PLoS ONE: Гиперэкспрессия ядерного апоптоз-индуцирующий фактор 1 изменившие Proteomic Профиль человеческого рака желудка клетки MKN45 и индуцированные клеточного цикла в G1 /S Phase

Абстрактный
<р> Ядерный апоптозиндуцирующая фактор 1 (NAIF1) ранее сообщалось, индуцирует апоптоз. Кроме того, экспрессия NAIF1 была значительно понижающей регуляции в желудочном раковых тканей человека по сравнению с окружающими нормальными тканями. Тем не менее, механизм, с помощью которого ген NAIF1 индуцирует апоптоз конца не изучен. Наши результаты показывают, что NAIF1 была минимально экспрессируется во всех исследованных желудочных линий раковых клеток. Наши данные также показывают, что NAIF1 локализуется в ядрах клеток, как обнаружено путем мониторинга зеленой флуоресценции NAIF1-GFP слитого белка с помощью флуоресцентного конфокальной микроскопии. Далее, сравнительный Протеомные подход был использован для идентификации дифференциальной экспрессии белков между желудочных линий раковых клеток MKN45 /NAIF1 (-) и MKN45 /NAIF1 (+). Мы обнаружили пять белков (протеасомы 26S субъединица 2, Протеасома 26S субъединица 13, НАДН-дегидрогеназы Fe-S белок 1, шаперонина содержащий TCP1 субъединицу 3 и тиоредоксинредуктазы 1), которые были повышающей регуляции и три белка (рибонуклеазы ингибитор 1, 14-3- 3 белка эпсилон изоформы и аполипопротеина AI-связывающий белок), которые были понижающей регуляции в клетках MKN45 с гиперэкспрессией NAIF1. Мы также обнаружили, что NAIF1 может вызвать остановку клеточного цикла в фазе G1 /S путем изменения экспрессии белков клеточного цикла cyclinD1, cdc2 и р21. Дифференциально выраженные белки, определенные здесь связаны с различными клеточными программ, включающих клеточный цикл, апоптоз, и регулирование передачи сигнала и позволяют предположить, что NAIF1 может быть супрессоров опухоли при раке желудка. Наше исследование свидетельствует о том, что проясняет роль, как функционирует NAIF1 при раке желудка
<р> Образец цитирования:. Ян M, J Zhong, Чжао М, Ван J, Гу Y, X Юань и др. (2014) Гиперэкспрессия ядерного апоптоз-индуцирующий фактор 1 изменившие Proteomic Профиль человеческого рака желудка клетки MKN45 и индуцированные остановку клеточного цикла в G1 /S фазе. PLoS ONE 9 (6): e100216. DOI: 10.1371 /journal.pone.0100216
<р> Редактор: Розелла Rota, Оспедале Pediatrico Бамбино Джезу ", Италия
<р> Поступило: 27 октября 2013; Принято: 23 мая 2014 года; Опубликовано: 13 июня 2014
<р> Copyright: © 2014 Ян и др. Это статья с открытым доступом распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются

Финансирование:. Это исследование Работа выполнена при поддержке Национального ключа программы фундаментальных исследований Китая (2007CB914700). Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов

Введение
<р> рак желудка является одним из наиболее распространенных злокачественных опухолей в мире, вызывая приблизительно 8% и 10% годовых случаев рака и смерти, соответственно. Согласно всемирной эпидемии докладе Всемирной организации здравоохранения, около одного миллиона случаев рака желудка и 738,000 смертей, по оценкам, имели место в 2008 году [1], [2]. Много усилий было принято в клинической; однако, смертность больных раком желудка по-прежнему достигает 70% [2]. Одной из причин такой высокой смертности является то, что у больных раком желудка не часто не диагностируется до поздней стадии, что уже слишком поздно, чтобы обеспечить эффективное лечение. Следовательно, существует очевидная необходимость в поиске новых био-маркеры и эффективные стратегии для ранней диагностики и лечения рака желудка.

Протеомика используется во многих областях исследований, включая исследования рака. Общие образцы в протеомики анализа для исследования рака включают в ткани и кровь от онкологических больных, а также линий раковых клеток с разным жизненным опытом или различных методов лечения [3] - [6]. Эти протеомические анализы были использованы для исследования возникновения и развития рака или искать диагностических биомаркеров. Результаты, полученные нами с помощью протеомных методов не только из-за прямого регулирования транскрипционном уровне, но и отражают посттрансляционные модификации белков [3], [7]. Таким образом, мы можем проанализировать как выражение и регулирование белка с протеомическим анализов. Несмотря на множество новых методик, 2-мерная электрофорез в сочетании с масс-спектрометрией остается наиболее используемых метода для протеомики анализа.
<Р> Ген, кодирующий человеческий апоптозиндуцирующая ядерный фактор 1 (NAIF1) находится на хромосоме 9q34.11 , NAIF1 кодирует белок с Myb
-like домен на своем N-концевой области [8], [9]. Предыдущие исследования показали, что избыточная экспрессия NAIF1 в клеточных линиях рака человека HeLa и MKN45 индуцирует апоптоз [8], [10]. . Кроме того, Ло и др
обнаружили, что NAIF1 значительно выражается в нормальной ткани желудка, в то время как его экспрессия подавляется или теряется в раковых тканях желудка ( P &л;
0,001). Кроме того, экспрессия NAIF1 была выше в хорошо дифференцированной ( P
= 0,004), чем в moderately- или плохо дифференцированным раком желудка [10]. Тем не менее, роль NAIF1 в регуляции клеточного профиля экспрессии белка неизвестна.
<Р> В настоящем исследовании мы использовали Протеомические технологию, основанную на 2 двухмерного электрофореза в сочетании с масс-спектрометрией MALDI-TOF для идентификации белков, ассоциированных с биологические функции NAIF1. были проанализированы и сравнены с использованием 24 см рН 3-10 NL диапазон иммобилизованным градиентом рН (IPG) полоски экспрессии белка профили желудка линии раковых клеток, MKN45 с или без NAIF1 избыточной экспрессии. Для проверки этих данных, мы измерили уровни экспрессии РНК всех по-разному экспрессированных белков и три белка были дополнительно проверены с помощью вестерн-блоттинга. Наши результаты показывают, что NAIF1 индуцирует остановку клеточного цикла в /S фазе G1, регулируя уровни экспрессии cyclinD1, cdc2 и p21 белка. Результаты нашего исследования могут привести к лучшему пониманию того, как работает NAIF1 в индукции апоптоза, а также может пролить свет на диагностике и терапии рака желудка в будущем.

Материалы и методы

культура клеток и трансфекция
<р> желудка человека раковых клеток линии MKN45, BGC823, АГС и SGC7901 были получены из банка опухолевых клеток китайского Academic медицинских наук и культивировали в минимальной Essential жидкой среде Дульбекко (DMEM) с добавлением 10% инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (ФБС), 100 МЕ /мл пенициллина, 100 мкг /мл стрептомицина при 37 ° C в увлажненной 5% CO <суб> 2 атмосферы. Трансфекции ДНК проводили с использованием реагента для трансфекции X-tremeGENE HP ДНК (Roche, Швейцария) в соответствии с инструкциями изготовителя.

Expression плазмид
<р> Плазмиды экспрессии pEGFP-N1-NAIF1, выражающее NAIF1-GFP слитый белок, и pEGFP-N1, выражающая зеленый флуоресцентный белок (GFP), был любезно предоставлен доктором Цин Ло [10].

клеточного цикла распределения анализ
<р> Экспоненциально растет клетки, трансфицированные вектором pEGFP-N1 или плазмиды pEGFP-N1-NAIF1. Клетки собирали через 24 ч или 48 ч после трансфекции и 1 × 10 ^{6 клеток дважды промывали фосфатно-солевым буферным раствором (PBS) и фиксировали 4% параформальдегидом при температуре 4 ° С в течение 1 ч. После центрифугирования, клеточный осадок ресуспендировали в растворе для окрашивания (0,05 мг /мл пропидий йодида (PI), 0,2 мг /мл РНКазы и 0,1% Тритон Х-100) при 4 ° С в течение 15 мин в темноте. Анализ проточной цитометрией для GFP и ПИ проводили с использованием анализатора клеток BD LSR II (BD, San Jose, CA, USA). ПИ измеряют флуоресценцию среди положительных клеточной популяции GFP и распределения клеточных циклов анализировали с использованием программного обеспечения ModFit LT3.2. Три отдельные образцы были приготовлены, и все анализы были проведены в трех экземплярах.}

Количественное апоптозом
<р> Количественное апоптоза проводили с использованием PE аннексина V Апоптоз Detection Kit I (BD). В кратком изложении, BGC823 или MKN45 клетки трансфицировали вектором pEGFP-N1 или плазмиды pEGFP-N1-NAIF1. После 24 ч или 48 ч после трансфекции клетки собирали, промывали холодным PBS дважды, а затем повторно суспендируют с буфером для связывания (10 мМ HEPES /NaOH (рН 7,4), 140 мМ NaCl, 2,5 мМ CaCl <суб> 2) , В ресуспендировали клетки инкубировали с фикоэритрин (РЕ) конъюгированный аннексина V (AV) и 7-амино-актиномицин (7-AAD), а затем измеряли с помощью проточной цитометрии с использованием анализатора клеток BD LSR II. Четыре популяции различных клеток могут быть обнаружены в дот-участка: жизнеспособных клеток (AV - /7-AAD -), в начале фазы апоптотических клеток (AV + /7-AAD - ), в конце фазы апоптотических клеток (AV + /7-AAD +) и отмершие клетки (AV - /7-AAD +). Минимум 10000 GFP-положительных клеток подсчитывали на образец, и данные были представлены как процент апоптотических клеток (AV + /7-ААР - и AV- + /7-ААР + ) среди всех клеток. Три независимых образца были проведены подготовительные работы, и все анализы были повторены в трех экземплярах.

конфокальной сканирующей
<р> Через сорок восемь часов после трансфекции клетки промывали три раза ПБС, а затем фиксировали 4% параформальдегидом в течение 15 лет минимум при комнатной температуре. Для повышения проницаемости клеточной мембраны, клетки инкубировали с 0,5% Тритона Х-100, с последующей инкубацией с 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) для окрашивания ядер. Клеточная распределение NAIF1 анализировали с помощью мониторинга зеленой флуоресценции гибридного белка NAIF1-GFP с помощью микроскопа Leica Microsystems Heidelberg GmbH.

белковый препарат для 2-DE

Для каждого образца 5 × 10 ^{6 клетки собирали и подвергали лизису в 1 мл буфера для лизиса (7 М мочевина, 2 М тиомочевины, 2% CHAPS, 20 мМ DL-дитиотреитола (ДТТ), 1 мМ фенилметилсульфонилфторида (ФМСФ), 30 мМ фторида натрия, и 0,25 мг /мл РНКазы а) в течение 1 ч при комнатной температуре, а затем центрифугировали при 4 ° С в течение 30 мин. при 12000 оборотах в минуту. Супернатант переносили в новую пробирку и концентрировали с помощью 0,1 М NH <к югу> 4COOH. Лизис буфер был добавлен в конечном объеме 800 мкл, и концентрация белка определяли с использованием Бредфорда (Tiangen, Пекин, Китай).}

Двумерный электрофорез
<р> Двумерный электрофорез проводили, как описано ранее [5]. Вкратце, 1 мг белка разводили до 450 мкл с помощью регидратационной буфером (7 М мочевина, 2 М тиомочевины, 2% CHAPS, и 20 мМ DTT). IPG полосы (IPG, 24 см, рН 3-10, NL, GE предел.) Были регидратации с разведенной водой образцов в течение 18 часов при комнатной температуре. Белки были подвергнуты изоэлектрическое фокусирование с Ettan IPGphorIII (GE, штат Коннектикут, США) последовательно в течение 1 ч при 100 В, 1 ч при 250 В, 1 ч при 500 В, 1 ч при 1000 В, 1 ч при 3000 В, 1 ч при 5000 в, 2 ч при 8000 в и 6 ч при 8000 V, чтобы получить в общей сложности 80 KVH. После изоэлектрического фокусирования, IPG полоски уравновешенную уравновешивающим буфером I (6 М мочевины, 150 мМ Трис-HCl (рН 8,8), 30% глицерина, 2% ДСН, 1% DTT), в течение 15 мин. с последующей второй инкубации с другим уравновешивающим буфером II (6 М мочевины, 150 мМ Трис-HCl (рН 8,8), 30% глицерина, 2% ДСН, 2,5% иодацетамид) в течение 15 мин. Второе измерение SDS-PAGE проводили с 12,5% SDS-PAGE гелей с использованием вертикальных систем SIX Ettan DALT (GE).

Гель окрашивания и анализа изображений
<р> SDS-PAGE гели фиксировали в фиксирующей-буфере (10% CH <югу> 3COOH, 40% C <суб> 2H <суб> 5OH, а 50% DDh <суб> 2O) в течение 30 мин. Гели промывали в DDH <югу> 2O в течение 10 мин. 3 раза и окрашивали Кумасси синим G-250.
<Р> Гели были отсканированы с сканера изображений с использованием MagicScan программное обеспечение, чтобы оценить образцы пятна. ImageMaster платины программного обеспечения (версия 5.0) была использована для анализа изображений геля. Пятна, которые наблюдались на обоих геле управления и NAIF1 геле анализировали и интенсивность каждого пятна количественно оценивали путем расчета объема пятна после нормализации изображение геля. Количественный анализ гелевых изображений (три повторности /образец) были взяты и пятна с статистически значимо различия (T-тест, * P
&л; 0,05). Вырезают и переваривают для идентификации

Белковые идентификаций
<р> Дифференциально выражены белковые пятна были извлечены и де-окрашивали в 50 мМ NH <суб> 4HCO <суб> 3 /ацетонитрил (50:50) и сушат с помощью вакуумного центрифугирования. Кусочки гел затем переваривают с 10 нг /мл трипсина (Promega, WI, USA) в 50 мМ NH <к югу> 4HCO <суб> 3 буфера при 37 ° С в течение ночи. Трипсин жидкость переносили в чистую пробирку, разбавл ли 100 мкл 60% ацетонитрила /0,1% трифторуксусной кислоты, и обрабатывали ультразвуком в течение 15 мин, три раза. Вся приобретенная жидкость собирают и сушат в вакууме и хранили при -80 ° С. Элюированные пептиды анализировали с использованием Bruker Ultraflex MALDI-TOF /TOF, оснащенный источником Скаутским BGI-Пекин. Результаты масс-спектра были противопоставлены против последовательностей млекопитающих из (без избыточности) базы данных NCBInr для идентификации пептидов массовой дактилоскопии.

Выделение РНК, RT и в режиме реального времени Q PCR
<р> Общая РНК экстрагируют с использованием TRIzol реагента (Invitrogen) в соответствии с протоколом производителя. кДНК синтезируют с помощью обратной транскрипции с использованием 1 мкг тотальной РНК с олиго (дТ) <суб> 18 праймеров и M-MuLV обратной транскриптазы (TAKARA).
<р> Для обратной транскрипции ПЦР, праймеры для NAIF1 и β-актина были следующим образом: NAIF1 смысл, 5'- AGCCACGGTCACCCTGACACA-3 ', и антисмысловая, 5'- CGTGTCTGCATGCTGGGCCAT-3'; бета-актина чувство, 5'- GGGCACGAAGGCTCATCATT-3 'и антисмысловой, 5'- AGCGAGCATCCCCCAAAGTT. Все праймеры были разработаны с использованием NCBI взрыва и приобрести у Sangon, Пекин
. <Р> Количественный ПЦР проводили с помощью набора SYBR Green КПЦР (Takara, Япония) с системой реакции 20 мкл, созданной в соответствии с инструкциями изготовителя. экспрессия гена-мишени анализировали с использованием соответствующих реального времени КПЦР праймеров (таблица 1). β-актин использовали для нормализации. В режиме реального времени КПЦР проводили на ABI7300 амплификатор (ABI, штат Массачусетс, США), со следующими условиями: денатурация в течение 30 сек при 95 ° С, с последующими 40 циклами денатурации в течение 5 с при 95 ° С, и расширение на 31 с при 60 ° С. Плавка анализ кривой проводили в конце для подтверждения специфичности целевого продукта ПЦР. Относительное выражение рассчитывалась с использованием двух стандартных методов кривой. Три независимые образцы были приготовлены для каждого условия, и каждый эксперимент проводили в трех повторностях.

вестерн-блоттинга
<р> Вестерн-блоттинг проводили, как описано ранее. В кратком изложении, 2 × 10 6 клетки собирали с помощью потока среды, осаждали центрифугированием в течение 5 мин при 500 <ЕМ> г
, и 3 раза промывали PBS. Затем клетки лизируют с помощью 100 мкл буфера для лизиса (50 мМ Трис-HCl, рН 7,4, 150 мМ NaCl, 1,5% NP-40, 0,1% SDS и 50 мкг /мл PMSF, со свежеприготовленными добавлением ингибитора протеиназы коктейль) на льду в течение 30 мин. Лизаты центрифугируют при 13000 оборотах в минуту в течение 15 мин. и концентрацию белка измеряли с помощью Брэдфорд методов. Пятьдесят микрограммов белков разделяли на 12% SDS-PAGE и переносили на поливинилидендифторидную мембран. Мембраны блокировали 5% БСА в TBST в течение одного часа при комнатной температуре с последующей инкубацией с растворами первичными антителами в соответствии с инструкциями производителя (β-актина, 1:5000, Sigma; NAIF1, 1:1000, Санта Круз, 14- 3-3 ε, 1:500, Santa Cruz, TCP1-γ, 1:1000, Abcam; TXNRD1, 1:1000, Abcam; CyclinD1, 1:1000, CST; cdc2, 1:500, CST и р21, 1 :500, CST). Мембраны промывали 3 раза TBST, с последующей инкубацией с соответствующими вторичными антителами в течение двух часов при комнатной температуре. Сигналы были обнаружены с использованием системы ЭХЛ хемилюминесценции. β-актин был использован в качестве контроля.

Статистический анализ
<р> Все статистические анализы были проведены с использованием SPSS 13,0 программного обеспечения (SPSS Inc., Чикаго, Иллинойс, США). Данные были выражены как средство ± SD. Т-тест Стьюдента используется для статистического сравнения. Связано значение P &ЛТ;.
0,05 считалась значимой

Результаты

трансфицированных NAIF1 локализованы в ядре

Оба обратной транскрипции ПЦР и Вестерн-блоттинга экспериментов показал, что NAIF1 было минимально выражено в желудочном линий раковых клеток, MKN45, BGC823, AGS и SGC7901; в то время как NAIF1 было легко обнаружить, когда он трансфицировали в клетки (рис. 1А и В). Мы трансфецировали слитый конструкцию NAIF1-GFP в MKN45 и BGC823 клеток и вектор GFP, был использован в качестве контроля. Конфокальной микроскопии показано, что, когда клетки трансфицировали pEGFP-N1-NAIF1 конструкта, зеленая флуоресценция была обнаружена только в ядрах; наоборот, зеленый сигнал flurescent был обнаружен на протяжении всей клетки при трансфекции с GFP вектором (рис. 1в). Те же самые результаты были также отмечены в других клеточных линий, таких как BGC823 (рис S1). Эти результаты подтвердили, что трансфицированные NAIF1 белок локализуется в ядре.

NAIF1 индуцированных арест клеточного цикла в фазе G1 /S
<р> Профиль клеточного цикла клеток рака желудка под действием NAIF1 был исследован следующий. Были проанализированы GFP-положительных клеток для обеспечения правильного населения израсходована (рис S2). Анализ проточной цитометрии показал, что NAIF1 вызвало значительное изменение в распределении клеточного цикла: увеличение популяции клеток в /G1 фазе G0 и уменьшению фазы S наблюдалась в клетках с гиперэкспрессией NAIF1 по сравнению с клетками, трансфицированных пустым вектор, как после трансфекции 24 ч и 48 ч. Как показано на рис. 2А, проточной цитометрии показал, что через 24 ч после трансфекции, примерно 54% ​​от BGC823 клеток, трансфицированных pEGFP-N1 вектора были в фазе G0 /G1, и 34% и 12% клеток были в S фазе и G2 /фазы M, соответственно , С другой стороны, в BGC823 клетки, трансфицированные pEGFP-N1-NAIF1 построить там было определенное увеличение доли клеток в G0 /G1-фазе (74%), а также снижение процента клеток в фазе S (26%) и G2 /M фазе (0%). Через сорок восемь часов после трансфекции, примерно 36% от контрольных клеток BGC823 были в G0 /G1 фазе, и 59% и 5% клеток в S фазе и G2 /M фазе соответственно. В BGC823 клетки, трансфицированные pEGFP-N1-NAIF1 построить, примерно 55% клеток были в G0 /G1 фазе, и 37% и 8% клеток находились в фазе S и /M фазе G2, соответственно. В MKN45 клеток через 24 ч после трансфекции, примерно 56% клеток, трансфицированных вектором pEGFP-N1 были в G0 /G1-фазе, а 29% и 15% клеток были в S фазе и G2 /M фазе, соответственно. Примерно 76% от MKN45 клеток, трансфицированных pEGFP-N1-NAIF1 конструкта были в фазе G0 /G1, а процент клеток в S фазе и G2 /M фазы были снижены до 24% и 0% соответственно. Через сорок восемь часов после трансфекции, примерно 43% от контрольных клеток MKN45 были в G0 /G1-фазе, и 43% и 14% клеток были в S фазе и G2 /M фазе, соответственно. В MKN45 клетки, трансфицированные pEGFP-N1-NAIF1 построить, примерно 56% клеток были в G0 /G1 фазе, и 28% и 16% клеток были в S фазе и G2 /M фазе, соответственно (рис. 2В). Эти результаты ясно показывают, что избыточная экспрессия NAIF1 индуцированной остановки клеточного цикла в G1 /S фазе клеток рака желудка BGC823 и MKN45.
<Р> Чтобы пояснить механизм, с помощью которого NAIF1 индуцированного клеточного цикла, мы рассмотрели возможные роли cyclinD1 , p21 и cdc2 белки, которые играют важную роль в регуляции клеточного цикла в /S фазе G1. Через сорок восемь часов после трансфекции, уровни экспрессии cyclinD1 и cdc2 были снижены по сравнению с контрольными клетками, как в BGC823 и MKN45 клетках. Кроме того, уровни экспрессии p21 были увеличены (рис. 2С).

Сравнительный анализ Протеомные желудочного линии раковых клеток MKN45 с или без дополнительной экспрессии белка NAIF1

Белковые профили MKN45 клетки, трансфицированные pEGFP-N1-NAIF1 конструкций в качестве обработанной группы или с вектором pEGFP-N1 в качестве контрольной группы были измерены с помощью 2-DE 48 ч после трансфекции. В общей сложности, более 700 мест были решены, из которых 11 белков > в 1,5 раза дифференцированно выражены, как определено с помощью анализа с ImageMaster версии 5.0. Дифференциально экспрессируемый белок пятна вырезали из геля, и 8 белки идентифицировали с помощью анализа /TOF MALDI-TOF. Представитель обработанных и контрольных групп карт гель 2-DE показаны на рис. 3А и дифференцированно экспрессируемый белок пятна отмечены. Видимый невооруженным глазом 2-DE гель фотографии каждого из дифференциально экспрессируемых белковых пятен представлены на рис. 3В и 3С. Пять из белков повышающей регуляции в обработанной группе, включающей NADH дегидрогеназы (убихинона) Fe-S белка 1 (NADUSF1), шаперонина содержащий TCP1 субъединицу 3 (TCP1-у), тиоредоксинредуктазы 1 (TXNRD1), протеасомы 26S субъединица 2 ( PSMC2) и протеасомы 26S субъединицей 13 (PSMD13). 3 белки понижающей регуляции, в том числе ингибитора рибонуклеазы 1 (RNH1), 14-3-3 белка эпсилон изоформы (14-3-3 е) и аполипопротеина А-I-связывающего белка (APOAIBP). Таблица 2 изображает конкретную информацию об этих белков и их уровень дифференциального выражения.

Проверка дифференциально выраженные протеины
<р> в режиме реального времени КПЦР и Вестерн-блоттинга были выполнены для проверки 2-DE результаты. уровни экспрессии генов идентифицированных белков были проанализированы в реальном времени кПЦР и согласуются с результатами 2-DE, для одного белка, 14-3-3ε (рис. 4А), за исключением. Три белки были отобраны на основе их значимости и вероятных функций для дальнейшего анализа с помощью Вестерн-блоттинга, чтобы проверить результаты 2-DE. Результаты показывают, что уровни экспрессии белка согласно TXNRD1 и TCP1-gamma были значительно увеличены в группе NAIF1 по сравнению с контрольной группой ( P
≪ 0,05), в то время как уровень экспрессии белка 14-3-3ε была значительно снижена в группе NAIF1 ( P ≪
0,05) (рис 4B.). В целом, западные результаты блот согласуются с результатами 2-DE

Обсуждение
<р> Несколько исследований было проведено, чтобы описать ген NAIF1. Тем не менее, мало известно о Протеомные профиль NAIF1 гиперэкспрессируется. Цель настоящего исследования состояла в том, чтобы обнаружить и идентифицировать белки, чья экспрессия изменяется в клетках MKN45 с гиперэкспрессией NAIF1. Кроме того, доказательства предоставляются объяснить, как NAIF1 функции в индукции апоптоза клеток и других видов деятельности. Стратегия 2-DE была использована в данном исследовании из-за своей удобной методологии и высокой эффективностью. В целом, мы обнаружили и идентифицировали 5 белков, которые были повышающей регуляции и 3 белков, которые были понижающей регуляции в клетках MKN45 с гиперэкспрессией NAIF1 по сравнению с контрольной группой. Выявленные белки включают ряд физиологических действий, таких как разрушение белка, контроль клеточного окислительно-восстановительного гомеостаза, прогрессии клеточного цикла, регуляции цитоскелета, клеточного ответа на стресс, апоптоз и регуляции обмена веществ. Профиль клеточного цикла желудка линий раковых клеток, BGC823 и MKN45 также была исследована, и наши результаты показали, что избыточная экспрессия NAIF1 может вызвать остановку клеточного цикла в G1 /S фазы с помощью изменения уровней экспрессии регуляции клеточного цикла белков cyclinD1, cdc2 и р21 .
<р> Результаты Вестерн-блоттинга и обратной транскрипции ПЦР показал, что NAIF1 было минимально выражено в раковых клетках желудка. Данные, представленные в настоящем документе, аналогично нахождению Ло в тканях [10]. Кроме того, мы подтвердили, что NAIF1 является ядерный белок в желудочном линиях раковых клеток MKN45 и BGC823. Так как геномную ДНК, в основном, в ядре существует, эти данные показывают, что NAIF1 может функционировать в ядре путем взаимодействия с геномной ДНК и нуклеопротеидов для того, чтобы влиять на экспрессию генов и белков, всесторонне. По этой причине мы провели анализ Протеомические исследовать Протеомические профилирование клеток MKN45 с гиперэкспрессией NAIF1.
<Р> Аномальная регуляция клеточного цикла является замечательное свойство раковых клеток [11]. Исследования показали, что многие малые молекулы могут активировать контрольные точки клеточного цикла и вызывает остановку клеточного цикла, которые позволяют клеткам восстановить дефекты. Однако неудачная repairation может привести к апоптозу [12] - [15]. Наши результаты показывают, что NAIF1 индуцирует остановку клеточного цикла в G1 /S фазе. Переход от G1 к фазе S требует активации сборки cyclinD-Cdk4 /6 и циклин-cdc2 (также известный как Cdk1). В то же время, р21 ингибирует активность cdc2 и опосредует сборку и активацию cyclinD-CDK4 /6 в цитоплазме, а также ингибировать их активность в ядре [16]. В этом исследовании, западные блоттинг анализ обнаружил, что уровни экспрессии белка из cyclinD1 и cdc2 снизились, в то время как уровень экспрессии белка р21 был увеличен в клетках с гиперэкспрессией NAIF1. Эти результаты свидетельствуют о том, что G1 /S клеточного цикла, индуцированный NAIF1 опосредовано через р21 и cyclinD1 пути. Кроме того, мы показали, что через 48 ч после трансфекции, популяция апоптотических клеток увеличилась примерно на 10% в клетках с гиперэкспрессией NAIF1 в результате остановки клеточного цикла (рис S3).
<Р> 26S протеасом является консервативным во всех органелл эукариотические клетки и он отвечает за внутриклеточной деградации белка [17]. Белки, которые разлагаются под действием 26S протеасомы участвуют в ряде биологических процессов, включая апоптоз, клеточный цикл, а также роста и регуляции экспрессии многих генов, которые в свою очередь, регулируют другие процессы [18]. Нарушение равновесия деградации белков приводит к возникновению и развитию рака. Таким образом, 26S протеасом является привлекательной мишенью терапии рака. Здесь мы обнаружили, что две субъединицы 26S протеасомы, PSMC2 и PSMD13, оба были повышающей регуляции в клетках MKN45 с гиперэкспрессией NAIF1. PSMC2 и PSMD13 являются субъединицы протеасомы 19S, который является регуляторная частица (РП) протеасомы 26S. PSMC2 является АТФазы в то время как PSMD13 не является АТФазы. Некоторые исследователи полагают, что ингибирование 26S протеасома может привести к апоптозу клеток карциномы, а также ингибиторы протеасом могут быть использованы для лечения рака [19] - [21]. Тем не менее, исследование Tan и др.
Позволяет предположить, что фактор некроза опухоли (ФНО) -α активирует систему протеасомы 26S повышающей регуляции уровней экспрессии 26S субъединиц протеасом [22]. ФНО-α является хорошо известным цитокин, который может индуцировать апоптоз в различных раковых клетках, и в настоящее время он используется в клинике в качестве регионального лечения местно-распространенного сарком мягких тканей и метастазирование меланом, чтобы избежать ампутации конечностей [23]. Как и TNF-alpha, NAIF1 также обладает способностью индуцировать апоптоз, который подразумевает, что 26S протеасомы могут быть вовлечены в процесс апоптоза, индуцированного NAIF1.
<Р> Наши данные также показывают, что два белка, TXNRD1 и NDUFS1, являются вверх регулируется NAIF1. TXNRD1 регулирует окислительно-восстановительное состояние белковых тиолов в клетках млекопитающих, а также функции в поощрение и предотвращении рака в различных видах рака [24] - [27]. Там не было никаких исследований для изучения роли TXNRD1 при раке желудка. По нашему мнению, TXNRD1 может участвовать в подавлении желудочного канцерогенеза или повышающего регулирования TXNRD1 может быть адаптивным механизмом в ответ на окислительный стресс, порожденного избыточная экспрессия NAIF1. Ген NDUFS1 кодирует субъединицу 75 кДа Fe-S, который является одним из семи митохондриальных субъединиц комплекса I [28]. Комплекс I является самым крупным из ферментов дыхательной цепи и дефицит комплекса I является основной причиной ряда врожденных митохондриальных заболеваний, таких как синдром Leigh [29]. Кроме того, 75 кДа-субъединица комплекса I представляет собой субстрат каспазы, который участвует в митохондриальном пути апоптоза. Каспазы расщепление NDUFS1 требуется для нескольких митохондриальных изменений, связанных с апоптозом, включая уровни АТФ, производства ROS и потере целостности мембраны плазмы и так далее [30]. Так как NAIF1 индуцирует апоптоз через митохондриальную пути [8], мы предполагаем, что повышающая регуляция NDUFS1 участвует в процессе апоптоза, индуцированного NAIF1.
<Р> TCP1-γ был идентифицирован как шаперонина в эукариотической цитозоле. Предыдущее исследование показало, что TCP1-γ значительна выражена в опухолях гепатоцеллюлярной карциномы по сравнению с парными смежных доброкачественных опухолевых тканей [31], [32]. Тем не менее, отношения между TCP1-gamma и рака желудка до сих пор неизвестна и требуется дальнейшее исследование.
<Р> С другой стороны, мы идентифицировали три белка, 14-3-3ε, RNH1 и APOAIBP, которые были понижающего регулируется в MKN45 клетках с гиперэкспрессией NAIF1. 14-3-3 представляет собой семейство белок, состоящий из многофункциональных белков, которые связываются с и модулировать функции широкого спектра клеточных белков. Кроме того, они участвуют в различных биологических процессах, в том числе клеточного цикла регулирования контрольной точки, апоптоз и контроль роста клеток [33]. Некоторые исследования показали, что экспрессия 14-3-3ε увеличивается при раке легкого, hepatocelluar рак, рак молочной железы и вульвы плоскоклеточный рак [34] - [37]. Единственным исключением из этого увеличенного 14-3-3ε экспрессии в раковых тканях желудка, где уменьшается выражение [38]. Кроме того, предыдущие исследования показали, что до регуляции 14-3-3ε может предотвратить неприятный запускаемых апоптоз в эндотелиальных клетках [39], и нестероидные противовоспалительные препараты могут вызывать колоректального раковых клеток апоптоз путем подавления 14-3- 3ε выражение [40]. Кроме того, гистопатологические исследование показало, что у 114 больных гепатоцеллюлярной карциномы, повышенная экспрессия 14-3-3ε была в значительной степени связано с высоким риском метастазирования и снижение коэффициента выживаемости [35]. Клеточные эксперименты подтвердили, что увеличение экспрессии 14-3-3ε индуцирует миграцию гепатоцеллюлярной карциномы клеток и способствует эпителиально-мезенхимальных перехода (EMT) путем индукции экспрессии Зеб-1 и улитка [41]. В заключение 14-3-3ε является замечательным онкоген, который участвует в разработке ряда опухолей и играет важную роль в апоптозе и метастазировании. Здесь мы обнаружили, что 14-3-3ε подавляется в MKN45 клетках с гиперэкспрессией NAIF1, предполагая, что 14-3-3ε могут быть вовлечены в процесс апоптоза, индуцированного NAIF1. Кроме того, наши данные следует, что, кроме индукции апоптоза и клеточного цикла, NAIF1 может играть определенную роль в миграции клеток и метастазирование. Наши результаты показывают, что уровни экспрессии белка данного 14-3-3ε уменьшались, в то время как уровни РНК были увеличены. Эти результаты показывают, что NAIF1 регулирует уровни экспрессии 14-3-3ε посттрансляционно. Наши данные, показывающие уровни дифференциальной экспрессии 14-3-3ε противоречат Лил часа [38], что может быть обусловлено различием между клетками и тканями, или может быть связано с уклоном в отборе образца.
<Р> RNH1 является цитозольная белок, который ингибирует РНКазы и образует высоким сродством гетеродимеры с ними играть противоречивую роль в ангиогенеза [42]. Там было увеличение научных исследований с целью изучения взаимосвязи между RNH1 и раком.

• PLoS ONE: эпидермального фактора роста-подобный домен белок, содержащий 7 (EGFL7) Усиливает рецептор ЭФР-AKT сигнализа…
• PLoS ONE: кивок-подобный рецептор Сигнальный Тропинка в хеликобактерной инфекции и связанной с ними Рак желудка:…