem 20 ul Reaktionssystem einzurichten gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die Zielgenexpression wurde unter Verwendung geeigneter qPCR-Primer (Tabelle 1) analysiert. β-Actin wurde zur Normalisierung verwendet. Die Echtzeit-qPCR wurde auf einem ABI7300 cycler (ABI, MA, USA) unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: Denaturierung für 30 s bei 95 ° C, gefolgt von 40 Zyklen Denaturierung für 5 s bei 95 ° C und Verlängerung für 31 s bei 60 ° C. Schmelzkurvenanalyse wurde am Ende durchgeführt, um die Spezifität des erwarteten PCR-Produkts zu bestätigen. Relative Expression wurde berechnet, um die zwei Standardkurve Methoden. Drei unabhängige Proben wurden für jede Bedingung vorbereitet und jedes Experiment wurde dreifach durchgeführt.

Western Blotting

Western-Blot wurde durchgeführt, wie zuvor beschrieben. Kurz, 2 × 10 ^{6 Zellen mit Mittelstrom, pelletiert durch Zentrifugation für 5 min bei 500 wurden geerntet g
und wusch 3-mal mit PBS. Die Zellen wurden dann mit 100 &mgr; l Lysepuffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1,5% NP-40, 0,1% SDS, und 50 ug /ml PMSF, mit frisch zugegebenem Proteinase-Inhibitor-Cocktail) auf Eis für 30 min. Die Lysate wurden 15 min bei 13000 rpm zentrifugiert. und die Proteinkonzentration wurde unter Verwendung von Bradford-Verfahren gemessen. Fünfzig Mikrogramm Proteine ​​wurden auf 12% SDS-PAGE aufgetrennt und auf Polyvinylidendifluorid-Membranen übertragen. Die Membranen wurden für eine Stunde bei Raumtemperatur durch die Inkubation mit dem primären Antikörper-Lösungen, gefolgt von 5% BSA in TBST blockiert gemäß den Anweisungen des Herstellers (β-Actin, 1:5000, Sigma; NAIF1, 1:1000, Santa Cruz; 14- 3-3 ε, 1:500, Santa Cruz; TCP1-γ, 1:1000, Abcam; TXNRD1, 1:1000, Abcam; CyclinD1, 1:1000, CST, cdc2, 1:500, CST und p21, 1 :500, CST). Die Membranen wurden 3 mal mit TBST gewaschen, gefolgt von einer Inkubation mit entsprechenden Sekundärantikörper für 2 Stunden bei Raumtemperatur. Die Signale wurden unter Verwendung des ECL-Chemilumineszenz-System festgestellt. β-Actin wurde als Kontrolle eingesetzt.}

Statistische Analyse

Alle statistischen Analysen wurden durchgeführt unter Verwendung von SPSS 13.0 Software (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Die Daten wurden als Mittelwert ± SD. Die t-Test des Studenten wurde für den statistischen Vergleich verwendet. Eine zugehörige Wert von P <.
0,05 als signifikant angesehen wurde

Ergebnisse

• PLoS ONE: Epidermal Growth Factor-Like-Domäne-enthaltendes Protein 7 (EGFL7) Verbessert die EGF-Rezeptor-AKT Signal, Epithelial-mesenchymale Transition, und Metastasierung von Magenkrebs Cells
• PLoS ONE: Die NOD-like Rezeptor Signalgebung Pathway in Helicobacter-pylori-Infektion und verwandte Magenkrebs: Eine Fall-Kontroll-Studie und Gene Expression Analysen