PLOS ONE: surexpression de nucléaire induisant l'apoptose Facteur 1 modifié le profil protéomique de Cancer Cell gastrique humain MKN45 et Induced arrêt du cycle cellulaire au G1 /S Phase

Résumé

induisant l'apoptose nucléaire facteur 1 (NAIF1) a été signalé précédemment à induire l'apoptose. En outre, l'expression de NAIF1 était significativement régulée à la baisse dans les tissus du cancer gastrique humain par rapport aux tissus normaux adjacents. Cependant, le mécanisme par lequel le gène NAIF1 induit l'apoptose n'a pas été complètement comprise. Nos résultats montrent que NAIF1 est minimalement exprimée dans toutes les lignées cellulaires de cancer gastrique testé. Nos données démontrent également que NAIF1 est localisée dans les noyaux des cellules telles que détectées par la surveillance de la fluorescence verte de la GFP-NAIF1 protéine de fusion en utilisant la microscopie confocale à fluorescence. Ensuite, une approche protéomique comparative a été utilisée pour identifier l'expression différentielle des protéines entre les lignées cellulaires de cancer gastrique MKN45 /NAIF1 (-) et MKN45 /NAIF1 (+). Nous avons trouvé cinq protéines (protéasome 26S sous-unité 2, protéasome 26S sous-unité 13, NADH déshydrogénase protéine Fe-S 1, chaperonine contenant TCP1 sous-unité 3 et thiorédoxine réductase 1) qui étaient régulés à la hausse et trois protéines (ribonucléase inhibiteur 1, 14-3- 3 protéines epsilon isoforme et la protéine de liaison de l'apolipoprotéine AI) qui ont été régulée à la baisse dans les cellules surexprimant MKN45 NAIF1. Nous avons également découvert que NAIF1 pourrait induire l'arrêt du cycle cellulaire à la phase G1 /S en modifiant l'expression des protéines du cycle cellulaire cyclinD1, cdc2 et p21. Les protéines différentiellement exprimés identifiés ici sont liés à divers programmes cellulaires impliquant cycle cellulaire, l'apoptose et la régulation de transduction du signal et de suggérer que NAIF1 peut être un suppresseur de tumeur dans le cancer gastrique. Notre recherche démontre que élucide le rôle de la façon dont les fonctions de NAIF1 dans le cancer gastrique

Citation:. Yang M, Zhong J, Zhao M, Wang J, Gu Y, Yuan X, et al. (2014) La surexpression de nucléaire induisant l'apoptose Facteur 1 modifié le profil protéomique de Cancer Cell gastrique humain MKN45 et Induced arrêt du cycle cellulaire au G1 /S Phase. PLoS ONE 9 (6): e100216. doi: 10.1371 /journal.pone.0100216

Editeur: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesu ', Italie

Reçu le 27 Octobre 2013; Accepté: 23 mai 2014; Publié: Juin 13, 2014

Droit d'auteur: © 2014 Yang et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Financement:. Cette recherche a été soutenue par le Programme national de Key recherche fondamentale de la Chine (2007CB914700). Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Introduction

le cancer gastrique est l'une des tumeurs malignes les plus courantes dans le monde causant environ 8% et 10% des cas et des décès de cancer annuels, respectivement. Selon le rapport de l'épidémie à l'échelle mondiale par l'Organisation mondiale de la Santé, près d'un million de cas de cancer gastrique et 738.000 décès sont estimés avoir eu lieu en 2008 [1], [2]. De nombreux efforts ont été prises en clinique; Toutefois, la mortalité des patients atteints d'un cancer de l'estomac est toujours aussi élevé que 70% [2]. Une raison de ce taux de mortalité élevé est que les patients atteints de cancer gastrique ne sont souvent pas diagnostiqués avant le stade avancé, ce qui est trop tard pour assurer un traitement efficace. Par conséquent, il existe un besoin évident de trouver de nouveaux bio-marqueurs et des stratégies efficaces pour le diagnostic et le traitement du cancer gastrique précoce.

Proteomics a été utilisé dans de nombreux domaines de recherche, y compris la recherche sur le cancer. échantillons communs dans l'analyse protéomique pour la recherche sur le cancer comprennent les tissus et le sang de patients atteints de cancer, ainsi que des lignées de cellules de cancer de différentes origines ou différents traitements [3] - [6]. Ces analyses protéomiques ont été utilisés pour étudier l'origine et le développement du cancer ou à rechercher des biomarqueurs de diagnostic. Les résultats que nous avons obtenus grâce à des méthodes protéomiques ne sont pas seulement en raison de la réglementation directe du niveau de la transcription, mais reflètent également les modifications post-traductionnelles des protéines [3], [7]. Par conséquent, nous pouvons analyser à la fois l'expression et la régulation des protéines avec des analyses protéomiques. Malgré beaucoup de techniques émergentes, l'électrophorèse 2-dimensionnelle couplée à la spectrométrie de masse est restée la méthode la plus utilisée pour l'analyse protéomique.

L'induisant l'apoptose nucléaire codant pour le facteur de gène humain 1 (NAIF1) est situé sur le chromosome 9q34.11 . NAIF1 code pour une protéine avec un Myb
-like domaine dans sa région N-terminale [8], [9]. Des études antérieures ont montré que la surexpression de NAIF1 dans des lignées cellulaires cancéreuses humaines HeLa et MKN45 induit l'apoptose [8], [10]. . De plus, Luo et al, a trouvé que NAIF1 est fortement exprimé dans le tissu gastrique normale, tandis que son expression est régulée à la baisse ou la perte dans les tissus du cancer de l'estomac ( P < 0,001
). En outre, l'expression NAIF1 était plus élevé dans bien différencié ( P
= 0,004) que dans le cancer gastrique moderately- ou mal différencié [10]. Toutefois, le rôle de NAIF1 dans la régulation du profil d'expression de la protéine cellulaire est inconnue.

Dans la présente étude, nous avons utilisé la technologie protéomique basée sur l'électrophorèse en 2 dimensions combinée avec MALDI-TOF spectrométrie de masse pour identifier les protéines associées à la les fonctions biologiques du NAIF1. Les profils d'expression des protéines de la lignée cellulaire de cancer gastrique, MKN45, avec ou sans surexpression NAIF1 ont été analysés et comparés en utilisant 24 cm de pH 3-10 NL plage immobilisé gradient de pH (IPG) des bandes. Pour valider ces données, nous avons mesuré les niveaux d'expression d'ARN de toutes les protéines exprimées différemment et trois protéines a en outre vérifié par western blot. Nos résultats démontrent que NAIF1 induit un arrêt du cycle cellulaire en G1 /phase S en régulant les niveaux de cyclinD1, cdc2 et de la protéine p21 expression. Les résultats de notre étude peuvent conduire à une meilleure compréhension de la façon dont NAIF1 fonctionne dans l'induction de l'apoptose et peut également faire la lumière sur le diagnostic et le traitement des cancers gastriques dans l'avenir.

Matériel et méthodes

culture cellulaire et transfection

lignées cellulaires de cancer gastrique humaine MKN45, BGC823, AGS et SGC7901 ont été obtenus auprès de la Banque Tumor Cell chinois académique des sciences médicales et cultivées dans un milieu essentiel minimum (DMEM) de liquide Dulbecco additionné de 10% inactivé à la chaleur du sérum de foetus bovin (FBS), 100 UI /ml de pénicilline, 100 pg /ml de streptomycine à 37 ° C dans un humidifiée de 5% de CO _{2 atmosphère. La transfection d'ADN a été effectuée en utilisant le réactif de transfection-tremeGENE X HP ADN (Roche, Suisse) conformément aux instructions du fabricant.}

Les plasmides d'expression

Les plasmides d'expression pEGFP-N1-NAIF1, qui exprime un NAIF1-GFP protéine de fusion, et pEGFP-N1, qui exprime la protéine fluorescente verte (GFP), a été aimablement fournies par le Dr Qing Luo [10].

cycle cellulaire répartition analyse

en croissance exponentielle les cellules ont été transfectées avec le vecteur pEGFP-N1 ou le plasmide pEGFP-N1-NAIF1. Les cellules ont été récoltées à 24 h ou 48 h après la transfection et 1 × 10 ^{6 cellules ont été lavées deux fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et fixées avec du paraformaldehyde à 4% à 4 ° C pendant 1 h. Après centrifugation, les culots cellulaires ont été remis en suspension dans une solution de coloration (0,05 mg /ml d'iodure de propidium (PI), 0,2 mg /ml de RNase et 0,1% de Triton X-100) à 4 ° C pendant 15 min dans l'obscurité. Cytométrie de flux pour la GFP et PI a été réalisée en utilisant un analyseur de cellules BD LSR II (BD, San Jose, CA, USA). fluorescence de PI a été mesurée dans la population de cellules positives GFP et les distributions des cycles cellulaires ont été analysées en utilisant le logiciel Modfit LT3.2. Trois échantillons séparés ont été préparés et tous les essais ont été effectués en triple.}

Quantification de l'apoptose

Quantification de l'apoptose a été effectuée en utilisant le kit de PE de détection Annexine V Apoptose I (BD). En bref, les cellules MKN45 ou BGC823 ont été transfectées avec le vecteur pEGFP-N1 ou le plasmide pEGFP-N1-NAIF1. Après 24 h ou 48 h après la transfection, les cellules ont été récoltées, lavées avec du PBS froid deux fois, puis remis en suspension avec du tampon de liaison (10 mM HEPES /NaOH (pH 7,4), NaCl 140 mM, CaCl 2,5 _{2) . Les cellules remises en suspension ont été incubées avec de la phycoérythrine (PE) conjuguée à l'Annexine V (AV) et 7-amino-actinomycine (7-AAD), puis mesuré par cytométrie de flux en utilisant l'analyseur de cellules BD LSR II. Quatre populations cellulaires distinctes pourraient être détectées dans un point-terrain: les cellules viables (AV ^{- /7-AAD -), les cellules apoptotiques en phase précoce (AV + /7-AAD - ), les cellules apoptotiques phase tardive (AV + /7-AAD +) et les cellules nécrotiques (AV - /7-AAD +). Un minimum de cellules positives pour 10 000 GFP ont été comptées pour chaque échantillon et les données ont été rapportée comme le pourcentage de cellules apoptotiques (AV + /7-AAD - et AV + /7-AAD + ) parmi les cellules totales. Trois préparations d'échantillons indépendants ont été effectués et toutes les analyses ont été répétées en triple.}}

confocal à balayage

Quarante-huit heures après la transfection, les cellules ont été lavées trois fois avec du PBS et fixées avec 4% de paraformaldehyde pendant 15 min. à température ambiante. Afin d'améliorer la perméabilité de la membrane cellulaire, les cellules ont été incubées avec 0,5% de Triton X-100, suivie d'une incubation avec 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pour colorer les noyaux. NAIF1 distribution cellulaire a été analysée en contrôlant la fluorescence verte de la protéine de fusion NAIF1-GFP en utilisant un microscope Leica Microsystems GmbH, Heidelberg.

Préparation des protéines 2-DE

Pour chaque échantillon, 5 × 10 ^{6 cellules ont été récoltées et lysées dans 1 ml de tampon de lyse (7 M d'urée 2 M thiourée, 2% de CHAPS, 20 mM de DL-dithiothréitol (DTT), fluorure de phénylméthylsulfonyle 1 mM (PMSF), le fluorure de sodium 30 mM, et 0,25 mg /ml de RNase A) pendant 1 h à température ambiante, puis on centrifuge à 4 ° C pendant 30 min. à 12000 rpm. Le surnageant a été transféré dans un nouveau tube et on le concentre avec 0,1 M de NH _{4COOH. Le tampon de lyse a été ajouté à un volume final de 800 ul, et la concentration en protéine a été déterminée en utilisant un dosage de Bradford (Tiangen, Beijing, Chine).}}

électrophorèse bidimensionnelle

électrophorèse bidimensionnelle a été réalisée comme décrit précédemment [5]. En bref, 1 mg de protéines a été diluée à 450 ul avec du tampon de réhydratation (7 M d'urée, 2 M thiourée, 2% de CHAPS, et 20 mM de DTT). bandes IPG (IPG, 24 cm, pH 3-10, NL, Limite GE.) ont été réhydratés avec les échantillons réhydratés pendant 18 heures à la température ambiante. Les protéines ont été soumises à une focalisation isoélectrique avec un IPGphorIII Ettan (GE, CT, USA) successivement pendant 1 h à 100 v, 1 h à 250 v, 1 h à 500 v, 1 h à 1000 v, 1 h à 3000 v, 1 h à 5000 v, 2 h à 8000 v, et 6 h à 8000 v pour obtenir un total de 80 kvh. Suite à l'isoélectrofocalisation, les bandes IPG ont été équilibrées avec du tampon d'équilibrage I (6 M d'urée, 150 mM de Tris-HCl (pH 8,8), 30% de glycerol, 2% de SDS, 1% de DTT) pendant 15 min. suivie d'une seconde incubation avec un tampon d'équilibrage II (6 M d'urée, 150 mM de Tris-HCl (pH 8,8), 30% de glycerol, 2% de SDS, 2,5% iodoacétamide) pendant 15 min. La deuxième dimension de SDS-PAGE a été réalisée avec 12,5% de gels SDS-PAGE en utilisant les Ettan DALT SIX systèmes verticaux (GE).

Gel coloration et analyse d'images

Le SDS-PAGE les gels ont été fixés dans la fixation de tampon (10% de CH _{3COOH, 40% de C 2 H 5OH et 50% ddH 2O) pendant 30 min. Les gels ont ensuite été lavés dans ddH 2 O pendant 10 min. 3 fois et colorées avec du bleu de Coomassie G-250.}

Les gels ont été numérisés avec un scanner d'image en utilisant un logiciel MagicScan pour évaluer les modèles de place. ImageMaster logiciel de platine (version 5.0) a été utilisé pour analyser les images de gel. Les taches qui ont été observées à la fois sur le gel témoin et le gel NAIF1 ont été analysés et l'intensité de chaque point a été quantifié en calculant le volume de la tache après normalisation de l'image du gel. L'analyse quantitative des images de gel (trois répétitions /échantillon) ont été prises et des taches avec des écarts statistiquement significatifs (test t, * P
< 0,05)

Protéines ont été excisés et digérés pour l'identification. identifications

différentiellement exprimé des taches de protéines ont été extraites et de-colorées en mM NH 50 _{4HCO 3 /acétonitrile (50/50) et séchées par centrifugation sous vide. Les morceaux de gel ont ensuite été digérés avec 10 ng /ml de trypsine (Promega, WI, USA) en mM NH 50 4HCO 3 tampon à 37 ° C pendant la nuit. Le liquide de la trypsine a été transféré dans un tube propre, dilué avec 100 pi d'acide trifluoroacétique à 60% d'acétonitrile /0,1%, et traité par ultrasons pendant 15 minutes, trois fois. Tout le liquide acquis a été recueilli et séché sous vide et stocké à -80 ° C. Les peptides éluées ont été analysées en utilisant un spectromètre Bruker ultraflex MALDI-TOF /TOF équipé d'une source SCOUT BGI Beijing. Les résultats du spectre de masse ont été comparés contre des séquences de mammifères à partir de la base de données NCBInr (non redondant) pour peptide de masse identification des empreintes digitales.}

Isolement de l'ARN, RT et en temps réel Q
PCR

L'ARN total a été extrait en utilisant le réactif Trizol (Invitrogen) selon le protocole du fabricant. L'ADNc a été synthétisé par transcription inverse en utilisant 1 ug d'ARN total avec de l'oligo (dT) _{18 amorces et M-MuLV transcriptase inverse (Takara).}

Pour la PCR inverse de la transcription, des amorces pour NAIF1 et β-actine étaient comme suit: NAIF1 sens, 5'- AGCCACGGTCACCCTGACACA-3 'et anti-sens 5'- CGTGTCTGCATGCTGGGCCAT-3'; sens de la ß-actine, 5'- GGGCACGAAGGCTCATCATT-3 'et anti-sens 5'- AGCGAGCATCCCCCAAAGTT. Toutes les amorces ont été conçues en utilisant NCBI souffle et achetés à Sangon, Beijing
.

PCR quantitative a été réalisée avec le kit SYBR Green qPCR (TAKARA, Japon) avec un système de réaction de 20 ul mis en place selon les instructions du fabricant. l'expression du gène cible a été analysée à l'aide en temps réel appropriée qPCR amorces (tableau 1). β-actine a été utilisée pour la normalisation. Le temps réel qPCR a été réalisée sur un cycleur ABI7300 (ABI, MA, USA) avec les conditions suivantes: dénaturation pendant 30 s à 95 ° C, suivie de 40 cycles de dénaturation pendant 5 s à 95 ° C, et l'extension de 31 s à 60 ° C. Faire fondre l'analyse de la courbe a été réalisée à la fin de valider la spécificité du produit de PCR attendu. Expression relative a été calculée en utilisant les deux méthodes de la courbe standard. Trois échantillons indépendants ont été préparés pour chaque état et chaque expérience a été réalisée en triple.

Western blot

Western blot a été réalisée comme décrit précédemment. En bref, 2 x 10 ^{6 cellules ont été récoltées avec un débit moyen, sédimentées par centrifugation pendant 5 min à 500 g
, et on le lave 3 fois avec du PBS. Les cellules ont ensuite été lysées avec 100 ul de tampon de lyse (50 mM de Tris-HCl, pH 7,4, NaCl 150 mM, 1,5% de NP-40, 0,1% de SDS et 50 pg /ml de PMSF, fraîchement ajouté un cocktail de proteinase) sur de la glace pendant 30 min. Les lysats ont été centrifugés à 13 000 tpm pendant 15 min. et la concentration en protéine a été mesurée en utilisant des procédés Bradford. Cinquante microgrammes de protéines ont été séparées sur 12% de SDS-PAGE et transférés sur des membranes de difluorure de polyvinylidène. Les membranes ont été bloquées avec 5% de BSA dans TBST pendant une heure à la température ambiante, suivie d'une incubation avec des solutions d'anticorps primaire selon les instructions du fabricant (β-actine, 1:5000, Sigma; NAIF1, 1:1000, Santa Cruz, 14- 3-3 ε, 1:500, Santa Cruz, TCP1-γ, 1:1000, Abcam; TXNRD1, 1:1000, Abcam; CyclinD1, 1:1000, CST; cdc2, 1:500, CST, et p21, 1 :500, CST). Les membranes ont été lavées 3 fois avec du TBST, suivi par une incubation avec des anticorps secondaires appropriés pendant deux heures à la température ambiante. Les signaux ont été détectés en utilisant le système ECL chimioluminescence. β-actine a été utilisée comme témoin.}

Analyse statistique

Toutes les analyses statistiques ont été effectuées en utilisant SPSS 13.0 logiciel (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Les données ont été exprimées en moyenne ± SD. t-test de l'étudiant a été utilisé pour la comparaison statistique. Une valeur associée de P <.
0,05 a été considérée comme significative

Résultats transfectées NAIF1 localisée dans

Les deux expériences de transfert inverse de la transcription de PCR et de l'ouest du noyau a démontré que NAIF1 est minimalement exprimée dans des lignées cellulaires de cancer gastrique, MKN45, BGC823, AGS et SGC7901; tandis que NAIF1 a été facilement détecté lorsqu'il a été transfecté dans les cellules (Figure 1A. et B). Nous transfecté une construction de fusion NAIF1-GFP dans MKN45 et BGC823 cellules et un vecteur de GFP a été utilisé comme témoin. La microscopie confocale a montré que lorsque les cellules ont été transfectées avec la construction pEGFP-N1-NAIF1, la fluorescence verte a été détectée seulement dans les noyaux; au contraire, le signal de flurescent vert a été détecté pendant toute la cellule lorsque transfectée avec le vecteur de la GFP (figure. 1C). Les mêmes résultats ont également été observés dans d'autres lignées cellulaires telles que BGC823 (figure S1). Ces résultats ont confirmé que transfectés protéine NAIF1 est localisée dans le noyau.

NAIF1 induit un arrêt du cycle cellulaire en phase G1 /S

Le profil du cycle cellulaire des cellules du cancer de l'estomac sous l'effet de NAIF1 a été étudiée prochain. les cellules positives pour la GFP ont été analysées afin de s'assurer de la population correcte a été utilisée (figure S2). Analyse par cytométrie en flux a démontré que NAIF1 induit une modification significative de la distribution du cycle cellulaire: on a observé une augmentation de la population de cellules dans la phase G0 /G1, et une diminution de la phase S dans les cellules surexprimant NAIF1 par rapport aux cellules transfectées avec le vide vecteur, à la fois après la transfection 24 h et 48 h. Comme cela est représenté sur la figure. 2A, la cytométrie en flux a révélé que 24 h après la transfection, environ 54% des BGC823 cellules transfectées avec pEGFP-N1 vecteur étaient dans la phase G0 /G1, et de 34% et 12% des cellules étaient en phase S et phase G2 /M, respectivement, . D'autre part, dans BGC823 cellules transfectées avec le plasmide pEGFP-N1-NAIF1 construire il y avait une nette augmentation du pourcentage de cellules en phase G0 /G1 (74%), ainsi qu'une diminution du pourcentage de cellules en phase S (26%) et en phase G2 /M (0%). Quarante-huit heures après la transfection, approximativement 36% des cellules témoins étaient BGC823 en phase G0 /G1, et 59% et 5% des cellules sont en phase S et en phase G2 /M, respectivement. BGC823 dans les cellules transfectées avec le plasmide pEGFP-N1-NAIF1 construction, d'environ 55% des cellules étaient en phase G0 /G1, et 37% et 8% des cellules étaient en phase S et G2 /M en phase, respectivement. Dans MKN45 cellules, 24 h après la transfection, approximativement 56% des cellules transfectées avec le vecteur pEGFP-N1 étaient en phase G0 /G1, et de 29% et 15% des cellules étaient en phase S et G2 /en phase M, respectivement. Environ 76% des MKN45 cellules transfectées avec la construction pEGFP-N1-NAIF1 étaient en phase G0 /G1, et le pourcentage de cellules en phase S et en phase G2 /M ont été réduites à 24% et 0%, respectivement. Quarante-huit heures après la transfection, environ 43% des cellules témoins étaient MKN45 en phase G0 /G1, et de 43% et 14% des cellules étaient en phase S et G2 /M en phase, respectivement. Dans MKN45 cellules transfectées avec le plasmide pEGFP-N1-NAIF1 construction, d'environ 56% des cellules étaient en phase G0 /G1, et de 28% et 16% des cellules étaient en phase S et G2 /M en phase, respectivement (figure. 2B). Ces résultats démontrent clairement que la surexpression de NAIF1 induit un arrêt du cycle cellulaire à phase G1 /S des cellules cancéreuses gastriques BGC823 et MKN45.

Afin de clarifier le mécanisme par lequel l'arrêt du cycle cellulaire NAIF1 induite, nous avons examiné les rôles possibles de cyclinD1 , p21 et cdc2 protéines, qui sont importants dans la régulation du cycle cellulaire dans la phase G1 /S. Quarante-huit heures après la transfection, les niveaux de cyclinD1 et cdc2 expression ont diminué par rapport aux cellules de contrôle, à la fois dans les cellules BGC823 et MKN45. En outre, les niveaux de p21 d'expression ont été

analyse protéomique comparative de la lignée cellulaire de cancer gastrique MKN45 avec ou sans expression supplémentaire de NAIF1 protéines

Les profils protéiques de MKN45 augmenté (figure. 2C). cellules transfectées avec le plasmide pEGFP-N1-NAIF1 constructions comme le groupe traité ou avec le vecteur pEGFP-N1 du groupe témoin ont été mesurées par 2-dE 48 h après la transfection. Au total, plus de 700 spots ont été résolus, dont 11 protéines était > 1,5 fois différentiellement exprimé comme déterminé par analyse avec la version Imagemaster 5.0. Les taches de protéines exprimées de façon différentielle ont été excisées à partir du gel et 8 protéines ont été identifiées par analyse MALDI-TOF /TOF. Représentant traités et le groupe témoin des cartes de gel 2-DE sont présentés à la figure. 3A et les taches de protéines différentiellement exprimés sont marqués. Mégascopique 2-DE gel des photos de chacun des spots protéiques différentiellement exprimés sont représentés dans la figure. 3B et 3C. Cinq des protéines ont été régulés à la hausse dans le groupe traité, y compris le NADH déshydrogénase (ubiquinone) Fe-protéine S 1 (NADUSF1), chaperonine contenant TCP1 sous-unité 3 (TCP1-γ), la thiorédoxine réductase 1 (TXNRD1) protéasome 26S sous-unité 2 ( PSMC2) et protéasome 26S sous-unité 13 (PSMD13). 3 protéines ont été régulés à la baisse, y compris inhibiteur de ribonucléase 1 (RNH1), la protéine 14-3-3 epsilon isoforme (14-3-3 ε) et l'apolipoprotéine A-I protéine de liaison (APOAIBP). Le tableau 2 présente des informations spécifiques sur ces protéines et leur niveau d'expression différentielle.

Validation des protéines différentiellement exprimées

temps réel qPCR et western blot ont été effectuées pour vérifier la 2-DE résulte. les niveaux des protéines identifiées d'expression génique sont analysés par PCR quantitative en temps réel et sont compatibles avec les résultats de 2-DE, sauf pour une protéine, 14-3-3ε (figure. 4A). Trois protéines ont été choisis en fonction de leur importance et les fonctions probables pour une analyse par western blot pour vérifier les résultats 2-DE. Les résultats montrent que les niveaux de TXNRD1 et TCP1-γ expression de la protéine ont été significativement augmentés dans le groupe NAIF1 par rapport au groupe témoin ( P
< 0,05), tandis que le niveau de 14-3-3ε d'expression de protéine était significativement diminué dans le groupe NAIF1 ( P <
0,05) (figure 4B.). Dans l'ensemble, les résultats de Western blot sont compatibles avec les résultats de la 2-DE

Discussion

Plusieurs études ont été réalisées pour décrire le gène NAIF1. Cependant, on sait peu sur le profil NAIF1 protéomique est surexprimé. Le but de la présente étude était de détecter et d'identifier les protéines dont l'expression est modifiée dans les cellules surexprimant MKN45 NAIF1. En outre, la preuve est fournie pour expliquer comment NAIF1 fonctions dans l'induction de l'apoptose des cellules et d'autres activités. Une stratégie 2-DE a été utilisée dans cette étude en raison de sa méthodologie pratique et une grande efficacité. Au total, nous avons détecté et identifié 5 protéines qui ont été régulés à la hausse et 3 protéines qui ont été régulés à la baisse dans les cellules surexprimant MKN45 NAIF1 par rapport au groupe témoin. Les protéines identifiées impliquent un certain nombre d'activités physiologiques, tels que la dégradation des protéines, le contrôle de redox cellulaire homéostasie, la progression du cycle cellulaire, la régulation du cytosquelette, la réponse au stress cellulaire, l'apoptose et la régulation du métabolisme. Le profil du cycle cellulaire des lignées cellulaires de cancer gastrique, BGC823 et MKN45 a également été étudiée, et nos résultats ont démontré que la surexpression de NAIF1 peut induire l'arrêt du cycle cellulaire à phase G1 /S via la modification des niveaux de régulation du cycle cellulaire protéines cyclinD1, de cdc2 et p21 expression .

les résultats de western blot et PCR inverse de la transcription a été démontré que NAIF1 peu exprimé dans les cellules de cancer gastrique. Les données présentées ici est analogue à la constatation de Luo dans les tissus [10]. Par ailleurs, nous avons confirmé que NAIF1 est une protéine nucléaire dans les lignées cellulaires du cancer de l'estomac MKN45 et BGC823. Étant donné que l'ADN génomique existe principalement dans le noyau, ces données suggèrent que NAIF1 peut fonctionner dans le noyau par interaction avec l'ADN génomique et de la nucléoprotéine afin d'influer sur l'expression des gènes et des protéines complètement. Pour cette raison, nous avons procédé à l'analyse protéomique pour enquêter sur le profilage protéomique des cellules surexprimant MKN45 NAIF1.

régulation anormale du cycle cellulaire est une caractéristique remarquable de cellules cancéreuses [11]. Des études ont montré que de nombreuses petites molécules peuvent activer les points de contrôle du cycle cellulaire et induisent l'arrêt du cycle cellulaire, qui permettent aux cellules de réparer les défauts. Cependant, repairation échec peut conduire à l'apoptose [12] - [15]. Nos résultats montrent que NAIF1 induit un arrêt du cycle cellulaire à phase G1 /S. Transition de G1 à la phase S nécessite l'activation de l'assemblage de cyclinD-CDK4 /cycline 6 et cdc2 (également connu sous le nom Cdk1). Pendant ce temps, p21 inhibe l'activité de cdc2 et médie l'activation de l'assemblage et cyclinD-cdk4 /6 dans le cytoplasme, ainsi que l'inhibition de leur activité dans le noyau [16]. Dans cette étude, l'analyse par transfert de Western a détecté que le niveau de cdc2 cyclinD1 et d'expression de protéines ont été réduites, tandis que le niveau de p21 d'expression de protéine a été augmentée dans les cellules surexprimant NAIF1. Ces résultats suggèrent que G1 /S arrêt du cycle cellulaire induit par NAIF1 est médiée par la p21 et la voie cyclinD1. De plus, nous avons démontré que 48 h après la transfection, la population de cellules apoptotiques a augmenté d'environ 10% dans les cellules surexprimant NAIF1 à la suite de l'arrêt du cycle cellulaire (figure S3).

26S protéasome est un organite conservateur dans toutes les cellules eucaryotes, et il est responsable de la dégradation intracellulaire des protéines [17]. Les protéines qui sont dégradées par le protéasome 26S sont impliqués dans une série de processus biologiques, y compris l'apoptose, le cycle cellulaire, la croissance et la régulation de l'expression de nombreux gènes qui à leur tour régulent d'autres procédés [18]. Perturbation de l'équilibre de la dégradation des protéines conduit à la naissance et le développement du cancer. Ainsi, 26S protéasome est une cible de la thérapie du cancer attrayant. Ici, nous avons constaté que deux sous-unités du protéasome 26S, PSMC2 et PSMD13, étaient tous deux régulés à la hausse dans les cellules surexprimant MKN45 NAIF1. PSMC2 et PSMD13 sont des sous-unités du protéasome 19S, qui est la particule de régulation (RP) du protéasome 26S. PSMC2 est une ATPase alors PSMD13 est un non-ATPase. Certains chercheurs pensent que l'inhibition du protéasome 26S peut conduire à l'apoptose des cellules de carcinome, et les inhibiteurs de protéasome pourraient être utilisés pour traiter le cancer [19] - [21]. Cependant, une étude de Tan et al.
Suggère que le facteur de nécrose tumorale (TNF) -α active le système de protéasome 26S par la mise à la régulation des niveaux de 26S protéasome d'expression des sous-unités [22]. TNF-α est une cytokine bien connue qui peut induire l'apoptose dans une gamme de cellules cancéreuses, et maintenant il est utilisé dans la clinique comme traitement régional des sarcomes des tissus mous localement avancés et les mélanomes de métastases pour éviter des membres d'amputation [23]. Comme le TNF-α, NAIF1 a également la capacité à induire l'apoptose, ce qui implique que le protéasome 26S peut être impliquée dans le processus d'apoptose induite par NAIF1.

Nos données démontrent également que les deux protéines, et TXNRD1 NDUFS1, sont régulé à la hausse par NAIF1. TXNRD1 régule l'état redox des thiols protéiques dans les cellules de mammifères, et des fonctions à la fois dans la promotion et la prévention du cancer dans divers types de cancers [24] - [27]. Il n'y a pas eu d'études pour enquêter sur le rôle de TXNRD1 dans le cancer gastrique. À notre avis, TXNRD1 peut participer à la suppression de la genèse du cancer gastrique ou la régulation positive de TXNRD1 peut être un mécanisme d'adaptation en réponse au stress oxydatif généré par la surexpression de NAIF1. Le gène code pour une sous-unité NDUFS1 de 75 kDa de Fe-S qui est l'un des sept sous-unités du complexe mitochondrial I [28]. Complex I est le plus grand des enzymes de la chaîne respiratoire et la carence du complexe I est la principale cause d'une série de maladies mitochondriales innées, comme le syndrome de Leigh [29]. En outre, la sous-unité de 75 kDa du complexe I est un substrat des caspases, qui est impliqué dans la voie de l'apoptose mitochondriale. Le clivage de la caspase NDUFS1 est nécessaire pour plusieurs modifications mitochondriales associées à l'apoptose, y compris les taux d'ATP, de la production de ROS et la perte d'intégrité de la membrane du plasma et ainsi de suite [30]. Etant donné que NAIF1 induit l'apoptose par la voie mitochondriale [8], nous avons émis l'hypothèse que la régulation positive de NDUFS1 participe au processus d'apoptose induite par NAIF1.

TCP1-γ a été identifiée comme une chaperonine dans le cytosol eucaryote. Des recherches antérieures ont montré que TCP1-γ est significatif exprimé dans les tumeurs de carcinome hépatocellulaire par rapport aux tissus tumoraux appariés adjacents non malignes [31], [32]. Cependant, la relation entre TCP1-γ et le cancer gastrique est encore inconnue et une étude plus approfondie est nécessaire.

D'autre part, nous avons identifié trois protéines, 14-3-3ε, RNH1 et APOAIBP, qui étaient aval réglementée dans MKN45 cellules surexprimant NAIF1. 14-3-3 est une famille de protéines comprenant des protéines multifonctionnelles qui se lient à et modulent les fonctions d'une large gamme de protéines cellulaires. De plus, ils participent à divers processus biologiques, y compris la régulation du cycle cellulaire de point de reprise, l'apoptose et le contrôle de la croissance cellulaire [33]. Plusieurs études ont rapporté que l'expression est augmentée 14-3-3ε dans le cancer du poumon, le cancer hepatocelluar, le cancer du sein et de la vulve carcinome spinocellulaire [34] - [37]. La seule exception à cette expression 14-3-3ε accrue est dans les tissus gastriques de cancer, où l'expression est diminuée [38]. En outre, des études antérieures ont démontré que la régulation de 14-3-3ε peut empêcher l'apoptose Bad déclenchée dans les cellules endothéliales [39], et les médicaments non-stéroïdiens anti-inflammatoires peuvent induire l'apoptose des cellules colorectal cancer en supprimant 14-3- expression 3ε [40]. En outre, une étude histopathologique rapporté que chez 114 patients atteints de carcinome hépatocellulaire, une expression élevée de 14-3-3ε était significativement associée à un risque élevé de métastases et une diminution des taux de survie [35]. expériences cellulaires confirmé que l'augmentation de l'expression 14-3-3ε induit la migration des cellules de carcinome hépatocellulaire et favorise la transition épithéliale-mésenchymateuse (EMT) en induisant Zeb-1 et Snail expression [41]. Pour conclure, 14-3-3ε est un oncogène remarquable qui participe à l'élaboration de plusieurs tumeurs et joue un rôle important dans l'apoptose et la métastase. Ici, nous avons constaté que 14-3-3ε est régulée à la baisse dans MKN45 cellules surexprimant NAIF1, suggérant que 14-3-3ε peuvent être impliqués dans le processus de l'apoptose induite par NAIF1. En outre, nos données implique que, outre induire l'apoptose et arrêt du cycle cellulaire, NAIF1 peut jouer un rôle dans la migration cellulaire et la métastase. Nos résultats démontrent que les niveaux de 14-3-3ε d'expression de protéines ont été réduites, tandis que les niveaux d'ARN ont été augmentées. Ces résultats révèlent que NAIF1 régule les niveaux de post-traductionnelle 14-3-3ε d'expression. Nos données indiquant les niveaux de 14-3-3ε d'expression différentielle sont contraires à Leal de [38], ce qui peut être dû à la différence entre les cellules et les tissus, ou peuvent être attribués à la polarisation dans la sélection des échantillons.

RNH1 est une protéine cytosolique qui inhibe RNases et forme des hétérodimères de haute affinité avec eux pour jouer un rôle controversé dans l'angiogenèse [42]. Il y a eu une augmentation des études de recherche pour étudier la relation entre RNH1 et le cancer.

• PLOS ONE: Epidermal Growth Factor-Like contenant un domaine Protein 7 (EGFL7) Améliore EGF Receptor-AKT Signaling, épithéliale-mésenchymateuses Transition et Métastases du cancer gastrique Cells
• PLOS ONE: Le NOD-Like Receptor Signalling Pathway dans Helicobacter pylori infection et des cancer gastrique: une étude cas-témoins et Gene Expression Analyses