PLoS ONE: n yli-ilmentyminen Nuclear Apoptoosin indusoiva tekijä 1 muuttanut proteomiikan Profile of Human Mahalaukun syöpäsolu MKN45 ja aiheuttama solukierron pysähtymisen at G1 /S Phase

tiivistelmä

Nuclear apoptoosia indusoivan tekijän 1 (NAIF1) on aiemmin raportoitu indusoivan apoptoosia. Lisäksi ilmaus NAIF1 merkittävästi alassäädetty ihmisen mahasyövän kudoksiin verrattuna viereisiin normaaleihin kudoksiin. Kuitenkin mekanismi, jolla NAIF1 geeni indusoi apoptoosia, ei täysin ymmärretä. Tuloksemme osoittavat, että NAIF1 minimaalisesti ilmaistu testatuista mahasyövän solulinjoissa. Tuloksemme osoittavat myös, että NAIF1 on lokalisoitu ytimet solujen havaittiin seuraamalla vihreää fluoresenssia NAIF1-GFP-fuusioproteiini käyttämällä fluoresoivia konfokaalimikroskopialla. Seuraava vertaileva proteomiikka lähestymistapaa käytettiin tunnistamaan ero proteiinien ekspression välillä mahalaukun syövän solulinjat MKN45 /NAIF1 (-) ja MKN45 /NAIF1 (+). Löysimme viisi proteiineja (proteasomin 26S-alayksikköä 2, proteasomin 26S-alayksikköä 13, NADH dehydrogenaasi Fe-S-proteiinia 1, chaperonin sisältävä TCP1 alayksikön 3 ja tioredoksiinista reduktaasin 1), jotka olivat säädelty ja kolme proteiinit (ribonukleaasi estäjä 1, 14-3- 3-proteiinin epsilon isoformia ja apolipoproteiini AI sitova proteiini), jotka olivat alas-säännelty MKN45 soluissa yli-ilmentävät NAIF1. Olemme myös havainneet, että NAIF1 voi aiheuttaa solusyklin pysähtymisen G1 /S-vaiheessa muuttamalla ilmaus solusyklin proteiineja cyclinD1, cdc2 ja p21. Differentiaalisesti ilmentyneet proteiinit tunnistetaan tässä liittyvät solujen eri ohjelmia, joihin solusyklin, apoptoosin, ja signaalitransduktion sääntelyä ja viittaavat siihen, että NAIF1 voi olla tuumorisuppressori mahasyövässä. Tutkimuksemme antaa näyttöä, että selventää rooli miten NAIF1 toimintoja mahasyövässä.

Citation: Yang M, Zhong J, Zhao M, Wang J, Gu Y, Yuan X, et al. (2014) yli-ilmentyminen Nuclear Apoptoosin indusoiva tekijä 1 muuttanut proteomiikan Profile of Human Mahalaukun syöpäsolu MKN45 ja aiheuttama solukierron pysähtymisen at G1 /S Phase. PLoS ONE 9 (6): e100216. doi: 10,1371 /journal.pone.0100216

Editor: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesu ", Italia

vastaanotettu: 27 lokakuu 2013; Hyväksytty: 23 toukokuu 2014; Julkaistu: 13 kesäkuu 2014

Copyright: © 2014 Yang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat National Key Basic Research Program of China (2007CB914700). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mahalaukun syöpä on yksi yleisimmistä pahanlaatuisten maailmassa aiheuttaa noin 8% ja 10% vuosittaisesta syöpätapauksista ja kuolemia, vastaavasti. Mukaan maailmanlaajuinen epidemia raportti Maailman terveysjärjestön, lähes miljoona mahalaukun syöpätapausta ja 738000 kuolemantapausta arvioidaan tapahtuneen vuonna 2008 [1], [2]. Monet yritykset on otettu kliinisissä; kuitenkin, kuolleisuus mahasyöpäpotilaista on edelleen yhtä korkea kuin 70% [2]. Yksi syy tähän korkea kuolleisuus on, että mahasyövän potilaat eivät useinkaan ole diagnosoitu, kunnes pitkälle, mikä on liian myöhäistä antaa tehokasta hoitoa. Näin ollen on ilmeinen tarve löytää uusia biomarkkereita ja tehokkaiden varhainen diagnoosi ja hoito mahasyövän.

Proteomiikka on käytetty monilla tutkimusaloilla, kuten syövän tutkimukseen. Yhteiset näytteet proteomiikka-analyysi syöpätutkimukseen kuuluvat kudosten ja veren syöpäpotilaita, sekä syövän solulinjat eritaustaiset tai erilaisia ​​hoitoja [3] - [6]. Nämä proteomic analyysejä käytettiin tutkimaan lähdeverkkona ja syövän kehittymiseen tai etsimään diagnostisten biomarkkereita. Tulokset saimme läpi proteomic menetelmät eivät johdu ainoastaan ​​suoraan sääntelyn transkription tasoa, vaan heijastavat myös translaation jälkeisiä modifikaatioita proteiinien [3], [7]. Siksi voimme analysoida sekä ilmaisun ja sääntelyn proteiini proteomic analyysejä. Huolimatta paljon uusien tekniikoiden, 2-ulotteinen elektroforeesi yhdessä massaspektrometrian on pysynyt eniten käytetty menetelmä Proteomiikan analyysiä.

Ihmisen koodaavan geenin ydin- apoptoosia indusoivan tekijän 1 (NAIF1) sijaitsee kromosomissa 9q34.11 . NAIF1 koodaa proteiinia, jossa on Myb
kaltainen domeeni, jonka N-terminaalinen alue [8], [9]. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että yli-ilmentyminen NAIF1 ihmisen syöpäsolulinjoissa HeLa ja MKN45 indusoi apoptoosia [8], [10]. Lisäksi Luo et al.
Havaittu, että NAIF1 merkittävästi ilmaistaan ​​normaalissa mahalaukun kudoksesta, mutta sen ilmentyminen säätyy alas tai kadonnut mahasyövän kudoksissa ( P <
0,001). Lisäksi NAIF1 ilme oli suurempi hyvin erilaistunut ( P
= 0,004) kuin moderately- tai huonosti eriytetty mahasyövän [10]. Kuitenkin rooli NAIF1 säätelyssä solun proteiinin ilmentymisen profiili on tuntematon.

Tässä tutkimuksessa käytimme proteomiikka tekniikka perustuu 2-ulotteinen elektroforeesilla yhdessä MALDI-TOF-massaspektrometrialla proteiinien tunnistamiseen, jotka liittyvät biologisia toimintoja NAIF1. Proteiini ilmentyminen profiilit mahasyövän solulinja, MKN45 tai ilman NAIF1 yliekspressio analysoitiin ja verrattiin käyttäen 24 cm pH 3-10 NL alue immobilisoidun pH-gradientin (IPG) liuskojen. Validoida näitä tietoja, mittasimme RNA ekspressiotasoja kaikista eri ilmaisivat proteiinit ja kolme proteiinit edelleen todentaa western blottauksella. Tuloksemme osoittavat, että NAIF1 indusoi solusyklin pysähtymisen G1 /S-vaiheessa säätelemällä ekspressiotasot cyclinD1, cdc2 ja p21-proteiinin. Tulokset Tutkimuksemme voi johtaa paremman käsityksen NAIF1 toimii apoptoosin ja saattaa myös valottaa diagnosointiin ja hoidon mahasyövistä tulevaisuudessa.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja transfektio

Ihmisen mahalaukun syövän solulinjat MKN45, BGC823, AGS ja SGC7901 saatiin kasvainsolun Bank Kiinan Academic of Medical Sciences ja viljeltiin nestemäisessä Dulbeccon vähintään Essential (DMEM) täydennetty 10% lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia (FBS), 100 IU /ml penisilliiniä, 100 ug /ml streptomysiiniä, 37 ° C: ssa kosteutetussa 5% CO _{2-ilmakehässä. DNA-transfektio suoritettiin käyttämällä X-tremeGENE HP DNA-transfektioreagenssia (Roche, Sveitsi) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti.}

Ekspressioplasmidit

plasmideja pEGFP-N1-NAIF1, joka ilmentää NAIF1-GFP-fuusioproteiini, ja pEGFP-N1, joka ilmentää vihreää fluoresoivaa proteiinia (GFP), oli ystävällisesti toimittanut Dr. Qing Luo [10].

Cell cycle-analyysillä

Eksponentiaalisesti kasvavat solut transfektoitiin pEGFP-N1-vektori tai pEGFP-N1-NAIF1 plasmidi. Solut kerättiin 24 h tai 48 h transfektion jälkeen, ja 1 x 10 ^{6 solut pestiin kahdesti fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ja kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 4 ° C: ssa 1 h. Sentrifugoinnin jälkeen, solupelletit suspendoitiin uudelleen värjäystä liuosta (0,05 mg /ml propidiumjodidia (PI), 0,2 mg /ml RNaasi, ja 0,1% Triton X-100) 4 ° C: ssa 15 minuutin ajan pimeässä. Virtaussytometria-analyysi GFP: n ja PI suoritettiin käyttäen BD LSR II solun analysaattori (BD, San Jose, CA, USA). PI-fluoresenssi mitattiin joukossa GFP-positiivisten solujen populaation ja jakaumat solusykleihin analysoitiin ModFit LT3.2 ohjelmistoa. Kolme erillistä näytteet valmistettiin ja kaikki määritykset suoritettiin kolmena kappaleena.}

kvantifiointi apoptoosin

kvantifiointi apoptoosin suoritettiin käyttäen PE anneksiini V Apoptosis Detection Kit I (BD). Lyhyesti, BGC823 tai MKN45 solut transfektoitiin pEGFP-N1-vektori tai pEGFP-N1-NAIF1 plasmidi. Seuraavat 24 h tai 48 h transfektion jälkeen, solut otettiin talteen, pestiin kylmällä PBS: llä kaksi kertaa, ja sitten suspendoitiin uudelleen sitomispuskurilla (10 mM Hepes /NaOH (pH 7,4), 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl _{2) . Uudelleen suspendoidut solut inkuboitiin fykoerytriini (PE) konjugoidulla anneksiini V (AV) ja 7-amino-aktinomysiini (7-AAD), ja mitattiin sitten virtaussytometrialla käyttäen BD LSR II solun analysaattorin. Neljä erillistä solupopulaatioiden voitiin havaita dot-juoni: elinkelpoisia soluja (AV ^{- /7-AAD -), varhaisen vaiheen apoptoottisia soluja (AV + /7-AAD - ), loppuvaiheen apoptoottisia soluja (AV + /7-AAD +), ja nekroottinen solut (AV - /7-AAD +). Vähintään 10000 GFP-positiiviset solut laskettiin näytettä kohti ja tiedot ilmoitettiin prosenttiosuutena apoptoottisten solujen (AV + /7-AAD - ja AV + /7-AAD + ) osuus koko soluja. Kolme riippumatonta näytettä valmisteltiin ja kaikki määritykset toistettiin kolme kertaa.}}

konfokaali skannaus

Neljäkymmentä kahdeksan tuntia transfektion jälkeen solut pestiin kolme kertaa PBS: llä ja kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 15 min. huoneen lämpötilassa. Parantaa läpäisevyyttä solukalvon, soluja inkuboitiin 0,5% Triton X-100, jota seurasi inkubointi 4 ', 6-diamino-2-fenyyli (DAPI) värjäämiseksi ytimiä. Cellular jakelu NAIF1 analysoitiin seuraamalla vihreän fluoresenssin NAIF1-GFP-fuusioproteiini käyttämällä Leica Heidelberg GmbH mikroskoopilla.

Protein valmistelu 2-DE

Kunkin näytteen, 5 x 10 ^{6-solut kerättiin ja lyysattiin 1 ml: ssa lyysipuskuria (7 M urea, 2 M tioureaa, 2% CHAPS, 20 mM DL-ditiotreitolia (DTT), 1 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridi (PMSF), 30 mM natriumfluoridi, ja 0,25 mg /ml RNaasiA) 1 h huoneen lämpötilassa, ja sitten sentrifugoitiin 4 ° C: ssa 30 minuutin ajan. 12000 rpm. Supernatantti siirrettiin uuteen putkeen ja konsentroidaan 0,1 M NH _{4COOH. Hajotuspuskuria lisättiin lopulliseen tilavuuteen 800 ui, ja proteiinikonsentraatio määritettiin käyttäen Bradford-määritystä (Tiangen, Peking, Kiina).}}

Kaksiulotteinen elektroforeesi

Kaksiulotteinen elektroforeesi suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [5]. Lyhyesti, 1 mg proteiineja laimennettiin 450 ui nesteytys-puskuria (7 M urea, 2 M tioureaa, 2% CHAPS, 20 mM DTT). IPG nauhat (IPG, 24 cm, pH 3-10, NL, GE Limit). Rehydratoitiin uudelleenhydratoitujen näytteitä 18 tuntia huoneenlämpötilassa. Proteiinit tehtiin isoelektrisellä fokusoinnilla kanssa Ettan IPGphorIII (GE, CT, USA) peräkkäin 1 tunnin ajan 100 V, 1 tunti 250 v, 1 h 500 v, 1 h 1000 v, 1 h 3000 v, 1 h 5000 v, 2 h 8000 v ja 6 h 8000 v saada yhteensä 80 KVH. Sen jälkeen, isoelektrinen fokusointi, IPG liuskoja tasapainotettiin tasapainotuspuskuria I (6 M ureaa, 150 mM Tris-HCl (pH 8,8), 30% glyserolia, 2% SDS: ää, 1% DTT) 15 minuuttia. jota seuraa toinen inkubointi toisen tasapainottava puskuri II (6 M ureaa, 150 mM Tris-HCl (pH 8,8), 30% glyserolia, 2% SDS, 2,5% jodiasetamidi) 15 minuutin ajan. Toisen ulottuvuuden SDS-PAGE suoritettiin 12,5% SDS-PAGE-geeleillä käyttäen Ettan DALT SIX pystysuora järjestelmät (GE).

Gel värjäys ja kuva-analyysi

SDS-PAGE geelit kiinnitettiin vahvistaessaan-puskurissa (10% CH _{3COOH, 40% C 2 H 5OH, ja 50% DDH 2O) 30 minuutin ajan. Geelit pestiin sitten DDH 2O 10 min. 3 kertaa ja värjättiin Coomassie blue G-250.}

geelit skannattiin skanneria käyttäen MagicScan ohjelmistoa arvioida paikalla kuvioita. ImageMaster platina (versio 5.0) käytettiin analysoimaan geelin kuvia. Pilkut joka havaittiin sekä valvontaa geeli ja NAIF1 geeli analysoitiin ja intensiteetti kunkin täplän kvantitoitiin laskemalla spot tilavuus normalisoinnin jälkeen geelin kuva. Kvantitatiivinen analyysi geelin kuvia (kolme toistoa /näyte) otettiin ja täplien tilastollisesti merkitsevästi eroja (t-testi, * P
< 0,05) leikattiin ja hajotettiin tunnistamiseen.

Protein tunnuksilla

Differentially ilmaisi proteiinitäplien poimittiin ja de-värjättiin 50 mM NH _{4HCO 3 /asetonitriiliä (50/50) ja kuivataan tyhjiösentrifugoinnilla. Geelipalat jälkeen pilkottiin 10 ng /ml trypsiiniä (Promega, WI, USA) 50 mM NH 4HCO 3-puskurissa 37 ° C: ssa yön yli. Trypsiini neste siirrettiin puhtaaseen putkeen, laimennettiin 100 ul: 60% asetonitriili /0,1% trifluorietikkahappo, ja käsiteltiin ultraäänellä 15 minuutin ajan kolme kertaa. Kaikki hankittu neste otettiin talteen ja kuivattiin tyhjössä ja säilytettiin -80 ° C: ssa. Eluoidut peptidit ovat analysoitiin käyttäen Bruker Ultraflex MALDI-TOF /TOF varustettu SCOUT lähteeseen BGI-Beijing. Tulokset massaspektri olivat vastakkain nisäkkään sekvenssien NCBInr (ei-redundantti) tietokanta peptidin massan sormenjälkien tunnistamista.}

RNA: n eristäminen, RT ja reaaliaikainen Q PCR

Kokonais-RNA oli uutettiin käyttäen TRIzol-reagenssia (Invitrogen) mukaisesti valmistajan protokollaa. cDNA syntetisoitiin käänteistranskriptiolla käyttämällä 1 ug kokonais-RNA: ta oligo (dT) _{18-alukkeita ja M-MuLV-käänteistranskriptaasia (TAKARA).}

käänteisen transkription PCR alukkeet NAIF1 ja β-aktiini oli seuraavasti: NAIF1 mielessä, 5'AGCCACGGTCACCCTGACACA-3 ', ja anti-sense, 5'CGTGTCTGCATGCTGGGCCAT-3'; p-aktiini mielessä, 5'GGGCACGAAGGCTCATCATT-3 ', ja anti-sense, 5'AGCGAGCATCCCCCAAAGTT. Kaikki alukkeet suunniteltiin käyttämällä NCBI räjähdys ja ostetaan Sangon, Beijing.

Kvantitatiivinen PCR suoritettiin SYBR Green qPCR Kit (TAKARA, Japani) ja 20 ui reaktiota perustettua mukaan valmistajan ohjeiden. Kohdegeenin ilmentyminen analysoitiin käyttäen sopivia reaaliaikaista qPCR alukkeet (taulukko 1). β-aktiini käytettiin normalisointia. Reaaliaikaista qPCR oli tehtävä sellaisen ABI7300 cycler (ABI, MA, USA) seuraavin ehdoin: denaturaatio 30 s 95 ° C: ssa, jota seurasi 40 sykliä denaturointi 5 s 95 ° C: ssa, ja laajennus 31 s 60 ° C: ssa. Sulamiskäyräanalyysi suoritettiin lopussa vahvistaa spesifisyyttä odotetun PCR-tuotteen. Suhteellinen ekspressio laskettiin käyttäen kahta standardikäyrän menetelmiä. Kolme riippumatonta näytettä valmistettiin kutakin kunnossa ja jokainen koe suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

Western-blottaus

Western-blottaus suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu. Lyhyesti, 2 x 10 ^{6 solut kerättiin keskipitkän virtauksen, pelletoitiin sentrifugoimalla 5 minuutin ajan 500 g
, ja pestiin 3 kertaa PBS: llä. Sitten solut hajotettiin 100 pl hajotuspuskuria (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1,5% NP-40, 0,1% SDS, ja 50 ug /ml PMSF: ää, jossa on juuri lisätty proteinaasinestäjä cocktail) jäällä 30 min. Lysaatit sentrifugoitiin 13000 rpm: llä 15 minuutin ajan. ja proteiinipitoisuus mitattiin käyttämällä Bradford menetelmiä. Viisikymmentä mikrogrammaa proteiinit erotettiin 12% SDS-PAGE: lla ja siirrettiin polyvinylideenidifluoridi kalvoja. Membraanit blokattiin 5% BSA TBST: ssä yhden tunnin ajan huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen inkubaatio primaarisen vasta-aineen mukaisia ​​ratkaisuja valmistajan ohjeiden (β-aktiini, 1:5000, Sigma, NAIF1, 1:1000, Santa Cruz, 14- 3-3 ε, 1:500, Santa Cruz, TCP1-γ, 1:1000, Abcam; TXNRD1, 1:1000, Abcam; CyclinD1, 1:1000, CST, cdc2, 1:500, CST, ja p21, 1 :500, CST). Kalvot pestiin 3 kertaa TBST: llä, mitä seurasi inkubointi sopivan sekundäärisen vasta-aineiden kaksi tuntia huoneen lämpötilassa. Signaalit havaittiin käyttämällä ECL Chemiluminescence järjestelmään. β-aktiini käytettiin kontrollina.}

Tilastollinen analyysi

Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen SPSS 13.0 ohjelmistolla (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Data ilmaistiin keskiarvoina ± SD. Opiskelijan t-testiä käytettiin tilastollista vertailua. Siihen liittyvän arvon P <
0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

Transfektoituja NAIF1 tumassa

Molemmat reverse transkription PCR ja western blotting kokeiluja osoittivat, että NAIF1 minimaalisesti ilmaistu mahasyövän solulinjoissa, MKN45, BGC823, AGS, ja SGC7901; kun taas NAIF1 on helposti havaittavissa, kun se transfektoitiin soluihin (kuvio. 1A ja B). Me transfektoimme NAIF1-GFP fuusion rakentaminen osaksi MKN45 ja BGC823 solujen ja GFP-vektorilla, käytettiin kontrollina. Konfokaalimikroskopia osoittaneet, että kun solut transfektoitiin pEGFP-N1-NAIF1 konstrukti, vihreä fluoresenssi havaittiin vain tumissa; päinvastoin, vihreä flurescent signaalia ei havaittu koko solussa, kun transfektoitu GFP-vektorilla (kuvio. 1C). Samat tulokset havaittiin myös muita solulinjoja kuten BGC823 (kuvio S1). Nämä havainnot vahvistivat, että transfektoitu NAIF1 proteiini tumassa.

NAIF1 indusoiman solusyklin pysähtymisen G1 /S-vaiheen

solusyklin profiili mahasyövän solujen vaikutuksesta NAIF1 tutkittiin seuraava. GFP-positiiviset solut analysoitiin varmistaakseen väestöstä käyttää (kuva S2). Virtaussytometrinen analyysi osoitti, että NAIF1 indusoi merkittävän muutoksen jakautuminen solusyklin: lisäys solupopulaation G0 /G1 vaiheen ja lasku S-vaiheen soluissa havaittiin yli-ilmentävät NAIF1 verrattuna soluihin transfektoitiin tyhjällä vektori, sekä transfektion jälkeen 24 h ja 48 h. Kuten on esitetty kuviossa. 2A, virtaussytometria osoitti, että 24 tunnin kuluttua transfektion, noin 54% on BGC823 transfektoitujen solujen pEGFP-N1 vektori olivat G0 /G1 vaiheessa, ja 34% ja 12% soluista oli S-vaiheessa ja G2 /M vaiheessa, vastaavasti . Toisaalta, in BGC823 transfektoitujen solujen pEGFP-N1-NAIF1 rakentaa oli selvä kasvu prosenttiosuus solujen G0 /G1 vaihe (74%), samoin kuin lasku solujen prosenttiosuus S-vaiheessa (26%) ja G2 /M-vaiheen (0%). Neljäkymmentä kahdeksan tuntia transfektion jälkeen, noin 36%: n BGC823 valvonnan solut olivat G0 /G1 vaiheessa, ja 59% ja 5% soluista ovat S-vaiheessa ja G2 /M-vaiheessa vastaavasti. Vuonna BGC823 transfektoitu pEGFP-N1-NAIF1 rakentaa, noin 55% soluista oli G0 /G1 vaiheessa, ja 37% ja 8% soluista oli S-vaiheessa ja G2 /M-vaiheessa, vastaavasti. Vuonna MKN45 soluissa, 24 h transfektion jälkeen, noin 56% soluista, jotka on transfektoitu pEGFP-N1 vektori oli G0 /G1 vaiheessa, ja 29% ja 15% soluista oli S-vaiheessa ja G2 /M-vaiheessa, vastaavasti. Noin 76% ja MKN45 transfektoitujen solujen pEGFP-N1-NAIF1 konstrukti oli G0 /G1 vaiheeseen, ja prosenttiosuudet solujen S-vaiheessa ja G2 /M-vaiheen alenivat 24% ja 0%, tässä järjestyksessä. Neljäkymmentäkahdeksan tuntia transfektion jälkeen, noin 43% MKN45 valvonnan solut olivat G0 /G1 vaiheessa, ja 43% ja 14% soluista oli S-vaiheessa ja G2 /M-vaiheessa, vastaavasti. Vuonna MKN45 transfektoitu pEGFP-N1-NAIF1 rakentaa, noin 56% soluista oli G0 /G1 vaiheessa, ja 28% ja 16% soluista oli S-vaiheessa ja G2 /M-vaiheessa, vastaavasti (kuvio. 2B). Nämä tulokset osoittavat selvästi, että yli-ilmentyminen NAIF1 indusoiman solusyklin pysähtymisen G1 /S-vaiheen mahasyövän solujen BGC823 ja MKN45.

selvennetään mekanismi, jonka NAIF1 indusoi solusyklin pysähtymiseen, tutkimme mahdolliset roolit cyclinD1 , p21 ja cdc2 proteiineja, jotka ovat tärkeitä solukierron säätelyssä G1 /S-vaiheessa. Neljäkymmentä kahdeksan tuntia transfektion jälkeen ekspressiotasot cyclinD1 ja cdc2 vähennettiin kontrolliin verrattuna soluihin, sekä BGC823 ja MKN45 soluja. Lisäksi ilmentymistasot p21 lisättiin (kuvio. 2C).

Vertaileva proteomiikka-analyysi mahalaukun syövän solulinja MKN45 kanssa tai ilman ylimääräisiä ilmentymisen NAIF1 proteiinin

proteiini profiilit MKN45 solut, jotka on transfektoitu pEGFP-N1-NAIF1 rakentaa kuin käsitellyn ryhmän kanssa tai pEGFP-N1 vektorin kontrolliryhmän mitattiin 2-DE 48 h transfektion jälkeen. Kaikkiaan yli 700 paikkoja ratkaistiin, joista 11 proteiineihin > 1,5-kertainen ilmentyvät eri määritettynä analyysin kanssa ImageMaster versio 5.0. Differentiaalisesti ekspressoitu proteiini täplät leikattiin irti geelistä, ja 8-proteiinit tunnistettiin MALDI-TOF /TOF-analyysi. Edustavia koe- ja kontrolliryhmässä 2-DE geeli kartat on esitetty kuvassa. 3A ja differentiaalisesti ekspressoidun proteiinin paikkoja on merkitty. Megascopic 2-DE-geelin kuvia kunkin differentiaalisesti ekspressoidun proteiinin kohteet ovat edustettuina kuviossa. 3B ja 3C. Viisi proteiinit olivat säädelty hoidetussa ryhmässä lukien NADH dehydrogenaasi (ubiquinone) Fe-S-proteiinin 1 (NADUSF1), chaperonin sisältävä TCP1 alayksikön 3 (TCP1-γ), tioredoksiini reduktaasin 1 (TXNRD1), proteasomin 26S-alayksikköä 2 ( PSMC2) ja proteasomin 26S-alayksikköä 13 (PSMD13). 3 proteiinit alassäädetty, kuten ribonukleaasi-inhibiittori 1 (RNH1), 14-3-3 proteiinia epsilon isoformin (14-3-3 ε) ja apolipoproteiini A-I sitovan proteiinin (APOAIBP). Taulukko 2 esittää erityisiä tietoja näiden proteiinien ja niiden taso differentiaalikaavojen.

validointi ilmentyvät eri proteiinien

Reaaliaikainen qPCR ja western blotting suoritettiin tarkistaa 2-DE tulokset. Geeniekspressiotasot tunnistetuista proteiineista analysoitiin reaaliaikaisella qPCR ja ovat yhdenmukaisia ​​2-DE tulokset, lukuun ottamatta yhtä proteiinia, 14-3-3ε (kuva. 4A). Kolme proteiinit valitaan niiden merkitys ja todennäköisesti toimii edelleen analysointia Western blotting tarkistaa 2-DE tuloksia. Tulokset osoittavat, että proteiini ekspressiotasot TXNRD1 ja TCP1-γ merkittävästi lisääntynyt NAIF1 ryhmässä verrattuna kontrolliryhmään ( P
< 0,05), kun taas proteiinin ekspressiotaso 14-3-3ε oli merkittävästi vähentynyt NAIF1 ryhmässä ( P <
0,05) (kuvio. 4B). Kaiken western blot tulokset ovat yhdenmukaisia ​​2-DE tuloksia.

Keskustelu

Useat tutkimukset ovat tehty kuvaamaan NAIF1 geeni; Kuitenkin vähän tiedetään proteomic profiilin NAIF1 yliekspressoidaan. Tavoitteena Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli havaita ja tunnistaa proteiineja, joiden ilmentymistä muutetaan MKN45 yliekspressoiviin soluihin NAIF1. Edelleen esitetään näyttöä, miten NAIF1 toimii asiakkuutta apoptoosia ja muuta toimintaa. A2-DE strategiaa käytettiin tässä tutkimuksessa, koska sen kätevä menetelmiä ja korkea hyötysuhde. Kaikkiaan meillä ja tunnistettu 5 proteiineja, jotka olivat säädelty ja 3 proteiineja, jotka olivat säädellä vähentävästi MKN45 soluissa yli-ilmentävät NAIF1 verrattuna kontrolliryhmään. Tunnistetut proteiinit liittyy useita fysiologisia toimintoja, kuten proteiinien hajoaminen, valvonta solu redox homeostaasin, solusyklin etenemisen, solun tukirangan asetus, solu stressin vastaus, apoptoosin ja sääntelyn aineenvaihduntaa. Solusyklin profiili mahalaukun syövän solulinjat, BGC823 ja MKN45 tutkittiin myös, ja tuloksemme osoittivat, että yli-ilmentyminen NAIF1 voi aiheuttaa solusyklin pysähtymisen G1 /S-vaiheen kautta muuttamalla ekspressiotasot solukierron säätelyssä proteiineja cyclinD1, cdc2 ja p21 .

tulokset western blotting ja reverse transkription PCR osoitti, että NAIF1 oli minimaalisesti ilmaistu mahalaukun syöpäsoluja. Tässä esitetyt on analoginen Luo havaintoa kudoksissa [10]. Lisäksi olemme vahvistaneet, että NAIF1 on tumaproteiini mahalaukun syövän solulinjat MKN45 ja BGC823. Koska genomisen DNA esiintyy pääasiassa tumassa, tämä data viittaa siihen, että NAIF1 voivat toimia ydin vuorovaikutuksessa genomisen DNA: n ja nukleoproteiini, jotta vaikuttaa geenien ja proteiinien kattavasti. Tästä syystä teimme proteomiikka-analyysi tutkia proteomic profilointi MKN45 solujen yli-ilmentävät NAIF1.

Epänormaali säätely solusyklin on merkittävä ominaisuus syöpäsolujen [11]. Tutkimukset ovat osoittaneet, että monet pienet molekyylit voivat aktivoida solusyklin tarkastuspisteitä ja aiheuttaa solusyklin pysähtymiseen, joiden avulla solut korjaamaan vikoja. Kuitenkin epäonnistunut repairation voi johtaa apoptoosin [12] - [15]. Tuloksemme osoittavat, että NAIF1 indusoi solusyklin pysähtymisen G1 /S-vaiheessa. Siirtyminen G1 S-vaiheeseen vaatii aktivaation kokoonpano cyclinD-Cdk4 /6 ja sykliini-cdc2 (tunnetaan myös nimellä CDK1). Samaan aikaan p21 inhiboi cdc2 ja välittää kokoonpano ja aktivointi cyclinD-CDK4 /6 sytoplasmassa sekä estämällä niiden toiminnan tumassa [16]. Tässä tutkimuksessa, western blotting-analyysi havainnut, että proteiinin ilmentymisen tasot cyclinD1 ja cdc2 laskivat, kun taas proteiinin ekspressiotaso p21 lisättiin soluissa, jotka yliekspressoivat NAIF1. Nämä tulokset viittaavat siihen, että G1 /S solusyklin pysähtymisen aiheuttamaa NAIF1 välittyy p21 ja cyclinD1 kautta. Lisäksi olemme osoittaneet, että 48 h transfektion jälkeen, väestö apoptoottisten solujen kasvoi noin 10% soluissa, jotka yli-ilmentävät NAIF1 seurauksena solusyklin pysähtymisen (kuvio S3).

26S-proteasomin on konservatiivinen organelliin kaikilla eukaryoottisissa soluissa, ja se on vastuussa solunsisäisten proteiinien hajoaminen [17]. Proteiineja, jotka hajoavat 26S-proteasomin ovat mukana useita biologisia prosesseja, kuten apoptoosi, solusyklin ja kasvua ja ekspressiota sääteleviä monia geenejä, jotka puolestaan ​​säätelevät muiden prosessien [18]. Häiriö proteiinin hajoamisen tasapaino johtaa hankinnan ja syövän kehittymisen. Siten 26S-proteasomin on houkutteleva syöpähoidon kohde. Täällä, huomasimme, että kahden alayksikön 26S-proteasomin, PSMC2 ja PSMD13, olivat molemmat säädellään ylöspäin MKN45 soluissa yli-ilmentävät NAIF1. PSMC2 ja PSMD13 ovat alayksikön 19S-proteasomin, joka on sääntelyn hiukkanen (RP) ja 26S-proteasomin. PSMC2 on ATPaasi, kun PSMD13 on ei-ATPaasi. Jotkut tutkijat uskovat, että 26S-proteasomin inhibitio voi johtaa apoptoosin masoluja, ja proteasomiestäjät voitaisiin käyttää syövän hoidossa [19] - [21]. Kuitenkin tutkimus Tan et al.
Viittaa siihen, että tuumorinekroositekijä (TNF) -α aktivoi 26S-proteasomin järjestelmän ajan säätelemällä ekspressiotasot 26S-proteasomin alayksiköt [22]. TNF-α on hyvin tunnettu sytokiini, joka voi aiheuttaa apoptoosin erilaisia ​​syöpäsoluja, ja nyt sitä käytetään klinikalla alueellisena hoidossa paikallisesti edennyt pehmytkudossarkoomien ja etäpesäkkeiden melanoomien välttämiseksi amputaatio raajojen [23]. Kuten TNF-α, NAIF1 on myös kyky indusoida apoptoosia, mikä tarkoittaa, että 26S-proteasomin voi olla osallisena apoptoosin prosessin aiheuttama NAIF1.

tiedot osoittavat myös, että kaksi proteiinia, TXNRD1 ja NDUFS1, ovat up-säännellään NAIF1. TXNRD1 säätelee redoksitilassa proteiinin tioleja nisäkässoluissa, ja toiminnot sekä edistää ja estää syövän erilaisten karsinoomien [24] - [27]. Ei ole tutkittu tutkia roolia TXNRD1 mahasyövän. Mielestämme TXNRD1 voivat osallistua tukahduttaminen mahasyövän synty tai säätely ylöspäin TXNRD1 voi olla adaptiivinen mekanismi vastauksena oksidatiivista stressiä syntyy yliekspressio NAIF1. NDUFS1 geeni koodaa 75 kDa: n Fe-S-alayksikön, joka on yksi seitsemästä mitokondrioiden alayksiköt kompleksin I [28]. Complex I on suurin Hengitysketjun entsyymejä ja puute monimutkaisten I on suurin syy sarjan synnynnäinen mitokondriotauteja, kuten Leigh oireyhtymä [29]. Lisäksi 75 kDa: n alayksikkö kompleksin I on kaspaasi substraatti, joka on osallisena mitokondrioiden apoptoosireittiä. Kaspaasi pilkkominen NDUFS1 tarvitaan useita mitokondrioiden muutoksiin liittyy apoptoosiin, kuten ATP-tasot, ROS tuotanto, ja plasmamembraanin menetys eheys ja niin edelleen [30]. Koska NAIF1 indusoi apoptoosin kautta mitokondrioiden reitin [8] oletamme, että säätely ylöspäin NDUFS1 osallistuu apoptoosin prosessin aiheuttama NAIF1.

TCP1-γ on todettu olevan chaperonin eukaryoottisissa sytosoliin. Aiempi tutkimus on todennut, että TCP1-γ on merkittävä ilmaistaan ​​kasvaimissa Maksasolusyövän verrattuna pariksi viereisen ei-pahanlaatuinen kasvain kudosten [31], [32]. Kuitenkin suhde TCP1-γ ja mahasyövän on vielä tuntematon, ja lisätutkimusta tarvitaan.

Toisaalta, olemme määritelleet kolme proteiinia, 14-3-3ε, RNH1 ja APOAIBP, jotka olivat alaspäin säännelty MKN45 soluissa yli-ilmentävät NAIF1. 14-3-3 on proteiini perhe koostuu monimuotoisen proteiineja, jotka sitoutuvat ja moduloivat toimintoja monenlaisia ​​solun proteiinien. Lisäksi he osallistuvat erilaisiin biologisiin prosesseihin, kuten solusyklin Checkpoint sääntelyä, apoptoosin, ja solujen kasvun säätelyssä [33]. Useat tutkimukset ovat raportoineet, että 14-3-3ε ilmentyminen on lisääntynyt keuhkosyöpä, hepatocelluar, rintasyöpä ja emättimen okasolusyöpä [34] - [37]. Ainoa poikkeus tästä lisääntynyt 14-3-3ε ilmaus on mahasyövän kudoksissa, joissa ilmentyminen on vähentynyt [38]. Lisäksi, aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että säätely ylöspäin 14-3-3ε voi estää Bad-laukaista apoptoosin endoteelisoluilla [39], ja ei-steroidiset anti-inflammatoriset lääkkeet voivat aiheuttaa peräsuolen syövän solujen apoptoosia estämällä 14-3- 3ε ilmaisun [40]. Lisäksi histopatologinen tutkimus kertoo, että vuonna 114 maksasyövän potilaille, kohonnut ilmentyminen 14-3-3ε merkitsevästi liittyy suuri riski etäpesäke ja laski eloonjäämisluvut [35]. Cellular vahvistivat, että lisääntynyt 14-3-3ε ilmaisu indusoi maksasyövän solujen vaeltamiseen ja edistää epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) indusoimalla Zeb-1 ja Snail ilmaisun [41]. Lopuksi, 14-3-3ε on merkittävä onkogeeni, joka on mukana kehittämässä useita kasvaimia, ja sillä on tärkeä rooli apoptoosin ja etäpesäkkeiden. Täällä, huomasimme, että 14-3-3ε on säädellä vähentävästi MKN45 soluissa yli-ilmentävät NAIF1, mikä viittaa siihen, että 14-3-3ε voi olla osallisena apoptoosin prosessin aiheuttama NAIF1. Lisäksi meidän tiedot viittaavat siihen, että lisäksi aiheuttamaan apoptoosin ja solusyklin pysähtymiseen, NAIF1 voi olla rooli solujen vaeltamiseen ja etäpesäke. Tuloksemme osoittavat, että proteiinin ekspressiotasot 14-3-3ε laskivat, kun taas RNA-tasot olivat lisääntyneet. Nämä tulokset osoittavat, että NAIF1 säätelee ekspressiotasot 14-3-3ε translaation jälkeen. Meidän tiedot, jotka osoittavat ero ekspressiotasot 14-3-3ε ovat ristiriidassa Leal [38], jotka voivat johtua siitä, että ero soluja ja kudoksia, tai se voi johtua harha näytteen valinta.

RNH1 on sytosolin proteiiniin, joka estää RNaaseista ja muodostaa suuren affiniteetin heterodimeerejä niillä voisi olla ristiriitainen asema angiogeneesissä [42]. On ollut kasvua tutkimusten tutkia suhdetta RNH1 ja syöpä.

• PLoS ONE: kasvutekijän-Like Domain sisältävä proteiini 7 (EGFL7) Parantaa EGF Receptor-AKT Signaling, epiteeliä-mesenkymaalitransitioon, ja Metastasis mahasyöpä- Cells
• PLoS ONE: Tällä NOD-kaltainen reseptori merkinanto Pathway in helikobakteeri-infektion ja Related mahasyövän A tapauskontrollitutkimuksessa ja Gene Expression analyysit