PLoS ONE: Padidėjusi atominės apoptozę sukeliančių Factor 1 pakeitė PROTEOMIKOS Profilio žmogaus skrandžio vėžio ląstelių MKN45 ir sukeltas ląstelės ciklo arešto metu G1 /S Phase

Anotacija

Branduolinė apoptozė skatinančius faktorius 1 (NAIF1) buvo pranešta anksčiau sukelti apoptozę. Be to, NAIF1 išraiška buvo reikšmingai mažina reguliuojama žmogaus skrandžio vėžio audinių sritis lyginant su gretimų normaliuose audiniuose. Tačiau, mechanizmas, pagal kurį NAIF1 genas indukuoja apoptozę nėra visiškai suprantama. Mūsų rezultatai rodo, kad NAIF1 buvo minimaliai išreikšti visose tirtų skrandžio vėžio ląstelių linijų. Mūsų duomenys taip pat rodo, kad NAIF1 yra lokalizuota į ląstelių branduolių, kaip aptikti stebint žalią fluorescencija NAIF1-GFP susiliejimo baltymo naudojant fluorescencinės confocal mikroskopu. Be to, lyginamoji PROTEOMIKOS metodas buvo naudojamas siekiant nustatyti diferencinė ekspresija baltymų tarp skrandžio vėžio ląstelių linijų MKN45 /NAIF1 (-) ir MKN45 /NAIF1 (+). Mes nustatėme, penki baltymai (proteosomos 26S subvieneto 2, proteosomos 26S subvieneto 13, NADH dehidrogenazės Fe-S yra baltymas 1, chaperonin, kurių sudėtyje yra TCP1 subvieneto 3 tioredoksino reduktazės 1) kad buvo iki reguliuojama ir trys baltymai (ribonukleazės inhibitorių 1, 14-3- 3 baltymų Epsilon izoformos ir apolipoproteino AI surišantis baltymas), kuris buvo žemyn reglamentuojamos MKN45 ląstelių ekspresija NAIF1. Mes taip pat atrado, kad NAIF1 gali sukelti ląstelių ciklo suėmimą tuo G1 /S fazėje keičia ląstelės ciklo baltymus cyclinD1, cdc2 ir p21 išraiška. Į skirtingai išreikšti baltymai čia nustatyti yra susiję su įvairių mobiliojo ryšio programas, kuriose dalyvauja ląstelių ciklą, apoptozę ir signalo perdavimo reguliavimą ir siūlome NAIF1 gali būti auglys slopintuvas skrandžio vėžio. Mūsų tyrimas pateikia įrodymų, kad nušviečia tai, kaip NAIF1 funkcijų vaidmenį skrandžio vėžio

nurodomoji dalis:. Jonas, M, Zhong J Zhao M Wang J Gu Y juanis X et al., (2014) Padidėjusi atominės apoptozę sukeliančių Factor 1 pakeitė PROTEOMIKOS Profilio žmogaus skrandžio vėžio ląstelių MKN45 ir sukeltas ląstelės ciklo arešto metu G1 /S fazės. PLoS ONE 9 (6): e100216. Doi: 10,1371 /journal.pone.0100216

redaktorius: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesu ", Italija

Įstojo: spalio 27, 2013; Priimta 23 Gegužė 2014 m Paskelbta birželio 13?, 2014

Visos teisės saugomos: © 2014 Yang et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Šis tyrimas parėmė Nacionalinės Pagrindiniai pagrindinių mokslinių tyrimų programą Kinijos (2007CB914700). Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

Skrandžio vėžys yra viena iš labiausiai paplitusių piktybinių navikų pasaulyje sukelia maždaug 8% ir 10% metinių vėžio atvejų ir mirčių, atitinkamai. Pagal pasaulinę epidemiją ataskaitos Pasaulio sveikatos organizacijos, beveik vienas milijonas skrandžio vėžio atvejai ir 738,000 mirčių Apskaičiuota, kad įvyko 2008 m [1], [2]. Daug pastangų buvo imtasi klinikiniu; Tačiau, skrandžio vėžiu sergantiems pacientams mirtingumo yra vis dar toks didelis, kaip 70% [2]. Viena iš priežasčių šio didelio mirtingumo yra tai, kad skrandžio vėžiu sergantiems pacientams dažnai nėra diagnozuota iki vėlyvos stadijos, kuri yra per vėlu teikti veiksmingą gydymą. Taigi, yra akivaizdu, reikia rasti naujų biologinių žymenų ir veiksmingas strategijas ankstyvo diagnozavimo ir gydymo skrandžio vėžio.

Proteomika buvo naudojamas daugelyje mokslinių tyrimų sričių, įskaitant vėžio tyrimams. Bendros mėginiai PROTEOMIKOS analizės vėžio tyrimų centro audinių ir kraujo iš vėžiu sergantiems pacientams, taip pat vėžio ląstelių linijos su skirtingais sluoksnių arba įvairių gydymo [3] - [6]. Šie proteominiai analizė buvo naudojama tiriant atsiradimu ir plėtra vėžio arba ieškoti diagnostikos biologinius žymenis. Rezultatai mes gauti per proteominius metodų yra ne tik tiesioginės reguliavimo transkripcijos lygmens dėl, bet taip pat atspindi potransliacinis modifikacijas baltymų [3], [7]. Taigi, mes galime ištirti ir išraišką ir reguliavimo baltymų su proteominius analizės. Nepaisant daug naujų gamybos būdų, 2-dimensijų elektroforezės kartu su masių spektrometrija išliko labiausiai naudojamas metodas PROTEOMIKOS analizė.

Žmogaus geno, koduojančio atominės apoptozė skatinančius faktorius 1 (NAIF1) yra ant chromosomų 9q34.11 , NAIF1 koduoja baltymą, su -myb
-kaip domeno jo N gale-terminalas regione [8], [9]. Ankstesni tyrimai parodė, kad NAIF1 raiška Naudojant žmogaus vėžio ląstelių linijų HeLa ir MKN45 indukuoja apoptozę [8], [10]. . Be to, Lo, ir kt
nustatė, kad NAIF1 žymiai išreikštas įprastais skrandžio audinio, o jo išraiška žemyn reguliuojama arba prarasti skrandžio vėžio audiniuose ( P <
0,001). Be to, NAIF1 išraiška buvo didesnis gerai diferencijuoti ( P
= 0,004) nei moderately- ar blogai diferencijuotu skrandžio vėžio [10]. Tačiau NAIF1 vaidmuo reguliuojant ląstelių baltymo ekspresija profilį nežinoma.

Šiame tyrime mes dirbo proteo technologiją remiantis 2-dimensional elektroforezės kartu su MALDI-TOF masės spektrometrija nustatyti baltymų, susijusių su biologiniai funkcijos NAIF1. Baltymų ekspresijos profilius skrandžio vėžio ląstelių linija, MKN45 su NAIF1 raiškos ar be buvo analizuojami ir lyginami naudojant 24 cm pH 3-10 NL klasės imobilizuota, pH gradientas (VVG) juostelėmis. Patvirtinti šiuos duomenis, mes matuojamas RNR ekspresijos lygi visų skirtingai baltymą ir trys baltymai buvo patikrinta pagal Imunoblotingo. Mūsų rezultatai rodo, kad NAIF1 skatina ląstelių ciklo suėmimą tuo G1 /S fazėje, reguliuojant ekspresijos lygį cyclinD1, cdc2 ir p21 baltymų. Mūsų tyrimo rezultatai gali lemti geresnį supratimą apie tai, kaip NAIF1 dirba skatinančius apoptozę ir taip pat gali nušviesti diagnozės ir gydymo skrandžio vėžio ateityje.

Medžiagos ir metodai

ląstelių kultūros ir transfekcija

Žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linijas MKN45, BGC823, AGS ir SGC7901 buvo gauti iš naviko ląstelių bankas Kinijos Akademinės medicinos mokslų ir kultūringas skystame Dulbecco minimali pagrindinė terpė (DMEM) papildytas 10% šilumos-inaktyvuota vaisiaus jaučio serumo (FBS), 100 TV /ml penicilino, 100 mikrogramų /ml streptomicino 37 ° C temperatūroje drėgnoje 5% CO _{2 atmosferos. DNR transfekcija atlikta naudojant rentgeno tremeGENE "HP DNR transfekcijq reagentą (Roche, Šveicarija), pagal gamintojo instrukcijas.}

Expression plazmidės

plazmidės pEGFP-N1-NAIF1, kuris išreiškia NAIF1-GFP sulietas baltymas, ir pEGFP-N1, kuris išreiškia žalia fluorescencinis baltymas (GFP), buvo maloniai pateikė dr Čing Luo [10].

Mobilusis ciklas paskirstymo analizė

auga eksponentiškai ląstelės buvo transfekuota pEGFP-N1 vektoriaus arba pEGFP-N1-NAIF1 plazmidės. Ląstelės buvo surinktos po 24 h arba 48 valandas po transfekciją, ir 1 × 10 ^{6 ląstelės buvo plaunama du kartus fosfato-buferio druskų tirpalo (PBS) ir fiksuojami su 4% paraformaldehido, esant 4 ° C temperatūroje 1 val. Taip centrifuguojant, kad ląstelių granulės buvo resuspenduotas dažymo tirpalo (0,05 mg /ml propidiumo jodidas (PI),, 0,2 mg /ml RNazės, ir 0,1% Triton X-100), esant 4 ° C temperatūroje 15 min, tamsoje. Tėkmės citometrijos analizės GFP ir VšĮ atlikta naudojant BD LSR II ląstelių analizatorius (BD, San Chosė, CA, JAV). VšĮ fluorescencija buvo matuojamas tarp GFP teigiamą ląstelių populiacijos ir ląstelės ciklais skirstiniai buvo analizuojami naudojant ModFit LT3.2 programinę įrangą. Trys atskiri mėginiai buvo parengta ir visi tyrimai buvo atliekami tris kartus.}

kiekybinis apoptozė pervežimas

kiekybinis apoptozės atlikta naudojant PE aneksinu apoptozę nustatymo rinkinys I (BD). Trumpai tariant, BGC823 arba MKN45 ląstelės buvo pernešta su pEGFP-N1 vektoriaus arba pEGFP-N1-NAIF1 plazmidės. Po 24 h arba 48 valandas po transfekciją, ląstelės buvo surinktos, išplautos su šaltu PBS du kartus ir tada iš naujo sustabdomas privalomas buferio (10 mM Hepes /NaOH (pH 7,4), 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl _{2) , Grįžtamojo-sustabdytas ląstelės buvo inkubuojamos su fikoeritrinas (PE) konjuguoto ir prie aneksino V (AV) ir 7-amino-aktinomicinas (7-AAD), ir tada matuojamas tėkmės citometrijos naudojant BD LSR II ląstelių analizatorius. Keturi skirtingi ląstelių populiacijos gali būti aptikta dot-sklypas: negyvybingų ląstelių (AV ^{- /7-AAD -), ankstyvojo etapo Apoptozinės ląstelės (AV + /7-AAD - ), vėlai fazės Apoptozinės ląstelės (AV + /7-AAD +) ir nekroziniai ląstelės (AV - /7-AAD +). A 10.000 GFP teigiamų ląstelių minimalus buvo skaičiuojami už imtyje ir duomenų buvo pranešta kaip apoptozinių ląstelių (procentais A. + /7-AAD - AV + /7-AAD + ) tarp visų ląstelių. Trys nepriklausomi mėginys buvo rengiamasi ir visi tyrimai buvo pakartoti tris kartus.}}

Confocal nuskaitymo

Keturiasdešimt aštuonias valandas po transfekcijq ląstelės buvo plaunami PBS ir pritvirtinamas 4% paraformaldehido už 15 minutės. kambario temperatūroje. Siekiant pagerinti ląstelės membranos pralaidumą, ląstelės buvo inkubuojamos su 0,5% Triton X-100, po to inkubacijos su 4 ', 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) į dėmių branduolius. Mobilieji platinimas NAIF1 buvo analizuojama stebint žalią fluorescenciją iš NAIF1-GFP susiliejimo baltymo naudojant Leica Microsystems Heidelberg GmbH mikroskopu.

Baltymai pasirengimas 2-DE

Kiekvienam mėginiui 5 × 10 ^{6 ląstelės buvo renkami ir lizinamų 1 ml lizės buferiniame tirpale (7 M karbamido, 2M tiokarbamido, 2% žandikauliais, 20 mM DL ditiotreitolio (DTT), 1 mM phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF), 30 mM natrio fluoridas, ir 0,25 mg /ml RNaseA) 1 valandą, o kambario temperatūroje, o po to centrifuguojami, esant 4 ° C temperatūroje 30 min. 12000 rpm. Virš nuosėdų buvo perkeltas į naują mėgintuvėlį ir koncentruota, 0,1 M NH _{4COOH. Lizės buferio buvo įtraukta į galutinį tūrį 800 ml, ir baltymų koncentracija buvo nustatoma naudojant Bradford tyrimą (Tiangen, Pekinas, Kinija).}}

Dvimatis elektroforezės

Dvimatis elektroforezės buvo atliktas kaip buvo aprašyta anksčiau [5]. Trumpai tariant, 1 mg baltymų buvo praskiestas iki 450 pL su rehidratavimo buferiniu tirpalu (7 M karbamido, 2 M tiokarbamido, 2% CHAPS, ir 20 mM DTT). VVG juostos (IPG, 24 cm, pH 3-10, NL, "GE limitas.) Buvo rehidrataciją su rehidrataciją mėginių 18 valandų kambario temperatūroje. Baltymai buvo atliktas izoelektrinio fokusavimo su Ettan IPGphorIII (Ge, CT, JAV) iš eilės 1 val 100 prieš, 1 h esant 250 V, 1 h esant 500 V, 1 h esant 1000 V, 1 h esant 3000 V, 1 h 5000 V, 2 val 8000 V ir 6 h 8000 V gauti 80 KVH viso. Po izoelektrinio fokusavimo, IPG juostelės buvo išlyginama ekvilibruoti buferio I (6 M karbamido, 150 mmol Tris-HCl, (pH 8,8), 30% glicerolis, 2% SDS, 1% DTT) 15 min. po kurio seka antras inkubacijos su kitu pusiausviroji buferio II (6 M karbamido, 150 mmol Tris-HCl, (pH 8,8), 30% glicerolis, 2% SDS, 2,5% iodoacetamide) 15 min. Antras aspektas SDS-PAGE buvo atliktas su 12,5% SDS-PAGE gelyje naudojant Ettan Dalt ŠEŠIOS vertikalias sistemas (GE).

Gelis dažymo ir vaizdų analizės

SDS-PAGE geliai buvo nustatyta, nustatančio-buferio (10% CH _{3COOH, 40%, C 2H 5OH, o 50% DDH 2O) 30 min. Tuomet geliai buvo plaunami DDH 2O 10 min. 3 kartus ir tamsintas su Coomassie mėlyna G-250.}

geliai buvo nuskaitomi su skaitytuvas naudojant MagicScan programinę įrangą įvertinti vietoje modelius. Imagemaster platinos programinė įranga (versija 5.0) dirbo analizuoti gelio vaizdų. Dėmės, kurios buvo stebėtas po tiek kontrolės gelio ir NAIF1 gelio buvo analizuojami ir kiekvienos dėmės intensyvumas buvo įvertintas, apskaičiuojant vietoje tūris po normalizuoti gelio atvaizdas. Kiekybinė analizė gelio vaizdų (trys lygiagretūs /mėginys) buvo paimti ir dėmės statistiškai reikšmingai skiriasi (t-testas, * P
< 0,05). Buvo pašalintų ir suardomas identifikuoti

Baltymų identifications

skirtingai išreiškiama baltymų dėmės buvo paimti ir panaikinti tamsintas 50 mM NH _{4HCO 3 /acetonitrilo (50/50) ir džiovinamas vakuuminėje centrifuguojant. Po to šis gelis vienetų buvo suardomas su 10 ng /ml tripsino (Promega, WI, JAV) 50 mM NH 4HCO 3 buferį 37 ° C temperatūroje per naktį. Tripsinas skystis buvo perkeltas į švarų mėgintuvėlį, atskiestas 100 mikrol, 60% acetonitrilo /0,1% trifluoracto rūgštimi, ir apdorojimo ultragarsu 15 min, tris kartus. Visi įgytos skystis buvo surinkti ir vakuuminiu būdu išdžiovintas ir saugomi -80 ° C temperatūroje. Išplautos peptidai buvo analizuojami naudojant Brukher ULTRAFLEX MALDI-TOF /TOF įrengtas su SCOUT šaltinio iki BGI-Pekinas. Masinės spektro rezultatai buvo priešinama su žinduolių sekų iš NCBInr (ne nereikalingas) duomenų bazė peptidų masinio pirštų atspaudų identifikavimo.}

RNR išskyrimas, RT ir Realaus laiko PGR Klausimas

Viso RNR buvo išgauti naudojant TRIzol reagento (Invitrogen) pagal gamintojo protokolą. kDNR buvo susintetintas atvirkštinės transkripcijos naudojant 1 mikrogramų RNR su oligo (dT) _{18 gruntai ir "M-MuLV atvirkštinės transkriptazės (TAKARA).}

atvirkštinės transkripcijos PGR, gruntai NAIF1 ir β-aktino buvo taip: NAIF1 jausmas, 5'-AGCCACGGTCACCCTGACACA-3 ", ir anti-jausmas, 5'-CGTGTCTGCATGCTGGGCCAT-3"; beta-aktino jausmas, 5'-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3 ", ir anti-jausmas, 5'-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT. Visi gruntai buvo sukurta, naudojant ncbi sprogimo ir perkamos iš Sangon, Pekinas.

kiekybine PGR buvo atliekama su SYBR Žalioji qPCR Kit (TAKARA, Japonija) su 20 iL reakcijos sistema, sukurta pagal gamintojo instrukcijas. Tikslinė genų ekspresijos buvo analizuojami naudojant tinkamus realaus laiko qPCR pradmenis (1 lentelė). β-aktino buvo naudojamas normalizuoti. Realaus laiko qPCR buvo atliktas ant ABI7300 Jutiklis ciklų (ABI, MA, JAV) šias sąlygas: denatūruoti 30 s, esant 95 ° C, o po 40 ciklų denatūravimo 5 s, esant 95 ° C, o pratęsimas 31 s esant 60 ° C temperatūroje. Lydymosi kreivė analizė buvo atlikta pabaigoje patvirtinti laukiamo PGR produkto specifiškumą. Santykinis išraiška buvo apskaičiuojamas naudojant dvi standartinė kreivė metodus. Trys nepriklausomi mėginiai buvo paruošti kiekvienai ligai gydyti ir kiekvienas eksperimentas buvo pakartotas tris kartus.

Imunoblotingo

imunoblotingu buvo atliktas kaip buvo aprašyta anksčiau. Trumpai, 2 × 10 ^{6 Ląstelės buvo surinktos su terpės srautą, žirnelius centrifuguojant 5 min, esant 500 "g
, ir plaunamas 3 kartus su PBS. Po to ląstelės buvo lizuojamos 100 pL lizės buferiniame tirpale (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1,5% NP-40, 0,1% SDS, ir 50 g /ml PMSF su šviežiai pridėtinės proteinazės inhibitorių kokteilio) ant ledo 30 min. Lizatai centrifuguojamas 13,000 apsisukimų per minutę 15 min. ir baltymo koncentracija buvo matuojamas naudojant Bradford metodus. Penkiasdešimt mikrogramų baltymai buvo atskirta nuo 12% SDS-PAGE ir perkelti į polivinilideno difluoridą membranas. Membranos buvo užblokuotas su 5% BSA TBST vieną valandą kambario temperatūroje, po inkubacijos su pirminiais antikūnais sprendimai pagal gamintojo nurodymus (β-aktino, 1:5000, Sigma; NAIF1, 1:1000, Santa Cruz; 14- 3-3 ε, 1:500, Santa Cruz; TCP1-γ, 1:1000, Abcam; TXNRD1, 1:1000, Abcam; CyclinD1, 1:1000 CST; cdc2, 1:500 CST ir P21, 1 :500 CST). Membranos buvo plaunamos 3 kartus su TBST, o po to inkubacijos su atitinkamais antrinių antikūnų dvi valandas kambario temperatūroje. Signalai buvo aptikta naudojant ECL cheminės liuminescencijos sistemą. β-aktino dirbo kaip kontroliuoti.}

Statistinė analizė

Visi statistinės analizės buvo atlikta naudojant SPSS 13.0 programinę įrangą (SPSS Inc., Chicago, IL, JAV). Duomenys buvo išreikštas reiškia ± SD. Studento T-testas buvo naudojamas statistinės palyginimui. Asocijuota vertė P <.
0,05 buvo laikomas reikšminga

Rezultatai

Transfekuoti NAIF1 lokalizuotas branduolio

Ir atvirkštinės transkripcijos PGR ir Imunoblotingo eksperimentų parodė, kad NAIF1 buvo minimaliai išreikšti skrandžio vėžio ląstelių linijų, MKN45, BGC823, AGS, ir SGC7901; kadangi NAIF1 buvo lengvai aptikti, kai jis buvo transfekuota į ląsteles (pav. 1A ir B). Mes perkeltų į NAIF1-GFP sintezės statyti į MKN45 ir BGC823 ląstelių ir GFP vektorius buvo naudojamas kaip kontroliuoti. Confocal mikroskopija parodė, kad kai ląstelės buvo pernešta su pEGFP-N1-NAIF1 konstruktą, žalia fluorescencija buvo aptiktas tik branduoliuose; priešingai, žalią flurescent signalas buvo aptikta per visą ląstelių, kai transfekuota su GFP vektoriaus (pav. 1c). Tie patys rezultatai, taip pat pastebėtas kitų ląstelių linijų, pavyzdžiui, BGC823 (S1 pav). Šie duomenys patvirtina, kad Transfekuoti NAIF1 baltymų yra lokalizuota į branduolį.

NAIF1 sukeltas ląstelės ciklo arešto metu G1 /S fazėje

Tirta ląstelės ciklo aprašymą skrandžio vėžio ląsteles pagal NAIF1 poveikio Kitas. buvo analizuojami GFP-teigiamomis ląstelėmis, siekiant užtikrinti teisingą populiaciją buvo naudojamas (S2 pav). Tėkmės citometrijos analizė parodė, kad NAIF1 sukėlė didelį pokytį ląstelės ciklo paskirstymo je: ląstelių populiacijos G0 /G1 fazės ir į S fazę sumažėjo augo ląstelių ekspresija NAIF1 palyginti su ląstelėmis transfektuotose tuščias vektorius, tiek po transfekcijos 24 h ir 48 h. Kaip parodyta paveiksle. 2A, tėkmės citometrijos atskleidė, kad 24 val po transfekcija, maždaug 54% BGC823 ląstelių transfektuotose pEGFP-N1 vektorius buvo į G0 /G1 fazės ir 34% ir 12% ląstelių buvo S fazėje ir G2 /M fazėje atitinkamai , Kita vertus, į BGC823 ląstelės transfekuotos su pEGFP-N1-NAIF1 statyti ten buvo neabejotinas padidėjimas nuo elementų G0 /G1 fazės (74%) procentiniu dydžiu, taip pat į ląstelių procentais S etapo sumažėjimas (26%) ir G2 /M etapas (0%). Keturiasdešimt aštuonias valandas rašyti transfekcija, maždaug 36% iš BGC823 kontrolinių ląstelių buvo G0 /G1 fazės ir 59% ir 5% ląstelių yra S fazėje ir G2 /M fazėje atitinkamai. Į BGC823 ląstelės transfekuotos su pEGFP-N1-NAIF1 statyti, maždaug 55% ląstelių buvo į G0 /G1 fazės, ir 37% ir 8% ląstelių buvo į S fazę ir G2 /M etapo, atitinkamai. Į MKN45 ląstelių, 24 val po transfekciją, maždaug nuo 56% ląstelių, transfekuotų su pEGFP-N1 vektoriaus buvo į G0 /G1 fazės, ir 29% ir 15% ląstelių buvo į S fazę ir G2 /M etapo, atitinkamai. Maždaug 76% MKN45 ląstelių, į kurias įvesti pEGFP-N1-NAIF1 konstruktas buvo G0 /G1 fazės, o ląstelių S fazėje ir G2 procentai /M etapas buvo sumažėjęs iki 24% ir 0% atitinkamai. Keturiasdešimt aštuonias valandas po transfekciją, maždaug 43% MKN45 kontrolinių ląstelių buvo G0 /G1 fazės ir 43% ir 14% ląstelių buvo S fazėje ir G2 /M fazėje, atitinkamai. Į MKN45 ląstelės transfekuotos su pEGFP-N1-NAIF1 statyti, maždaug nuo 56% ląstelių buvo į G0 /G1 fazės, ir 28% ir 16% ląstelių buvo į S fazę ir G2 /M etapo, atitinkamai (2b pav.). Šie rezultatai aiškiai rodo, kad padidėjusią NAIF1 sukelto ląstelių ciklo suėmimo metu G1 /S "etapas skrandžio vėžio ląstelių BGC823 ir MKN45.

Jei paaiškinti mechanizmą, pagal kurį NAIF1 sukelto ląstelių ciklo suėmimą, mes išnagrinėjo galimus vaidmenis cyclinD1 , p21 ir cdc2 baltymai, kurie yra svarbūs ląstelių ciklo reguliavimo G1 /S fazėje. Keturiasdešimt aštuonias valandas po transfekciją, ekspresijos lygis cyclinD1 ir cdc2 sumažėjo, palyginti su kontrolinių ląstelių, tiek BGC823 ir MKN45 ląsteles. Be to, ekspresijos lygis p21 buvo padidintos (2C pav.).

Lyginamoji PROTEOMIKOS analizė skrandžio vėžio ląstelių linijos MKN45 su arba be papildomų išraiškos NAIF1 baltymų

baltymų profiliai MKN45 ląstelės transfekuotos su pEGFP-N1-NAIF1 konstruoja kaip gydytoje grupėje arba su pEGFP-N1 vektoriumi kontrolinė grupė buvo išmatuotas 2-DE 48 h po transfekciją. Iš viso, daugiau nei 700 dėmės buvo išspręstas, iš kurių 11 baltymai buvo > 1,5 kartų atskirtinai išreikštas nustatoma analizės būdu, su Imagemaster versija 5.0. Kad skirtingai ekspresuoto baltymo dėmės buvo pašalintų iš gelio, ir 8 baltymai buvo žymimas MALDI-TOF /TOF analizės. Atstovas tiriamoji ir kontrolinė grupė 2-DE gelio žemėlapiai pavaizduota. 3A ir diferencijuotai išreikšti baltymų dėmės yra pažymėtos. Padidintas 2-DE gelio Nuotraukos kiekviena skirtingai išreikštas baltymų dėmės yra atstovaujama paveiksle. 3B ir 3C. Penki baltymų buvo iki reguliuojama apdorotame grupės, įskaitant NADH dehidrogenazės (ubichinonas) Fe S baltymo 1 (NADUSF1), chaperonin, kurių sudėtyje yra TCP1 subvieneto 3 (TCP1-gama), tioredoksino reduktazės 1 (TXNRD1), proteasomos 26S subvieneto 2 ( PSMC2) ir proteosomos 26S subvieneto 13 (PSMD13). 3 baltymai buvo žemyn reguliuojama, įskaitant ribonucleazės inhibitoriaus 1 (RNH1), 14-3-3 baltymų epsilon izoformos (14-3-3 ε) ir apolipoproteino A-I privalomu baltymų (APOAIBP). 2 lentelė vaizduoja konkrečią informaciją apie šių baltymų ir jų lygį diferencinė ekspresija.

įteisinimas skirtingai išreikšti baltymai

Realaus laiko qPCR ir imunoblotingu buvo atliekama siekiant patikrinti 2-DE rezultatus. Genų ekspresijos lygis nustatytų baltymų buvo analizuojami realiuoju laiku qPCR ir yra suderinamas su 2-DE rezultatus, išskyrus vieną baltymų, 14-3-3ε (pav. 4A). Trys baltymai buvo atrinkti remiantis jų svarba ir galimų funkcijų tolimesnei analizei Imunoblotingo būtų patikrinti 2-DE rezultatus. Rezultatai rodo, kad baltymų ekspresijos lygis TXNRD1 ir TCP1-gama buvo žymiai padidėjo NAIF1 grupėje, lyginant su kontroline grupe ( P
< 0,05), o baltymų ekspresijos lygis 14-3-3ε buvo reikšmingai sumažėjo NAIF1 grupės ( "P <
0,05) (4B pav.). Apskritai, Vakarų dėmė rezultatai atitinka 2-DE rezultatai

Diskusijos

buvo atliekama siekiant apibūdinti NAIF1 geną Keli tyrimai.; Tačiau mažai žinoma apie PROTEOMIKOS aprašymą NAIF1 ekspresija. Šio tyrimo tikslas buvo nustatyti ir identifikuoti baltymus, kurių išraiška pasikeitė MKN45 ląstelių ekspresija NAIF1. Be to, pateikiami įrodymai, paaiškinti, kaip NAIF1 funkcijas skatinančius ląstelių apoptozę ir kitą veiklą. A 2-DE strategija dirbo šiame tyrime dėl savo nuostabia metodika ir aukštas efektyvumas. Iš viso, mes aptikti ir identifikuoti 5 baltymus, kurie buvo iki reglamentuotas ir 3 baltymus, kurie buvo žemyn reglamentuojamas MKN45 ląstelių ekspresija NAIF1 palyginti su kontroline grupe. Nustatyti baltymų įtraukti fiziologinių veiklos, pavyzdžiui, baltymų skilimo, kontrolės ląstelių redokso homeostazės, ląstelės ciklo progresavimo, citoskeleto reguliavimas, ląstelių streso atsakas, apoptozė ir reguliavimo metabolizmas skaičių. Ląstelės ciklo aprašymą skrandžio vėžio ląstelių linijas, BGC823 ir MKN45 taip pat buvo tiriama, ir mūsų rezultatai parodė, kad NAIF1 raiška gali sukelti ląstelių ciklo suėmimą tuo G1 /S fazę per pakeisdamas raiškos lygius ląstelės ciklo reguliavimo baltymų cyclinD1, cdc2 ir p21 .

rezultatai Imunoblotingo ir atvirkštiniai transkripcijos PGR parodė, kad NAIF1 buvo minimaliai išreikšti skrandžio vėžio ląsteles. Čia pateikti duomenys yra analogiškas Luo išvada audiniuose [10]. Be to, mes patvirtino, kad NAIF1 yra branduolinė baltymų skrandžio vėžio ląstelių linijų MKN45 ir BGC823. Nuo genominės DNR daugiausia egzistuoja branduolio, tai duomenys rodo, kad NAIF1 gali funkcionuoti branduolio sąveikaujant su genominės DNR ir nukleoproteino tam, kad turėtų įtakos genų ir baltymų ekspresiją visapusiškai. Dėl šios priežasties mes atliekame proteo analizę ištirti proteo profiliavimas MKN45 ląstelių ekspresija NAIF1.

Nenormalus reguliavimas ląstelės ciklo yra puikus bruožas vėžinių ląstelių [11]. Tyrimai parodė, kad daug mažų molekulių gali aktyvuoti ląstelės ciklo kontrolės punktuose ir sukelti ląstelių ciklo arešto, kuris leis ląstelių remontas defektus. Tačiau nesėkmingas repairation gali sukelti apoptozę [12] - [15]. Mūsų rezultatai rodo, kad NAIF1 skatina ląstelių ciklo suėmimą tuo G1 /S fazėje. Perėjimas iš G1 į S fazę reikalauja surinkimo cyclinD-Cdk4 /6 ir cyclinE-cdc2 (taip pat žinomas kaip Cdk1) aktyvaciją. Tuo tarpu, p21 slopina cdc2 veiklą ir tarpininkauja surinkimo ir aktyvavimo cyclinD-cdk4 /6 citoplazmoje, taip pat slopina savo veiklą branduolio [16]. Šiame tyrime imunoblotingu analizė nustatė, kad baltymų ekspresijos lygis cyclinD1 ir cdc2 sumažėjo, o baltymų ekspresijos lygis p21 buvo padidintas ląstelių ekspresija NAIF1. Šie rezultatai rodo, kad G1 /S ląstelės ciklo arešto sukeltas NAIF1 tarpininkaujant per p21 ir cyclinD1 keliu. Be to, mes parodė, kad 48 h po transfekciją, kad apoptozinių ląstelių populiacija padidėjo maždaug 10% ląstelių ekspresija NAIF1 kaip ląstelės ciklo arešto rezultatas (S3 pav.)

26S proteosomos yra konservatyvūs Organelės visų eukariotinės ląstelės ir ji yra atsakinga už ląstelės baltymo skilimo [17]. Baltymai, kurie žemina 26S proteasomos dalyvauja biologinių procesų, įskaitant apoptozės, ląstelės ciklo ir augimo bei reguliuojant daugelį genų ekspresiją, kuri, savo ruožtu, reguliuoti kitus procesus [18] serijos. Sutrikimas baltymų skilimo pusiausvyros veda prie atsiradimo ir plėtros vėžio. Tokiu būdu, 26S proteasomos yra patraukli vėžio gydymo taikinys. Čia, mes nustatėme, kad du padaliniai 26S proteasomos, PSMC2 ir PSMD13, abu buvo iki-reguliuojami MKN45 ląstelių ekspresija NAIF1. PSMC2 ir PSMD13 yra subvienetų iš 19s proteasomos, kuri yra reguliavimo dalelių (RP) iš 26S proteasomos. PSMC2 yra ATPazės o PSMD13 yra ne ATPazės. Kai kurie tyrinėtojai manyti, kad 26S proteasomos slopinimo gali sukelti apoptozę karcinomos ląstelių, ir proteasomos inhibitoriai gali būti vartojamas vėžiui gydyti [19] - [21]. Tačiau Tan ir kt., Pervežimas tyrimas rodo, kad naviko nekrozės faktoriaus (TNF) -α aktyvuoja 26S proteosomos sistemą iki reguliavimo ekspresijos lygį 26S proteasomos subvienetų [22]. TNF-α yra gerai žinomas citokinų, kuris gali sukelti apoptozę nuo vėžio ląstelių diapazone, ir dabar jis yra naudojamas klinikoje, kaip regioninės gydymo vietiškai išplitusio minkštųjų audinių sarkomos ir metastazės melanomos, kad būtų išvengta amputacijos galūnių [23]. Kaip TNF-alfa, NAIF1 taip pat turi galimybę sukelti apoptozę, o tai reiškia, kad 26S proteosomos gali būti įtraukti į apoptozė proceso sukeltos NAIF1.

Mūsų duomenys taip pat rodo, kad du baltymai, TXNRD1 ir NDUFS1, yra iki-reguliuojami NAIF1. TXNRD1 reguliuoja redokso būklę baltymų tioliais, žinduolių ląstelių, ir funkcijų tiek skatinti ir užkirsti kelią vėžiui įvairių rūšių karcinomų [24] - [27]. Yra buvę jokių tyrimų ištirti TXNRD1 vaidmenį skrandžio vėžio. Mūsų nuomone, TXNRD1 gali dalyvauti skrandžio vėžio genezę ar up-reguliavimo TXNRD1 slopinimo gali būti pritaikomas mechanizmas reaguojant į oksidacinio streso generuoja Padidėjusi NAIF1. NDUFS1 genas koduoja 75 kDa Fe-S subvieneto, kuri yra vienas iš septynių mitochondrijų subvienetų komplekso aš [28]. Kompleksas I yra didžiausia iš kvėpavimo grandinės fermentų ir trūkumas komplekso I yra pagrindinė priežastis, iš įgimtų mitochondrijų ligų, tokių kaip Leigh sindromas [29] serijos. Be to, 75 kDa subvieneto I komplekso yra kaspazės substratas, kuris yra susijęs su mitochondrijų apoptozės keliu. Kaspazės skaldymas NDUFS1 reikalingas kelių mitochondrijų pokyčius, susijusius su apoptozės, įskaitant ATP lygį, ROS gamybos ir praradimo plazminės membranos vientisumo ir tt [30]. Nuo NAIF1 indukuoja apoptozę per mitochondrijų keliu [8], mes iškėlė hipotezę, kad iki-reguliavimas NDUFS1 dalyvauja apoptozė proceso sukeltos NAIF1.

TCP1-γ buvo identifikuota kaip eukariotinių citozolyje chaperonin. Ankstesni tyrimai parodė, kad TCP1-γ yra reikšmingas išreikštas navikų kepenų ląstelių karcinoma, palyginti su suporuotas gretimų nepiktybinių navikų audiniuose [31], [32]. Tačiau tarp TCP1-gama ir skrandžio vėžio santykiai vis dar nežinoma ir reikia atlikti daugiau tyrimų.

Kita vertus, mes nustatė tris baltymus, 14-3-3ε, RNH1 ir APOAIBP, kad buvo Down reglamentuoja MKN45 ląstelių ekspresija NAIF1. 14-3-3 yra baltymų šeimos susidedanti iš daugiafunkcinių baltymų, kurie jungiasi į ir moduliuoti įvairias ląstelių baltymų funkcijas. Be to, jie dalyvauja įvairių biologinių procesų, įskaitant ląstelių ciklo kontrolės punkto reguliavimo, apoptozės ir ląstelių augimo kontrolės [33]. Keletas tyrimų, pranešė, kad 14-3-3ε išraiška yra didesnė plaučių vėžio, hepatocelluar vėžio, krūties vėžio ir vulvos suragėjusių ląstelių karcinoma [34] - [37]. Vienintelė išimtis iš šios padidėjusios 14-3-3ε išraiška yra skrandžio vėžys audiniuose, kur išraiška sumažėjo [38]. Be to, ankstesni tyrimai parodė, kad iki-reguliavimo 14-3-3ε gali neleisti blogas sukėlė apoptozę endotelio ląstelių [39], ir nesteroidinių priešuždegiminių vaistų gali sukelti storosios žarnos vėžinių ląstelių apoptozę ir slopina 14-3- 3ε išraiška [40]. Be to, histopatologinė tyrimo duomenimis, 114 kepenų ląstelių karcinoma sergantiems pacientams, padidėjusi išraiška 14-3-3ε buvo reikšmingai susijęs su didele rizika metastazių ir sumažėjęs išgyvenimo [35]. Mobilieji eksperimentai patvirtino, kad padidėjo 14-3-3ε išraiška skatina kepenų ląstelių karcinoma ląstelių migraciją ir skatina epitelio-mezenchiminių perėjimą (EMT), sukeldami Zeb-1 ir sraigė išraišką [41]. Galima daryti išvadą, 14-3-3ε yra puikus onkogeno kad dalyvauja kelių auglių vystymąsi ir vaidina svarbų vaidmenį apoptozės ir metastazių. Čia, mes nustatėme, kad 14-3-3ε yra žemyn reguliuojama MKN45 ląstelių ekspresija NAIF1, tai rodo, kad 14-3-3ε gali būti įtraukti į apoptozė proceso sukeltos NAIF1. Be to, mūsų duomenys rodo, kad ne tik sukeliant apoptozę ir ląstelių ciklo arešto, NAIF1 gali vaidinti svarbų vaidmenį ląstelių migracijos ir metastazių. Mūsų rezultatai parodo, kad baltymo ekspresiją lygiai 14-3-3ε buvo sumažėjo, o RNR koncentracija buvo padidinta. Šie rezultatai rodo, kad NAIF1 reguliuoja raiškos lygius 14-3-3ε posttranslationally. Mūsų duomenys rodo, kad skirtumas raiškos lygius 14-3-3ε prieštarauja Leal [38], kuris gali būti dėl to, kad skirtumas tarp ląstelių ir audinių, arba gali būti priskirta į pavyzdį atrankos šališkumo.

RNH1 yra citozolinių baltymas, kuris slopina RNases ir suformuoja didelio afiniteto heterodimerus su jais žaisti prieštaringai vaidmenį angiogenezę [42]. Įvyko moksliniuose tyrimuose padidėjimas ištirti ryšį tarp RNH1 ir vėžio ryšį.

• PLoS ONE: epidermio augimo faktoriaus-panašų domeną, kurių sudėtyje yra baltymų 7 (EGFL7) Pagerina EGF receptoriaus AKT signalizacijos, epitelio-mezenchiminių pereinamuoju laikotarpiu, o metast…
• PLoS ONE: kinkuoti-Kaip receptorių signalizacijos Kelias į Helicobacter pylori infekcija ir susijusios skrandžio vėžys: atvejo ir kontrolės tyrimas ir genų ekspresijos analizė