PLOS ONE: A superexpressão do Nuclear Indutor de Apoptose Fator 1 alterou o perfil proteômica do Cancer Cell gástrico humano MKN45 e induzida paragem do ciclo celular em G1 /S Phase

Abstract

Nuclear fator de indução de apoptose 1 (NAIF1) foi previamente relatado para induzir a apoptose. Além disso, a expressão de NAIF1 foi significativamente regulada para baixo em tecidos de cancro gástrico humano em comparação com os tecidos normais adjacentes. No entanto, o mecanismo pelo qual o gene NAIF1 induz a apoptose não é totalmente compreendido. Os nossos resultados mostram que NAIF1 foi minimamente expressa em todas as linhas celulares de cancro gástrico testados. Os nossos dados também demonstram que NAIF1 está localizada no núcleo das células tal como detectado por monitorização da fluorescência verde da proteína de fusão NAIF1-GFP por microscopia confocal de fluorescência. Em seguida, uma abordagem proteómica comparativa foi usada para identificar a expressão diferencial de proteínas entre as linhas celulares de cancro gástrico MKN45 /NAIF1 (-) e MKN45 /NAIF1 (+). Encontramos cinco proteínas (proteassoma 26S subunidade 2, proteassoma 26S subunidade 13, NADH desidrogenase proteína Fe-S 1, chaperonina contendo TCP1 subunidade 3 e tioredoxina redutase 1) que foram up-regulada e três proteínas (ribonuclease inibidor 1, 14-3- isoforma 3 proteína epsilon e proteína de ligação apolipoproteína AI) que foram sub-regulada nas células MKN45 com superexpressão NAIF1. Nós também descobrimos que NAIF1 poderia induzir a paragem do ciclo celular na fase G1 /S através da alteração da expressão de proteínas do ciclo celular cyclinD1, cdc2 e p21. As proteínas diferencialmente expressas identificadas aqui estão relacionados com vários programas celulares envolvendo ciclo celular, apoptose, e a regulação de transdução de sinal e sugerem que NAIF1 pode ser um supressor tumoral no cancro gástrico. Nossa pesquisa fornece evidências de que elucida o papel de como funciona NAIF1 no câncer gástrico

Citation:. Yang M, Zhong J, Zhao M, Wang J, Gu Y, Yuan X, et al. (2014) superexpressão do Nuclear Indutor de Apoptose Fator 1 alterou o perfil proteômica do Cancer Cell gástrico humano MKN45 e induzida paragem do ciclo celular em G1 /S Fase. PLoS ONE 9 (6): e100216. doi: 10.1371 /journal.pone.0100216

editor: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesù, Itália |

Recebido: 27 de outubro de 2013; Aceito: 23 de maio de 2014; Publicação: 13 de junho de 2014

Direitos de autor: © 2014 Yang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiado pelo Programa Nacional Key Pesquisa básica da China (2007CB914700). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer gástrico é um dos tumores malignos mais comuns no mundo, causando cerca de 8% e 10% dos casos de câncer anuais e mortes, respectivamente. De acordo com o relatório epidemia mundial pela Organização Mundial de Saúde, cerca de um milhão de casos de câncer gástrico e 738,000 mortes são estimadas para ter ocorrido em 2008 [1], [2]. Muitos esforços têm sido tomadas na clínica; No entanto, a mortalidade dos doentes com cancro gástrico ainda é tão elevada como 70% [2]. Uma das razões para esta alta mortalidade é que pacientes com câncer gástrico, muitas vezes não são diagnosticados até que o estágio avançado, o que é tarde demais para proporcionar um tratamento eficaz. Portanto, há uma necessidade óbvia de encontrar novos biomarcadores e estratégias eficazes para o diagnóstico e tratamento do câncer gástrico precoce.

Proteomics tem sido usado em muitas áreas de investigação, incluindo a investigação do cancro. amostras comuns em análise proteômica para pesquisa do câncer incluem tecidos e sangue de pacientes com câncer, bem como linhas celulares de cancro com diferentes origens ou tratamentos diferentes [3] - [6]. Estas análises proteômicas foram utilizados para investigar a origem eo desenvolvimento de cancro ou para procurar biomarcadores de diagnóstico. Os resultados obtidos através de métodos de proteômica não são apenas devido à regulação direta de nível da transcrição, mas também refletem modificações pós-traducionais de proteínas [3], [7]. Portanto, podemos analisar tanto a expressão e regulação da proteína com análises proteômicas. Apesar de muitas técnicas emergentes, electroforese 2-dimensional acoplada com espectrometria de massa manteve-se o método mais utilizado para a análise proteómica.

O factor de indução de apoptose nuclear humano um gene que codifica (NAIF1) está localizado no cromossoma 9q34.11 . NAIF1 codifica uma proteína com um Myb
-like domínio na sua região N-terminal [8], [9]. Estudos anteriores têm mostrado que a sobre-expressão de NAIF1 em linhas celulares de cancro humano HeLa e MKN45 induz apoptose [8], [10]. . Além disso, Luo et ai, achou que NAIF1 é significativamente expressa no tecido gástrico normal, enquanto que a sua expressão é regulada negativamente ou perdido em tecidos de cancro gástrico ( P < 0,001
). Além disso, a expressão foi maior em NAIF1 bem diferenciado ( P
= 0,004) do que no cancro gástrico moderately- ou mal-diferenciada [10]. No entanto, o papel de NAIF1 na regulação do perfil de expressão de proteína celular é desconhecida.

No presente estudo, nós empregue tecnologia proteómica com base em electroforese em duas dimensões combinadas com espectrometria de massa MALDI-TOF para identificar proteínas associadas com o funções biológicas de NAIF1. Os perfis de a linha celular de cancro gástrico, MKN45, com ou sem sobre-expressão NAIF1 expressão de proteína foram analisados ​​e comparados, utilizando o gradiente de pH imobilizado (IPG) 3-10 tiras gama NL 24 centímetros de pH. Para validar esta dados, medimos níveis de expressão de ARN de todas as proteínas expressas de forma diferente e as três proteínas foram adicionalmente verificada por transferência de western. Nossos resultados demonstram que NAIF1 induz a paragem do ciclo celular na fase G1 /S, regulando os níveis de cyclinD1, cdc2 e proteína p21 expressão. Os resultados do nosso estudo pode levar a uma melhor compreensão de como NAIF1 trabalha na indução de apoptose e também pode lançar luz sobre o diagnóstico e terapia de câncer gástrico no futuro.

Materiais e Métodos

cultura de células e transfecção

linhas celulares de cancro gástrico humano MKN45, BGC823, AGS e SGC7901 foram obtidos a partir do tumor celular Banco de Academic chinesa de Ciências Médicas e cultivadas em meio essencial mínimo de líquido de Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% inactivado por calor soro fetal de bovino (FBS), 100 UI /ml de penicilina, 100 ug /ml de estreptomicina a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO _{2 atmosfera. transfecção de ADN foi realizada utilizando o reagente de transfecção X-tremeGENE HP ADN (Roche, Suíça) de acordo com as instruções do fabricante.}

Os plasmídeos de expressão

Os plasmídeos de expressão pEGFP-N1-NAIF1, que expressa um NAIF1-GFP proteína de fusão, e pEGFP-N1, que expressa verde proteína fluorescente (GFP), foi gentilmente cedido pelo Dr. Qing Luo [10].

ciclo celular distribuição análise

crescimento exponencial as células foram transfectadas com o vector pEGFP-N1 ou o plasmídeo pEGFP-N1-NAIF1. As células foram colhidas às 24 h ou 48 h após a transfecção, e 1 × 10 ^{6 as células foram lavadas duas vezes com solução salina tamponada com fosfato (PBS) e fixadas com paraformaldeído a 4% a 4 ° C durante 1 h. Após centrifugação, as peletes de células foram ressuspensas em solução de coloração (0,05 mg /ml de iodeto de propídio (PI), 0,2 mg /ml de RNase, e 0,1% de Triton X-100) a 4 ° C durante 15 min no escuro. A análise de citometria de fluxo para GFP e PI foi realizada utilizando um analisador de células BD LSR II (BD, San Jose, CA, EUA). PI fluorescência foi medida na população de células positivas para GFP e as distribuições dos ciclos de células foram analisados ​​utilizando o software ModFit LT3.2. Três amostras separadas foram preparadas e todos os ensaios foram realizados em triplicado.}

A quantificação da apoptose

A quantificação da apoptose foi realizada utilizando o PE anexina V Apoptosis Detection Kit I (BD). Resumidamente, BGC823 ou MKN45 células foram transfectadas com o vector pEGFP-N1 ou o plasmídeo pEGFP-N1-NAIF1. Após 24 h ou 48 h após a transfecção, as células foram colhidas, lavadas com PBS frio duas vezes e em seguida re-suspenso com tampão de ligação (10 mM Hepes /NaOH (pH 7,4), NaCl 140 mM, CaCl 2,5 mM _{2) . As células ressuspensas foram incubadas com ficoeritrina (PE) conjugado anexina V (AV) e 7-amino-actinomicina (7- AAD), e, em seguida, medida por citometria de fluxo usando o analisador de células BD LSR II. Quatro populações de células distintas pode ser detectada em um ponto-enredo: células viáveis ​​(AV ^{- /7-AAD -), células em apoptose de fase precoce (AV + /7-AAD - ), as células em fase final de apoptóticos (AV + /7-AAD +), e células necróticas (AV - /7-AAD +). Um mínimo de células positivas 10000 GFP foram contadas por amostra e os dados foram registados como a percentagem de células apoptóticas (AV + /7-AAD - e AV + /7-AAD + ) entre as células totais. Três preparações de amostras independentes foram feitas e todos os ensaios foram repetidos em triplicado.}}

confocal

Quarenta e oito horas após a transfecção, as células foram lavadas três vezes com PBS e fixadas com paraformaldeído a 4% durante 15 min. à temperatura ambiente. Para aumentar a permeabilidade da membrana celular, as células foram incubadas com 0,5% de Triton X-100, seguido de incubação com 4 ', 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) para corar os núcleos. distribuição celular de NAIF1 foi analisada por monitorização da fluorescência verde da proteína de fusão GFP-NAIF1 utilizando um microscópio Leica Microsystems GmbH Heidelberg.

preparação de proteína de 2-DE

Para cada amostra, 5 × 10 ^{6 as células foram colhidas e lisadas em 1 ml de tampão de lise (ureia 7 M, 2 M tioureia, 2% de CHAPS, 20 mM de DL-ditiotreitol (DTT), fluoreto de fenilmetilsulfonilo 1 mM (PMSF), fluoreto de sódio 30 mM, e 0,25 mg /ml de ARNase) durante 1 h à temperatura ambiente, e depois centrifugada a 4 ° C durante 30 min. a 12.000 rpm. O sobrenadante foi transferido para um novo tubo e concentrou-se com 0,1 M NH _{4COOH. O tampão de lise foi adicionada a um volume final de 800 ul, e a concentração de proteína foi determinada utilizando um ensaio de Bradford (Tiangen, Pequim, China).}}

electroforese bidimensional

electroforese bidimensional foi realizada como previamente descrito [5]. Em resumo, 1 mg de proteínas foi diluída para 450 ul com tampão de reidratação (7 M de ureia, 2 M tioureia, 2% de CHAPS e DTT 20 mM). tiras de IPG (IPG, 24 cm, de pH 3-10, NL, do limite de GE.) foram re-hidratadas com as amostras re-hidratadas durante 18 horas à temperatura ambiente. As proteínas foram submetidos a focagem isoeléctrica com um Ettan IPGphorIII (GE, CT, EUA), sucessivamente, durante 1 h a 100 V, 1 hora a 250 V, 1 hora a 500 V, 1 hora a 1000 V, 1 hora a 3000 V, 1 h a 5000 v, 2 horas a 8000 v, e 6 horas a 8000 v para obter um total de 80 KVH. Após a focagem isoeléctrica, as tiras de IPG foram equilibradas com tampão de equilíbrio I (ureia 6 M, Tris-HCl 150 (pH 8,8), 30% de glicerol, 2% de SDS, 1% DTT) durante 15 min. seguido de uma segunda incubação com um outro tampão de equilíbrio II (ureia 6 M, Tris-HCl 150 (pH 8,8), 30% de glicerol, 2% SDS, 2,5% iodoacetamida) durante 15 min. A segunda dimensão SDS-PAGE foi realizada com 12,5% de gel SDS-PAGE utilizando os seis sistemas verticais Ettan Dalt (GE).

coloração Gel e análise de imagem

A SDS-PAGE os geles foram fixados em tampão de fixação de (10% de CH _{3COOH, 40% C 2H 5OH, e 50% de DDH 2O) durante 30 min. Os géis foram então lavadas em DDH 2O durante 10 min. 3 vezes e corados com azul de Coomassie G-250.}

Os géis foram digitalizadas com um scanner de imagem usando o software MagicScan para avaliar os padrões de ponto. software ImageMaster platina (versão 5.0) foi utilizado para analisar as imagens do gel. As manchas foram observadas que tanto o gel de controlo e de gel NAIF1 foram analisadas e a intensidade de cada mancha foi quantificada através do cálculo do volume local após normalização da imagem do gel. A análise quantitativa de imagens de gel (três repetições /amostra) foram tomadas e pontos com diferenças estatisticamente significativas (teste t, * P
< 0,05). foram excisadas e digerido para identificação

Proteína identificações

diferencialmente expressos spots de proteínas foram extraídas e de-coradas em NH 50 mM _{4HCO 3 /acetonitrilo (50/50) e secas por centrifugação a vácuo. Os pedaços de gel foram então digerido com 10 ng /ml de tripsina (Promega, WI, EUA) em 50 mM NH 4HCO tampão 3 a 37 ° C durante a noite. O líquido de tripsina foi transferida para um tubo limpo, diluiu-se com 100 ul de ácido trifluoroacético a 60% de acetonitrilo /0,1%, e tratada com ultra-som durante 15 minutos, três vezes. Todo o líquido adquirido foi recolhido e seco sob vácuo e armazenado a -80 ° C. Os péptidos eluídos foram analisadas utilizando um Bruker UltraFlex MALDI-TOF /TOF equipado com a fonte ESCUTEIRO por BGI-Beijing. Os resultados do espectro de massa foram contrastadas contra sequências de mamíferos do banco de dados NCBInr (não redundante) para péptido de identificação de impressão digital em massa.}

Isolamento RNA, RT e em tempo real Q PCR

O RNA total foi extraiu-se utilizando o reagente TRIzol (Invitrogen) de acordo com o protocolo do fabricante. Sintetizou-se ADNc por transcrição inversa usando 1 ug ARN total com oligo (dT) _{18 iniciadores e M-MuLV da transcriptase reversa (TAKARA).}

Para a PCR de transcrição reversa, os iniciadores para NAIF1 e β-actina foram como se segue: sentido NAIF1, 5'-AGCCACGGTCACCCTGACACA-3 ', e anti-sentido, 5'-CGTGTCTGCATGCTGGGCCAT-3'; sentido de p-actina, 5'- GGGCACGAAGGCTCATCATT-3 ', e anti-sentido, 5'-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT. Todos os iniciadores foram desenhados usando NCBI explosão e comprado de Sangon, Pequim
.

quantitativa por PCR foi realizada com o Kit de SYBR Green qPCR (Takara, Japão) com um sistema de reacção de 20 ul configurado de acordo com as instruções do fabricante. expressão do gene alvo foi analisada utilizando-qPCR em tempo real adequado iniciadores (Tabela 1). β-actina foi utilizada para normalização. O tempo real qPCR foi realizada num ciclizador ABI7300 (ABI, MA, EUA) com as seguintes condições: desnaturação durante 30 s a 95 ° C, seguido de 40 ciclos de desnaturação durante 5 s a 95 ° C e extensão durante 31 s a 60 ° C. Derreter análise da curva foi realizada no fim de validar a especificidade do produto esperado de PCR. A expressão relativa foi calculada usando os dois métodos da curva padrão. Três amostras independentes foram preparadas para cada condição e cada experiência foi realizada em triplicado.

Western Blotting

Western blot foi realizada tal como anteriormente descrito. Resumidamente, 2 × 10 ^{6 as células foram colhidas com fluxo médio, sedimentadas por centrifugação durante 5 min a 500 g
, e lavou-se 3 vezes com PBS. As células foram então lisadas com 100 ul de tampão de lise (Tris-HCl a 50, pH 7,4, 150 mM de NaCl, 1,5% de NP-40, 0,1% de SDS, e 50 ug /PMSF ml, com o cocktail inibidor de proteinase adicionada de fresco) em gelo durante 30 min. Os lisados ​​foram centrifugados a 13000 rpm durante 15 min. e a concentração de proteína foi determinada utilizando método de Bradford. Cinquenta microgramas de proteínas foi separado em 12% SDS-PAGE e transferidas para membranas de difluoreto de polivinilideno. As membranas foram bloqueadas com 5% de BSA em TBST durante uma hora à temperatura ambiente, seguido por incubação com anticorpo primário soluções de acordo com as instruções do fabricante (β-actina, 1:5000, Sigma; NAIF1, 1:1000, Santa Cruz; 14- 3-3 ε, 1:500, Santa Cruz; TCP1-γ, 1:1000, Abcam; TXNRD1, 1:1000, Abcam; CyclinD1, 1:1000, CST; cdc2, 1:500, CST, e p21, 1 :500 CST). As membranas foram lavadas 3 vezes com TBST, seguido por incubação com anticorpos secundários apropriados durante duas horas à temperatura ambiente. Os sinais foram detectadas utilizando o sistema ECL Quimioluminescência. β-actina foi utilizada como controle.}

Análise Estatística

Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando SPSS 13.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA). Os dados foram expressos em média ± SD. O teste t de Student foi usado para comparação estatística. Um valor associado de P <.
0,05 foi considerado significativo

Resultados

Transfectados NAIF1 localizada no núcleo

Ambos reverter PCR e ocidentais experiências de transferência de transcrição demonstraram que NAIF1 foi minimamente expressa em linhas celulares de cancro gástrico, MKN45, BGC823, AGS, e SGC7901; Considerando NAIF1 foi facilmente detectado quando foi transfectado para as células (Fig. 1A e B). Nós transfectadas uma construção de fusão GFP-NAIF1 em MKN45 e BGC823 células e um vector de GFP foi utilizado como controlo. A microscopia confocal demonstram que quando as células foram transfectadas com o constructo pEGFP-N1-NAIF1, fluorescência verde foi detectada apenas nos núcleos; Pelo contrário, o sinal flurescent verde foi detectada ao longo de toda a célula quando transfectadas com o vector de GFP (Figura. 1C). Os mesmos resultados foram também observadas em outras linhas celulares, tais como BGC823 (Figura S1). Esses achados confirmam que transfectadas proteína NAIF1 está localizada no núcleo.

NAIF1 induzida paragem do ciclo celular na fase G1 /S

O perfil do ciclo celular das células cancerosas gástricas sob o efeito de NAIF1 foi investigada Próximo. Foram analisadas as células GFP positivas para assegurar a correcta população foi utilizado (Figura S2). A análise de citometria de fluxo demonstraram que NAIF1 induzida uma mudança significativa na distribuição de ciclo celular: um aumento da população de células na fase G0 /G1 e uma diminuição na fase S foi observada em células que sobre-expressam NAIF1 em comparação com células transfectadas com o vazio vector, tanto após a transfecção de 24 h e 48 h. Como mostrado na figura. 2A, a citometria de fluxo revelou que 24 h após a transfecção, cerca de 54% de BGC823 células transfectadas com pEGFP-N1 vector estavam na fase G0 /G1, e 34% e 12% das células estavam em fase S e a fase G2 /M, respectivamente . Por outro lado, em BGC823 células transfectadas com o pEGFP-N1-NAIF1 construir houve um aumento definitivo da percentagem de células em G0 /G1 fase (74%), bem como uma diminuição na percentagem de células em fase S (26%) e fase G2 /M (0%). Quarenta e oito horas após a transfecção, cerca de 36% das células de controlo foram BGC823 em fase G1 G0 /, e 59% e 5% das células estão em fase S e G2 /M, respectivamente fase. Em BGC823 células transfectadas com o pEGFP-N1-NAIF1 construir, aproximadamente 55% das células estavam em fase G1 G0 /, e de 37% e 8% das células estavam em fase S e G2 /M de fase, respectivamente. Em células MKN45, 24 h após a transfecção, aproximadamente 56% das células transfectadas com o vector pEGFP-N1 estavam na fase G0 /G1 fase, e 29% e 15% das células estavam em fase S e G2 /M de fase, respectivamente. Aproximadamente 76% de células MKN45 transfectadas com o constructo pEGFP-N1-NAIF1 estavam na fase G0 /G1, e as percentagens de células em fase S e G2 /M foram fase diminuiu para 24% e 0%, respectivamente. Quarenta e oito horas após a transfecção, cerca de 43% das células de controlo MKN45 foram em G0 /G1 fase, e 43% e 14% das células estavam em fase S e G2 /M de fase, respectivamente. Em MKN45 células transfectadas com o pEGFP-N1-NAIF1 construir, aproximadamente 56% das células estavam em fase G1 G0 /, e de 28% e 16% das células estavam em fase S e a fase G2 /M, respectivamente (Figura. 2B). Estes resultados demonstram claramente que a sobreexpressão de NAIF1 induzida paragem do ciclo celular na fase G1 /S de células de cancro gástrico BGC823 e MKN45.

Para clarificar o mecanismo pelo qual NAIF1 induzida paragem do ciclo celular, foram examinados os possíveis papéis da cyclinD1 , p21 e cdc2 proteínas, que são importantes na regulação do ciclo celular na fase G1 /S. Quarenta e oito horas após a transfecção, os níveis de expressão de cdc2 e cyclinD1 foram reduzidos em comparação com as células de controlo, tanto nas células BGC823 e MKN45. Além disso, os níveis de p21 expressão foram aumentadas (Figura. 2C).

análise proteômica comparativa da linha de células de câncer gástrico MKN45 com ou sem expressão extra de NAIF1 proteína

Os perfis de proteínas de MKN45 as células transfectadas com o pEGFP-N1-NAIF1 constrói como o grupo tratado ou com o vector pEGFP-N1, como o grupo de controlo foram medidos por 2-dE 48 h após a transfecção. No total, mais de 700 manchas foram resolvidas, dos quais 11 proteínas era > 1,5 vezes expresso diferencialmente, tal como determinado por análise com Imagemaster versão 5.0. As manchas de proteínas expressas diferencialmente foram excisadas do gel, e 8 proteínas foram identificadas por análise /TOF MALDI-TOF. Representativo tratado e grupo de controlo de gel de mapas 2-DE estão apresentados na Figura. 3A e as manchas de proteínas expressas diferencialmente são marcados. Megascopic 2-DE gel imagens de cada uma das manchas de proteínas diferencialmente expressas estão representadas na Figura. 3B e 3C. Cinco das proteínas foram sobre-reguladas no grupo tratado incluindo NADH desidrogenase (ubiquinona) proteína Fe-S 1 (NADUSF1), chaperonina contendo TCP1 subunidade 3 (TCP1-γ), tioredoxina redutase um (TXNRD1), proteassoma 26S subunidade 2 ( PSMC2) e do proteassoma 26S subunidade 13 (PSMD13). 3 proteínas foram regulados negativamente, incluindo o inibidor da ribonuclease 1 (RNH1), isoforma proteína 14-3-3 epsilon (14-3-3 ε) e A-I proteína apolipoproteína ligação (APOAIBP). A Tabela 2 mostra as informações específicas sobre estas proteínas e seu nível de expressão diferencial.

Validação de proteínas diferencialmente expressos

Em tempo real qPCR e western blot foram realizados para verificar o 2-DE resultados. níveis das proteínas identificadas de expressão de genes foram analisadas por qPCR em tempo real e são consistentes com os resultados de 2-DE, excepto para uma proteína, 14-3-3ε (Figura. 4A). Três proteínas foram selecionados com base em sua importância e funções prováveis ​​para posterior análise por transferência Western para verificar os resultados 2-DE. Os resultados mostram que os níveis de TXNRD1 e TCP1-γ expressão de proteína foram significativamente aumentados no grupo NAIF1 em comparação com o grupo de controlo ( P
< 0,05), enquanto que o nível de expressão da proteína 14-3-3ε foi significativamente reduzida no grupo NAIF1 ( P < 0,05
) (Figura 4B.). No geral, os resultados Western blot são consistentes com os resultados de 2-DE

Discussão

Vários estudos têm sido realizados para descrever o gene NAIF1.; No entanto, pouco se sabe sobre o perfil NAIF1 proteômica é abundante. O objetivo do presente estudo foi detectar e identificar proteínas cuja expressão é alterada em células MKN45 com superexpressão NAIF1. Além disso, a prova é fornecida para explicar como NAIF1 funções na indução de apoptose celular e outras atividades. A estratégia 2-DE foi empregado neste estudo devido à sua metodologia conveniente e alta eficiência. No total, foram detectadas e identificadas 5 proteínas que foram sobre-reguladas e 3 proteínas que foram regulados negativamente em células que sobre-expressam MKN45 NAIF1 em comparação com o grupo de controlo. As proteínas identificadas envolvem uma série de atividades fisiológicas, como a degradação de proteínas, controle da homeostase redox celular, progressão do ciclo celular, a regulação do citoesqueleto, a resposta ao estresse celular, apoptose e regulação do metabolismo. O perfil de ciclo celular de linhas celulares de cancro gástrico, BGC823 e MKN45 também foi investigada, e os nossos resultados demonstraram que a sobre-expressão de NAIF1 pode induzir a paragem do ciclo celular na fase G1 /S através de alterar os níveis de proteínas de regulação do ciclo celular cyclinD1, cdc2 e p21 expressão .

Os resultados de western blot e reverter PCR de transcrição demonstrou que NAIF1 foi minimamente expressa em células de câncer gástrico. Os dados aqui apresentados é análoga à constatação de Luo nos tecidos [10]. Além disso, constatou-se que NAIF1 é uma proteína nuclear nas linhas celulares de cancro gástrico e MKN45 BGC823. Uma vez que o ADN genómico existe principalmente no núcleo, estes dados sugerem que NAIF1 pode funcionar no núcleo através da interacção com o ADN genómico e nucleoproteína, a fim de afectar a expressão de genes e proteínas de forma abrangente. Por esta razão, foi realizada a análise proteômica para investigar o perfil de proteômica de células MKN45 com superexpressão NAIF1.

regulação anormal do ciclo celular é uma característica marcante de células de câncer [11]. Estudos têm demonstrado que muitas moléculas pequenas podem activar os pontos de verificação do ciclo celular e induzem a paragem do ciclo celular, que permitem que as células para reparar defeitos. No entanto, repairation vencida pode conduzir a apoptose [12] - [15]. Nossos resultados mostram que NAIF1 induz a paragem do ciclo celular na fase G1 /S. A transição da fase G1 para a fase S requer a activação do conjunto de cyclinD a CDK4 /ciclina e 6-cdc2 (também conhecido como Cdk1). Enquanto isso, p21 inibe a actividade da cdc2 e medeia a activação da montagem e cyclinD-CDK4 /6 no citoplasma, bem como inibindo a sua actividade no núcleo [16]. Neste estudo, a análise de transferência de Western detectou que os níveis de cyclinD1 e cdc2 expressão de proteína foram reduzidas, enquanto que o nível de expressão da proteína p21 foi aumentada em células que sobre-expressam NAIF1. Estes resultados sugerem que G1 /S do ciclo celular induzida prisão por NAIF1 é mediado através da p21 e cyclinD1 via. Além disso, demonstrou-se que 48 h após a transfecção, a população de células em apoptose aumentada aproximadamente 10% em células que sobre-expressam NAIF1 como resultado da paragem do ciclo celular (Figura S3).

proteassoma 26S é um organelo conservadora em todos células eucarióticas e é responsável pela degradação da proteína intracelular [17]. As proteínas que são degradados pela proteassoma 26S estão envolvidas numa série de processos biológicos, incluindo a apoptose, ciclo celular, e o crescimento e regulação da expressão de muitos genes que, por sua vez, regulam outras processos [18]. Perturbação do equilíbrio degradação da proteína leva à originação e desenvolvimento de câncer. Assim, proteassoma 26S é um alvo atraente terapia do cancro. Aqui, descobrimos que duas subunidades do proteassoma 26S, PSMC2 e PSMD13, foram regulados positivamente em células MKN45 com superexpressão NAIF1. PSMC2 e PSMD13 são subunidades do proteassoma 19S, que é o de partícula de regulamentação (RP) do proteassoma 26S. PSMC2 é uma ATPase enquanto PSMD13 é um não-ATPase. Alguns pesquisadores acreditam que a inibição do proteassoma 26S pode conduzir a apoptose de células de carcinoma, e inibidores de proteassoma podem ser utilizados para tratar o cancro [19] - [21]. No entanto, um estudo realizado por Tan et ai.
Sugere que o factor de necrose tumoral (TNF) -α activa o sistema do proteassoma 26S por cima-regulação dos níveis de expressão 26S proteasoma subunidades [22]. TNF-α é uma citocina bem conhecida, que pode induzir apoptose numa variedade de células cancerosas, e agora é utilizado na prática clínica como um tratamento regional, dos sarcomas dos tecidos moles localmente avançados e melanomas para evitar metástases de amputação de membros [23]. Como TNF-α, NAIF1 também tem a capacidade de induzir a apoptose, o que implica que o proteassoma 26S pode estar envolvido no processo de apoptose induzida por NAIF1.

Os nossos dados também demonstram que duas proteínas, TXNRD1 e NDUFS1, são -regulada por NAIF1. TXNRD1 regula o estado redox de tióis proteicos em células de mamíferos, e em funções tanto promovendo e prevenção do cancro, em diferentes tipos de carcinomas [24] - [27]. Até agora não há estudos para investigar o papel da TXNRD1 no câncer gástrico. Em nossa opinião, TXNRD1 podem participar na supressão da génese câncer gástrico ou o aumento da regulação do TXNRD1 pode ser um mecanismo de adaptação em resposta ao estresse oxidativo gerado pelo superexpressão de NAIF1. O gene NDUFS1 codifica uma subunidade de 75 kDa de Fe-S, que é um dos sete subunidades de complexo I mitocondrial [28]. Complexo I é a maior das enzimas da cadeia respiratória e deficiência do complexo I é a principal causa de uma série de doenças mitocondriais inatos, tais como a síndrome de Leigh [29]. Além disso, a subunidade de 75 kDa do complexo I é um substrato da caspase, que está envolvido na via de apoptose mitocondrial. clivagem de Caspase de NDUFS1 é necessária para várias alterações mitocondriais associadas a apoptose, incluindo os níveis de ATP, a produção de ROS, e a perda de integridade da membrana plasmática e assim por diante [30]. Desde NAIF1 induz a apoptose através da via mitocondrial [8], que a hipótese de que a sobre-regulação de NDUFS1 participa no processo de apoptose induzida por NAIF1.

TCP1-γ tem sido identificada como uma chaperonina no citosol eucariótica. pesquisa anterior tenha encontrado que TCP1-γ é significativa expresso em tumores de carcinoma hepatocelular em comparação com os tecidos tumorais adjacentes emparelhados não malignas [31], [32]. No entanto, a relação entre TCP1-γ e câncer gástrico ainda é desconhecida e mais estudos são necessários.

Por outro lado, foram identificadas três proteínas, 14-3-3ε, RNH1 e APOAIBP, que foram down- regulada em células MKN45 com superexpressão NAIF1. 14-3-3 é uma família de proteínas que consiste em proteínas multifuncionais, que se ligam a e modulam as funções de uma ampla gama de proteínas celulares. Além disso, eles participam de diversos processos biológicos, incluindo regulação do ciclo celular checkpoint, apoptose e controle do crescimento celular [33]. Vários estudos têm relatado que a expressão 14-3-3ε é aumentada em câncer de pulmão, câncer hepatocelular, câncer de mama e carcinoma epidermóide vulvar [34] - [37]. A única excepção a esta expressão aumentada 14-3-3ε é em tecidos de câncer gástrico, onde a expressão é reduzida [38]. Além disso, estudos anteriores demonstraram que a sobre-regulação de 14-3-3ε pode impedir a apoptose desencadeada-Bad em células endoteliais [39], e as drogas não esteróides anti-inflamatórios podem induzir apoptose de células de cancro colo-rectal, suprimindo 14-3- expressão 3ε [40]. Além disso, um estudo histopatológico relataram que em 114 doentes com carcinoma hepatocelular, a expressão elevada de 14-3-3ε foi significativamente associada com um risco elevado de metástase e diminuiu as taxas de sobrevivência [35]. Cellular experimentos confirmaram que o aumento da expressão 14-3-3ε induz a migração de células de carcinoma hepatocelular e promove a transição epitelial-mesenquimal (EMT) pela indução da expressão Zeb-1 e caracol [41]. Para concluir, 14-3-3ε é um oncogene notável que participa no desenvolvimento de vários tumores e desempenha um papel importante na apoptose e metástase. Aqui, nós descobrimos que 14-3-3ε é sub-regulada em células que sobre-expressam NAIF1 MKN45, o que sugere que 14-3-3ε podem estar envolvidos no processo de apoptose induzida por NAIF1. Além disso, os nossos dados implica que além de induzir a apoptose e ciclo celular prisão, NAIF1 pode desempenhar um papel na migração celular e metástase. Os nossos resultados demonstram que os níveis de expressão da proteína foram 14-3-3ε diminuiu, enquanto que os níveis de ARN foram aumentadas. Estes resultados revelam que NAIF1 regula os níveis de pós-traducionalmente 14-3-3ε expressão. Os nossos dados mostram que os níveis de expressão diferencial 14-3-3ε são contrários ao Leal de [38], que pode ser devido à diferença entre células e tecidos, ou pode ser atribuído à tendência na selecção de amostra.

RNH1 é uma proteína citosólica que inibe RNases e forma heterodímeros de alta afinidade com os a jogar um papel na angiogénese controversa [42]. Tem havido um aumento em estudos de investigação para investigar a relação entre RNH1 e câncer.

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