PLoS One: túltermelése nukleáris apoptózist indukáló faktor 1 Megváltozott a proteomikai Profil humán gyomornyálkahártya Cancer Cell MKN45 és indukált sejtciklusmegállás G1 /S fázis

absztrakt katalógusa

Nukleáris apoptózist indukáló faktor 1 (NAIF1) korábban bejelentett apoptózist indukálni. Ezen kívül, a kifejezés a NAIF1 szignifikánsan down-szabályozott humán gyomorrák szövetek képest szomszédos normál szövetekben. Azonban a mechanizmus, amellyel a NAIF1 gén apoptózist indukál nem teljesen tisztázott. Eredményeink azt mutatják, hogy NAIF1 minimálisan kifejezett összes vizsgált gyomorrák sejtvonalakon. Adataink azt is bizonyítja, hogy NAIF1 lokalizálódik a magok sejtek által felismert nyomon a zöld fluoreszcencia NAIF1-GFP fúziós fehérje fluoreszcens konfokális mikroszkóppal. Ezután egy összehasonlító proteomikai megközelítést alkalmaztunk, hogy azonosítsa a differenciális expresszió fehérjék között gyomor rákos sejtvonalak MKN45 /NAIF1 (-) és MKN45 /NAIF1 (+). Találtunk öt fehérjék (proteaszómagátló 26S alegység 2 proteaszóma 26S alegység 13, NADH dehidrogenáz Fe-S protein 1, chaperon tartalmazó TCP1 alegység a 3. és tioredoxinreduktáz 1), amelyek akár szabályozott és három fehérje (ribonukleáz inhibitor 1, 14-3- 3 fehérje epszilon izoforma és az apolipoprotein AI-kötő fehérje), amelyek lefelé szabályozni a MKN45 túlzottan kifejező sejtek NAIF1. Azt is felfedezték, hogy NAIF1 idézhet sejtciklusmegállás G1 /S fázis változtatásával kifejezése sejtciklus fehérjék cyclinD1 cdc2 és p21. A differenciálisán expresszált fehérjéket azonosítottak ide kapcsolódó különböző sejt érintő programok sejtciklus, az apoptózis, és a jelátvitel szabályozása és azt sugallják, hogy NAIF1 lehet egy tumor szupresszor a gyomorrák. Kutatásunk bizonyítékot szolgáltat arra, hogy megvilágítja a szerepe, hogy hogyan NAIF1 funkciók gyomorrákban.

bevezető hivatkozás: Yang M, Zhong J, Zhao M, Wang J, Gu Y, Yuan X, et al. (2014) túltermelése nukleáris apoptózist indukáló faktor 1 Megváltozott a proteomikai Profil humán gyomornyálkahártya Cancer Cell MKN45 és indukált sejtciklusmegállás G1 /S fázis. PLoS ONE 9 (6): e100216. doi: 10,1371 /journal.pone.0100216 katalógusa

Szerkesztő: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesu, Olaszország katalógusa

Beérkezett: október 27, 2013; Elfogadva: 23. május 2014; Megjelent: június 13, 2014 katalógusa

Copyright: © 2014 Yang et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra. Katalógusa

Forrás: A kutatás támogatta a Nemzeti Key Basic Research Program of China (2007CB914700). A finanszírozók nem volt szerepe a tanulmány tervezés, adatgyűjtés és elemzés, döntés, hogy közzéteszi, vagy a készítmény a kézirat. Katalógusa

Érdekütközés: A szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. Katalógusa

Bevezető

gyomorrák egyik leggyakoribb rosszindulatú daganatok a világon okozó körülbelül 8% és 10% -a az éves rákos megbetegedések és halálesetek, ill. Az egész világra kiterjedő járvány jelentése az Egészségügyi Világszervezet, közel egymillió gyomorrák esetek és 738.000 halálesetet becslések szerint 2008-ban bekövetkezett [1], [2]. Sok erőfeszítést tettek a klinikai; Azonban a mortalitás a gyomor rákos betegek még mindig olyan magas, mint 70% [2]. Ennek egyik oka a magas halálozási arány, hogy gyomorrákos betegek gyakran nem diagnosztizálják, amíg az előrehaladott állapotban, ami túl későn ahhoz, hogy hatékony kezelést. Ezért van egy nyilvánvaló igény van olyan új biológiai markerek és hatékony stratégiák a korai diagnózis és a kezelés a gyomorrák. Katalógusa

proteomikai óta használják számos kutatási területen, beleértve a rákkutatás. Gyakori mintákat proteomikai elemzés Rákkutató közé szövetek és a vér rákos betegek, valamint a rákos sejtvonalak különböző háttérrel vagy különböző kezelések [3] - [6]. Ezek proteomikai analízist végeztünk, hogy vizsgálja meg a keletkezés és a rák kialakulása, illetve keresni diagnosztikai biomarkerek. Az eredmények azt nyert proteomikai módszerek nem csak a miatt közvetlen szabályozása transzkripciós szinten, hanem tükrözik poszt-transzlációs módosítások fehérjék [3], [7]. Ezért tudjuk elemezni mind a véleménynyilvánítás és szabályozása fehérje proteomikai vizsgálatok. Annak ellenére, hogy sok új keletű technikák, 2 dimenziós elektroforézis párosulva tömegspektrometria maradt a leginkább használt módszer proteomikai analízis. Katalógusa

Az emberi gént kódoló nukleáris apoptózist indukáló faktor 1 (NAIF1) kromoszómán található 9q34.11 . NAIF1 fehérjét kódol, egy Myb
-szerű domén az N-terminális régió [8], [9]. Korábbi tanulmányok azt mutatták, hogy overexpressziója NAIF1 humán rákos sejtvonalak HeLa és MKN45 apoptózist indukál [8], [10]. Sőt, Luo et al. Katalógusa megállapította, hogy NAIF1 jelentősen kifejezett normál gyomor szövetben, míg az expressziója alulszabályozott vagy elveszett a gyomorrák szövetekben ( P < katalógusa 0,001). Ezen túlmenően, NAIF1 expresszió nagyobb volt, jól differenciált ( P
= 0,004), mint a moderately- vagy rosszul differenciált gyomorrákban [10]. Azonban, a szerepe NAIF1 szabályozásában celluláris fehérje expressziós profiljának ismeretlen.

A jelen tanulmányban alkalmazott proteomikus technológia alapján 2-dimenziós elektroforézist kombinált MALDI-TOF tömegspektrometria fehérjék azonosítására társított biológiai funkcióit NAIF1. A fehérje expresszióját profilok a gyomorrák sejtvonal MKN45 vagy anélkül NAIF1 overexpressziója elemeztük és hasonlítottuk össze 24 cm pH 3-10 NL tartomány immobilizált pH-gradiens (IPG) csíkokra. Ennek bizonyítására adatokat mértünk RNS expressziós szintjét minden másképp kifejezve fehérjék és három fehérjéket tovább igazoltuk western blot. Eredményeink azt mutatják, hogy NAIF1 sejtciklusleállást a G1 /S fázis szabályozásával expressziós szintjét cyclinD1, a cdc2 és a p21 fehérje. A vizsgálati eredmények azt vezethet jobb megértéséhez, hogyan működik NAIF1 apoptózis előidézésére, valamint fényt deríthet a diagnózis és terápia a gyomorrák kialakulása a jövőben. Katalógusa

Anyagok és módszerek katalógusa

Sejttenyésztés és transzfekció

emberi gyomor rákos sejtvonalak MKN45, BGC823, AGS és SGC7901 kaptuk a tumorsejt Bank of kínai Akadémiai Orvostudományi és tenyésztjük folyékony Dulbecco-féle minimum Essential Medium (DMEM), amelyet 10% hővel inaktivált magzati borjúszérummal (FBS), 100 NE /ml penicillinnel, 100 ug /ml sztreptomicint, 37 ° C-on, nedvesített, 5% CO _{2 atmoszférában. DNS-transzfekció segítségével végeztük az X-tremeGENE HP DNS transzfekciós reagens (Roche, Svájc), a gyártó utasításai szerint.}

expressziós plazmidokat

Az expressziós plazmidok pEGFP-N1-NAIF1, amely expresszál NAIF1-GFP fúziós fehérje, és pEGFP-N1, amely kifejezi a zöld fluoreszcens fehérje (GFP), volt szíves rendelkezésünkre Dr. Qing Luo [10].

sejtciklus eloszlás elemzés

az exponenciálisan növekedő sejteket transzfektáltunk a pEGFP-N1 vektorba vagy a pEGFP-N1-NAIF1 plazmid. A sejteket 24 óra vagy 48 órával a transzfektálás után, és 1 × 10 ^{6 sejteket kétszer mostuk foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS), és rögzítettük 4% paraformaldehidben, 4 ° C-on 1 órán át. Centrifugálás után a sejtüledéket újra szuszpendáljuk festőoldattal (0,05 mg /ml propidium-jodid (PI), 0,2 mg /ml RN-áz, és 0,1% Triton X-100), 4 ° C-on 15 percig sötétben. Áramlási citometria elemzést GFP és a PI végeztünk a BD LSR II sejt analizátorral (BD, San Jose, CA, USA). PI fluoreszcenciáját között a GFP pozitív sejt populáció és a disztribúció a sejtciklus elemeztük ModFit LT3.2 szoftver. Három különböző mintát állítottunk elő, és az összes vizsgálatot három párhuzamosban végeztük.}

számszerűsítése apoptózis

számszerűsítése apoptózis végeztünk PE Annexin V Apoptosis Detection Kit I (BD). Röviden, BGC823 vagy MKN45 sejteket transzfektáltunk a pEGFP-N1 vektorba vagy a pEGFP-N1-NAIF1 plazmid. Miután 24 óra vagy 48 órával a transzfektálás után a sejteket összegyűjtöttük, mostuk hideg PBS-ben kétszer, majd újra szuszpendáljuk kötőpufferrel (10 mM HEPES /NaOH (pH 7,4), 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCI _{2) . Az újraszuszpendált sejteket inkubáltunk fikoeritrinnel (PE) konjugált annexin-V (AV) és a 7-amino-aktinomicin (7-AAD), majd áramlási citometriával a BD LSR II sejt oldalon. Négy különböző sejtpopulációk lehetett kimutatni egy dot-plot: életképes sejtek (AV ^{- /7-AAD -), a korai fázisú apoptotikus sejtek (AV + /7-AAD - ), késői fázisú apoptózis (AV + /7-AAD +), és a nekrotikus sejtek (AV - /7-AAD +). A legalább 10.000 GFP pozitív sejteket megszámoltuk mintánként és az adatokat jelentettek az apoptotikus sejtek százalékát (AV + /7-AAD - és AV + /7-AAD + ) között a teljes sejteket. Három független minta előkészületek történtek, és minden vizsgálatot megismételtük három példányban.}}

Konfokális pásztázó

Negyvennyolc órával a transzfekció, a sejteket háromszor mostuk PBS-sel és fixáltuk 4% paraformaldehid-on 15 min. szobahőmérsékleten. Ahhoz, hogy fokozzák a permeabilitás a sejtmembrán, sejteket inkubáltunk 0,5% Triton X-100, majd inkubáltuk 4 ', 6-diamino-2-fenil-(DAPI), hogy folt a magok. Celluláris megoszlása ​​NAIF1 elemeztük nyomon a zöld fluoreszcencia a NAIF1-GFP fúziós fehérje használatával egy Leica Microsystems Heidelberg GmbH mikroszkóppal.

fehérje készítmény 2-DE

Minden egyes minta esetében az 5 × 10 ^{6 a sejteket összegyűjtöttük és lizáltuk 1 ml lízis pufferben (7 M urea, 2 M tiokarbamid, 2% CHAPS, 20 mM DL-ditiotreitol (DTT), 1 mM fenil-metil-(PMSF), 30 mM nátrium-fluorid, és 0,25 mg /ml RNáz) 1 órán át szobahőmérsékleten, majd centrifugáltuk 4 ° C-on 30 percig. 12.000 rpm. A felülúszót átvittük egy új csőbe, és bepároljuk, 0,1 M NH _{4COOH. Lysis puffert adtunk, hogy a végső térfogat 800 ul, és a fehérje koncentráció alkalmazásával határoztuk meg Bradford vizsgálati eljárás (Tiangen, Peking, Kína).}}

két-dimenziós elektroforézist

két-dimenziós elektroforézist végeztük a korábban leírtak [5]. Röviden, 1 mg fehérje hígítjuk 450 ul-rehidratáló pufferrel (7 M urea, 2 M tiokarbamid, 2% CHAPS, és 20 mM DTT). IPG csíkok (IPG, 24 cm, pH = 3-10, NL, GE Limit.) Adunk rehidrálni a rehidratált mintákat 18 órán át szobahőmérsékleten keverjük. A fehérjéket vetettük alá izoelektromos fókuszálás egy Ettan IPGphorIII (GE, CT, USA), egymást követően 1 órán át 100 V, 1 órán át 250 V, 1 órán át 500 V, 1 óra 1000 V, 1 órán át 3000 V, 1 órán át 5000 V, 2 órán át 8000 V, és 6 órán át 8000 V kap összesen 80 KVH. Miután az izoelektromos fókuszálás, IPG csíkokat ekvilibráltuk ekvilibráló pufferrel I (6 M karbamid, 150 mM Tris-HCl (pH = 8,8), 30% glicerin, 2% SDS, 1% DTT) 15 percig. majd egy második inkubálással másik ekvilibráló pufferrel II (6 M karbamid, 150 mM Tris-HCl (pH = 8,8), 30% glicerin, 2% SDS-t, 2,5% jód-acetamid) 15 percig. A második dimenziója SDS-PAGE-t végeztünk 12,5% SDS-PAGE gélek felhasználásával Ettan DALT hat függőleges rendszerek (GE).

gél festésére és képanalízis

Az SDS-PAGE- géleket fixáltuk rögzítő-pufferben (10% CH _{3COOH, 40% C, 2H 5OH, és 50% DDH 2 O) 30 percig. A géleket ezután mostuk DDH 2O 10 percig. 3-szor, és Coomassie blue G-250. Katalógusa}

A géleket egy szkenner segítségével MagicScan szoftver, hogy értékelje a helyszínen mintákat. ImageMaster platina szoftver (5.0 verzió) alkalmazunk, hogy elemezze a gél képeket. A foltok, amelyek figyeltünk meg mind a kontroll gél és NAIF1 gél elemeztük és az intenzitás minden egyes folt mennyiségileg kiszámításával a helyszínen térfogat után normalizálja a gél képet. Mennyiségi elemzése gél képek (három párhuzamos /minta) vettünk, és foltok statisztikailag szignifikánsan különbség (t-teszt, * p
< 0,05) kimetszettük, és emésztettük azonosításához.

Protein azonosítások

a különböző módon kifejezett fehérje foltokat kivontuk, és nem festődő 50 mM NH _{4HCO 3 /acetonitril (50/50) és a szárított vákuum-centrifugával. A gél darabokat ezután emésztettük 10 ng /ml tripszint (Promega, WI, USA) 50 mM NH 4HCO 3 pufferben 37 ° C-on egy éjszakán át. A tripszint folyadékot átvittük egy tiszta csőbe, hígítjuk 100 pl 60% acetonitril /0,1% trifluor-ecetsav, és kezeltük ultrahanggal 15 percig, háromszor. Minden a megszerzett folyadékot összegyűjtjük, és vákuumban szárítjuk, és -80 ° C-on. Az eluált peptideket analizáltuk Bruker Ultraflex MALDI-TOF /TOF szerelve a SCOUT forrás által BGI-Peking. Az eredmények tömegszéménak került szembe ellen emlős szekvenciák a NCBInr (nem redundáns) adatbázis tömeges peptid ujjlenyomat azonosítás. Katalógusa}

RNS izolálás, RT és a valós idejű PCR Q katalógusa

A teljes RNS volt extraháljuk TRIzol reagens (Invitrogen) alkalmazásával a gyártó protokollja. cDNS-t szintetizálunk reverz transzkripció segítségével 1 ng teljes RNS-t oligo (dT) _{18 primerek és az M-MuLV reverz transzkriptáz (TAKARA).}

A reverz transzkripciós PCR-primerek NAIF1 és β-aktin voltak az alábbiak szerint: NAIF1 értelemben, 5'AGCCACGGTCACCCTGACACA-3 ', és az anti-sense, 5'-CGTGTCTGCATGCTGGGCCAT-3'; p-aktin értelemben, 5'GGGCACGAAGGCTCATCATT-3 ', és az anti-sense, 5'-AGCGAGCATCCCCCAAAGTT. Minden primereket terveztünk alkalmazásával NCBI robbanás és vásárolt Sangon, Beijing.

kvantitatív PCR-t végeztünk a SYBR Green qPCR reagenskészlet (Takara, Japán), 20 ul reakció-rendszer létrehozására, a gyártó utasításai szerint. Célgén expressziójának alkalmazásával analizáltuk megfelelő valós idejű qPCR primereket (1. táblázat). β-aktin használtunk normalizálás. A real-time qPCR végeztünk egy ABI7300 cycler (ABI, MA, USA), a következő feltételek mellett: denaturáció 30 másodpercig 95 ° C hőmérsékleten, majd 40 ciklus követett denaturálással 5 s 95 ° C-on és kiterjesztés 31 s 60 ° C-on. Olvadási görbe vizsgálatot végeztünk a végén, hogy érvényesítse a sajátossága a várt PCR-termék. Relatív expressziós alkalmazásával számítottuk a két standard görbe módszerekkel. Három független mintákat készítettünk minden egyes feltétel, és minden egyes kísérletet három párhuzamosban végeztük.

Western-blot

Western-blot vizsgálatot végeztünk a korábban leírtak. Röviden, 2 × 10 ^{6 sejteket összegyűjtöttük közepes áramlás, centrifugálással ülepítettük 5 percig 500 G katalógusa, és 3-szor mostuk PBS-sel. A sejteket ezután lizáltuk, 100 ul lízispufferben (50 mM Tris-HCI, pH = 7,4, 150 mM NaCi, 1,5% NP-40, 0,1% SDS, és 50 ug /ml PMSF, frissen hozzáadott proteináz inhibitor koktél) jégen 30 percig keverjük. A lizátumokat centrifugáltuk 13.000 rpm-en 15 percig. és a fehérje koncentráció alkalmazásával mértük Bradford módszerekkel. Ötven mikrogramm fehérjét elválasztottuk 12% SDS-PAGE és polivinilidén-difluorid membránokra. A membránokat blokkoltuk 5% BSA-ban TBST egy órán át szobahőmérsékleten majd inkubáltuk primer antitest megoldások szerint a gyártó utasításai (β-aktin, 1:5000, Sigma; NAIF1, 1:1000, Santa Cruz; 14- 3-3 ε, 1:500, santa Cruz, TCP1-γ, 1:1000, ABCAM; TXNRD1, 1:1000, ABCAM; CyclinD1, 1:1000, CST, cdc2, 1:500, CST és p21, 1 :500, CST). A membránokat 3-szor mostuk TBST-vel, majd inkubáltuk a megfelelő másodlagos antitestekkel két órán át szobahőmérsékleten keverjük. A jeleket alkalmazásával detektáltuk az ECL kemilumineszcenciás rendszert. β-aktin dolgozott, mint a kontroll. katalógusa}

Statisztikai elemzés katalógusa

Minden statisztikai analízist az SPSS 13.0 szoftver (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Az adatokat átlag ± SD. A Student-féle t-tesztet használtuk a statisztikai összehasonlítás. Társult értéke P < katalógusa 0,05 értéket tekintettük szignifikánsnak. Katalógusa

Eredmények katalógusa

A transzfektált NAIF1 a sejtmagban katalógusa

Mindkét fordított transzkripciós PCR és Western blot kísérletek Kimutattuk, hogy NAIF1 minimálisan kifejezve gyomor rákos sejtvonalban, a MKN45, BGC823, AGS, és SGC7901; mivel NAIF1 könnyen detektáltunk, amikor transzfektáljuk a sejtekbe (ábra. Az 1A és B). Mi transzfektált egy NAIF1-GFP fúziós építési figyelembe MKN45 és BGC823 sejtek és GFP vektort alkalmaztuk kontrollként. Konfokális mikroszkópos kimutatták, hogy amikor a sejteket transzfektáltuk a pEGFP-N1-NAIF1 konstrukció, zöld fluoreszcenciát kimutatni csak a magok; Éppen ellenkezőleg, a zöld flurescent jelet detektáltunk a teljes sejt amikor transzfektált GFP vektorba (ábra. 1C). Ugyanezt az eredményt is megfigyeltek más sejtvonalakban, például BGC823 (ábra S1). Ezek az eredmények megerősítették, hogy transzfektált NAIF1 fehérje lokalizálódik a sejtmagban.

NAIF1 indukált sejtciklus G1 /S fázis

a sejtciklus profilját gyomorrák-sejtek hatása alatt NAIF1 vizsgáltuk következő. GFP-pozitív sejteket elemezzük, hogy biztosítsák a megfelelő populáció használtunk (ábra S2). Flow citometriás analízis igazolta, hogy NAIF1 indukált jelentős változás a megoszlása ​​a sejtciklus: a növekedés a sejtpopuláció a G0 /G1 fázisban és csökken az S fázisban volt megfigyelhető azokban a sejtekben overexpresszáló NAIF1 összehasonlítva transzfektált sejtek az üres vektor, mind a transzfekció után 24 óra és 48 óra. Ábrán látható. 2A, áramlási citometria során kiderült, hogy 24 órával a transzfektálás után körülbelül 54% -a BGC823 transzfektált sejtek pEGFP-N1 vektorba volt a G0 /G1 fázisban van, és 34% és 12% a sejtek S-fázisban, és a G2 /M fázisban, illetőleg . Másrészt, a BGC823 transzfektált sejtek a pEGFP-N1-NAIF1 konstrukció volt egy határozott arányának növekedését, a sejtek G0 /G1 fázisban (74%), valamint csökkent a sejtek százalékát S fázisban (26%) és a G2 /M fázisban (0%). Negyvennyolc órával a transzfekció után mintegy 36% -a BGC823 kontroll sejtek voltak a G0 /G1 fázisban van, és 59% és 5% a sejtek S-fázisban, és a G2 /M fázisban volt. A BGC823 transzfektált sejtek a pEGFP-N1-NAIF1 építésére, körülbelül 55% -a sejtek a G0 /G1 fázisban van, és 37% és 8% a sejtek S-fázisban, és a G2 /M fázisban, ill. A MKN45 sejtekben, 24 óra A transzfektálás után körülbelül 56% -a transzfektált sejtek a pEGFP-N1 vektorba voltak a G0 /G1 fázisban van, és 29% és 15% -a sejtek S-fázisban, és a G2 /M fázisban, ill. Körülbelül 76% -a MKN45 transzfektált sejtek a pEGFP-N1-NAIF1 konstrukciót voltak a G0 /G1 fázisban, és a százalékos értékek a sejtek az S fázisban, és a G2 /M fázisban 24% -ra csökkent, és 0%, ill. Negyvennyolc órával a transzfekciót követően, mintegy 43% -a a MKN45 kontroll sejtek voltak a G0 /G1 fázisban van, és 43% és 14% a sejtek S-fázisban, és a G2 /M fázisban, ill. A MKN45 transzfektált sejtek a pEGFP-N1-NAIF1 építésére, körülbelül 56% -a sejtek a G0 /G1 fázisban van, és 28% és 16% a sejtek S-fázisban, és a G2 /M fázisban, illetőleg (ábra. 2b). Ezek az eredmények világosan mutatják, hogy túltermelése NAIF1 indukált sejtciklus leállást a G1 /S fázis gyomorrák sejtek BGC823 és MKN45. Katalógusa

tisztázza a mechanizmust, amellyel NAIF1 indukált sejtciklusmegállás megvizsgáltuk a lehetséges szerepei cyclinD1 , p21 és cdc2 fehérjék, amelyek fontos a sejtciklus szabályozásában a G1 /S fázis. Negyvennyolc órával a transzfekciót követően, az expressziós szintek cyclinD1 és cdc2 csökkentették a kontrollhoz képest a sejtek, mind a BGC823 és MKN45 sejteket. Ezenfelül az expressziós szinteket a p21 emelkedtek (ábra. 2C).

Összehasonlító proteomikai elemzés a gyomorrák sejtvonal MKN45 vagy anélkül extra expresszióját NAIF1 fehérje

A fehérje profilok MKN45 transzfektált sejtek a pEGFP-N1-NAIF1 konstrukciók, mint a kezelt csoport vagy a pEGFP-N1 vektorba, mint a kontroll csoportban mértük 2-DE 48 órával a transzfekció után. Összesen több, mint 700 foltok megoldódtak, amelyből 11 volt fehérjék > 1,5-szeres differenciáltan expresszálódó meghatározva elemzés ImageMaster 5.0 verzió. A differenciálisán expresszált fehérje foltokat kivágtuk a gélből, és a 8. fehérjéket azonosítottak MALDI-TOF /TOF elemzés. Reprezentatív kezelt és kontroll csoport 2-DE gél térképeket ábrán mutatjuk be. 3A és eltérően expresszált fehérje foltok vannak jelölve. Megaszkopikus 2-DE gél képek az egyes a differenciálisán expresszált fehérje foltok ábrán látható. 3B és 3C. Öt A fehérjéket felülszabályozott a kezelt csoportban, beleértve a NADH dehidrogenáz (ubikinon) Fe-S protein 1 (NADUSF1), chaperon tartalmazó TCP1 alegység 3 (TCP1-γ), tioredoxin-reduktáz 1 (TXNRD1), proteaszóma 26S alegység 2 ( PSMC2) és proteaszóma 26S alegység 13 (PSMD13). 3 fehérjéket leszabályozott, beleértve ribonukleáz inhibitor 1 (RNH1), 14-3-3 protein epszilon izoforma (14-3-3 ε) és az apolipoprotein A-I fehérje (APOAIBP). 2. táblázatban adott tájékoztatást a fehérjék és szintje eltérő expressziója. Katalógusa

validálása differenciáltan expresszálódó fehérjék

Valós idejű qPCR és western blot végeztünk, hogy ellenőrizze a 2-DE eredményez. Génexpressziós szintjét az azonosított fehérjék elemeztük valós idejű qPCR és összhangban vannak a 2-DE eredmények, kivéve egy fehérje, 14-3-3ε (ábra. 4A). Három fehérjék alapján választották ki azok fontosságát, és valószínűleg funkciók további ki Western blot analízis, hogy ellenőrizze a 2-DE eredményeket. Az eredmények azt mutatják, hogy a fehérje expressziós szintjeit TXNRD1 és TCP1-γ szignifikánsan nőtt a NAIF1 csoportban, mint a kontrollcsoportban ( P
< 0,05), míg a protein expressziós szintjének 14-3-3ε szignifikánsan csökkent a NAIF1 csoport ( P < katalógusa 0,05) (ábra. 4B). Összességében a Western-blot eredmények összhangban vannak a 2-DE eredményez. Katalógusa

Vita katalógusa

Számos vizsgálatot végeztek, hogy leírja a NAIF1 gén; azonban keveset tudunk a proteomikai profil NAIF1 overexpresszálódik. A célja az volt, hogy megvizsgáljuk, és fehérjék azonosítására, melyek expressziója megváltozik MKN45 túlzottan kifejező sejtek NAIF1. Továbbá bizonyíték van arra, hogy elmagyarázza, hogyan NAIF1 funkciók kiváltására sejt apoptózis és egyéb tevékenységek. A 2-DE stratégiát alkalmaztunk ebben a vizsgálatban, mert a kényelmes módszer és nagy hatékonyságú. Összességében, és azonosított 5 fehérjék voltak akár szabályozott és 3 fehérjék, amelyek arra lefelé szabályozni MKN45 sejtekben overexpresszáló NAIF1, mint a kontroll csoportban. Az azonosított fehérjék számos olyan fiziológiai tevékenységek, mint például a protein lebomlást, ellenőrzése sejt redox homeosztázis sejtciklus előrehaladását, citoszkeleton szabályozásának, sejt stresszválasz, apoptózis és anyagcsere szabályozásában. A sejtciklus profilját gyomor rákos sejtvonalak, BGC823 és MKN45 is vizsgáltuk, és a mi eredmények demonstrálták, hogy overexpressziója NAIF1 indukálhat sejtciklus G1 /S fázis keresztül megváltoztatja az expressziós szintek a sejtciklus szabályozásában fehérjék cyclinD1, a cdc2 és a p21 .

Eredmények a western blot és fordított transzkripciós PCR igazolta, hogy NAIF1 minimálisan kifejezett gyomorrák sejtek. Az itt bemutatott adatok analóg Luo megállapítását szövetekben [10]. Sőt, azt megerősítette, hogy NAIF1 egy nukleáris fehérje a gyomor rákos sejtvonalak MKN45 és BGC823. Mivel genomiális DNS főleg létezik a sejtmagban, ez az adat azt sugallja, hogy NAIF1 működhetnek a sejtmagban kölcsönhatásban áll genomiális DNS és nukleoprotein annak érdekében, hogy befolyásolja a gének expresszióját és a fehérjék átfogóan. Emiatt végeztünk proteomikai vizsgálatokat végeztem a proteomikai profilalkotás MKN45 túlzottan kifejező sejtek NAIF1. Katalógusa

rendellenes sejtciklus szabályozásában is figyelemre méltó jellemzője a rákos sejteket. [11] Vizsgálatok kimutatták, hogy sok kis molekulák aktiválhatja a sejtciklus ellenőrző pontokat, és indukálják sejtciklus, amelyek lehetővé teszik a sejtek megjavítani hibák. Azonban sikertelen javíthatatlanul vezethet apoptózist [12] - [15]. Eredményeink azt mutatják, hogy NAIF1 sejtciklusleállást G1 /S fázis. Átmenet a G1-S fázis igényli aktiválását összeszerelése cyclinD-Cdk4 /6 és ciklin-cdc2 (más néven Cdk1). Eközben P21 gátolja a cdc2 és közvetíti összeszerelés és aktiválását cyclinD-CDK4 /6 a citoplazmában, valamint gátolva azok aktivitását a sejtmagban [16]. Ebben a vizsgálatban, Western-blot elemzés észleltük, hogy fehérje expressziós szintjeit cyclinD1 és cdc2 csökkentek, miközben a fehérje expressziós szintjét P21 nőtt sejtekben túltermelő NAIF1. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a G1 /S sejtciklus által indukált NAIF1 közvetíti a p21 és cyclinD1 útvonalon. Ezen túlmenően kimutattuk, hogy 48 órával a transzfekció után, a népesség az apoptotikus sejtek megnövekedett körülbelül 10% a sejtekben overexpresszáló NAIF1 eredményeként sejtciklus (ábra S3).

26S proteaszóma egy konzervatív organellum minden eukarióta sejtek és ez felelős a sejten belüli fehérje lebomlását [17]. Fehérjék, melyek lebomlik 26S proteaszóma vesz részt egy sor biológiai folyamatban, beleértve az apoptózist, a sejtciklusban, és a növekedés és expresszióját szabályozó sok gén, amely viszont szabályozza más eljárások [18]. Zavara fehérje lebomlás egyensúlyi vezet a híváskezdeményezési és a rák kialakulásában. Így 26S proteaszóma egy vonzó rákterápia cél. Itt, azt találtuk, hogy a két alegység a 26S proteaszóma, PSMC2 és PSMD13, mindketten up-szabályozott MKN45 sejtekben túltermelő NAIF1. PSMC2 és PSMD13 alegységei a 19S proteaszóma, amely a szabályozási részecske (RP) az 26S proteaszóma. PSMC2 egy ATPáz míg PSMD13 egy nem-ATPáz. Egyes kutatók úgy vélik, hogy a 26S proteaszóma gátlása vezethet apoptózisát karcinóma sejtek és proteaszóma inhibitorok lehetne használni a rák kezelésére [19] - [21]. Azonban egy tanulmány által Tan et al.
Azt sugallja, hogy a tumor nekrózis faktor (TNF) -α aktiválja a 26S proteaszóma rendszer up-szabályozó expressziós szintjét 26S proteaszóma alegységek [22]. A TNF-α egy jól ismert citokin, amely apoptózist indukál egy sor rákos sejtek, és most már használják a klinikán mint regionális kezelés lokálisan előrehaladott lágyszöveti szarkómák és a metasztázis melanomák, hogy elkerüljék az amputáció végtagok [23]. Mint például TNF-α, NAIF1 is képes apoptózist indukálni, ami azt jelenti, hogy a 26S proteaszóma is be lehet vonni a apoptózis folyamat által indukált NAIF1.

Adataink azt is bizonyítják, hogy két fehérje, TXNRD1 és NDUFS1 vannak up-szabályozott NAIF1. TXNRD1 szabályozza a redox protein tiolok emlős sejtekben, és funkciók mind elősegítése és rák megelőzésére különböző karcinómák [24] - [27]. Nem voltak vizsgálatok, hogy vizsgálja meg a szerepét TXNRD1 gyomorrákban. Véleményünk TXNRD1 részt vehetnek a elnyomása gyomorrák genezis vagy a fel-szabályozása TXNRD1 lehet adaptív mechanizmust, amelyek az oxidatív stressz által generált túltermelése NAIF1. A NDUFS1 gén egy 75 kDa Fe-S alegység, amely egyike a hét mitokondriális alegységei komplex I [28]. Komplex I a legnagyobb a légzési lánc enzimek és hiány komplex I a fő oka egy sor veleszületett mitokondriális betegségek, mint például a Leigh szindróma [29]. Ezen túlmenően, a 75 kDa alegység az összetett I egy kaszpáz szubsztrát, amely részt vesz a mitokondriális apoptózis útvonalon. A kaszpáz hasítása NDUFS1 szükséges több mitokondriális változások kapcsolódó apoptózis, beleértve az ATP szint, ROS-termelés, és a veszteség a plazma membrán integritásának, és így tovább [30]. Mivel NAIF1 apoptózist indukál a mitokondriális út [8], feltételezzük, hogy a fel-regulációja NDUFS1 vesz részt a apoptózis folyamat által indukált NAIF1.

TCP1-γ azonosították egy chaperon eukarióta citoszolba. Korábbi kutatások kimutatták, hogy TCP1-γ van jelentős kifejezve daganatok hepatocellularis carcinoma képest a párosított szomszédos, nem rosszindulatú daganatos szövetek [31], [32]. Azonban a kapcsolat a TCP1-γ és a gyomorrák még mindig ismeretlen, és további vizsgálatok szükségesek.

Másrészt, azonosítottunk három fehérje, 14-3-3ε, RNH1 és APOAIBP, amelyek le- szabályozott MKN45 túlzottan kifejező sejtek NAIF1. 14-3-3 egy fehérje család, amely többfunkciós fehérjék, amelyek kötődnek és modulálják a funkciók széles skáláját celluláris fehérjéket. Továbbá részt vesznek a különböző biológiai folyamatokat, beleértve a sejtciklus ellenőrző szabályozás, az apoptózis és a sejtek növekedését ellenőrzés [33]. Számos tanulmány arról számolt be, hogy a 14-3-3ε expressziója megnő a tüdőrák, a májsejt-rák, mellrák és szeméremtest pikkelysejtes karcinóma [34] - [37]. Az egyetlen kivétel ez alól a megnövekedett 14-3-3ε kifejezés gyomorrákban szövetekben, ahol a kifejezés csökkent [38]. Ezen túlmenően, a korábbi tanulmányok kimutatták, hogy up-regulációját 14-3-3ε gátolhatja a Bad-kiváltott apoptózist az endoteliális sejtekben [39], és a nem-szteroid gyulladáscsökkentő gyógyszerek indukálhat kolorektális rákos sejt apoptózisának elnyomásával 14-3- 3ε kifejezés [40]. Sőt, a kórszövettani vizsgálat számolt be, hogy a 114 hepatocelluláris karcinóma betegek fokozott expressziója 14-3-3ε szignifikáns összefüggést a magas kockázati metasztázis és csökken a túlélés aránya [35]. Cellular kísérletek megerősítették, hogy a megnövekedett 14-3-3ε kifejezés indukál hepatocelluláris karcinóma sejtek migrációját, és elősegíti a hámsejtek mesenchymalis tranzíció (EMT) által indukálva Zeb-1 és csiga kifejezés [41]. Összegezve, 14-3-3ε egy figyelemre méltó onkogén, amely részt vesz a fejlesztés számos daganat és fontos szerepet játszik az apoptózis és a metasztázist. Itt azt találtuk, hogy 14-3-3ε van lefelé szabályozni MKN45 túlzottan kifejező sejtek NAIF1, ami arra utal, hogy 14-3-3ε lehet vonni a apoptózist indukált folyamat által NAIF1. Ezen túlmenően, az adataink azt jelenti, hogy amellett, apoptózist indukáló és sejtciklus leállásra, NAIF1 szerepet játszhat a sejt migráció és metasztázis. Eredményeink azt mutatják, hogy a fehérje expressziós szintjeit 14-3-3ε csökkentek, míg az RNS-szint növekedett. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy NAIF1 expresszióját szabályozza szintjeit 14-3-3ε poszttranszlációsan. A mutató adatok differenciális expressziós szintjét 14-3-3ε ellentétes Leal a [38], ami miatt lehet, hogy a különbség a sejteket és a szöveteket, vagy nem róható fel a torzítás mintában kiválasztása. Katalógusa

RNH1 egy citoszolikus fehérje, amely gátolja RNázok és formák nagy affinitású heterodimerek velük játszanak ellentmondásos szerepet az angiogenezisben [42]. Nem volt növekedés kutatási tanulmányok közötti kapcsolat vizsgálata RNH1 és a rák.

• PLoS One: epidermális növekedési faktor-szerű domént tartalmazó fehérje 7 (EGFL7) Javítja az EGF receptor-AKT jelzés és az epithelialis-mesenchymalis átmenet, és metasztázis gyomorrák Ce…
• PLoS One: A NOD-like receptor jeladás Út a Helicobacter pylori fertőzés és a kapcsolódó gyomorrák: Egy eset-kontroll vizsgálat és Gene Expression Analyses