PLoS ONE: Prekomjerna ekspresija nuklearnu apoptoze inducira Faktor 1 preinačio proteomskog profila Ljudski raka želuca Cell MKN45 i izazvan staničnog ciklusa u G1 /S Faza

Sažetak pregled

Nuclear faktor apoptoza-inducirajući 1 (NAIF1) prethodno je uočeno da inducira apoptozu. Osim toga, ekspresija NAIF1 znatno podregulirani u ljudskim tkivima raka želuca u odnosu na susjedne normalnog tkiva. Međutim, mehanizam kojim NAIF1 gen izaziva apoptozu nije potpuno razumljiv. Naši rezultati pokazuju da NAIF1 minimalno izražena u svim ispitanim staničnim linijama raka želučanog. Naši podaci također pokazuju da NAIF1 je lokaliziran u jezgrama stanica što je detektirano pomoću promatranja zelene fluorescencije NAIF1-GFP spojenog proteina upotrebom fluorescentnog konfokalnom mikroskopijom. Dalje, komparativna proteomic pristup korišten je za identifikaciju diferencijalne ekspresije proteina između želuca staničnim linijama karcinoma MKN45 /NAIF1 (-) i MKN45 /NAIF1 (+). Našli smo pet proteini (proteasoma 26S podjedinice 2, proteasomalni 26S podjedinice 13, NADH-dehidrogenaze Fe-S protein 1, chaperonin sadrži TCP1 podgrupu 3 i tioredoksin reduktaze 1), koji su up-regulirana i tri proteini (ribonukleaza inhibitora 1, 14-3- 3 proteina epsilon izoforma i apolipoproteina AI vezanja proteina) koja su se regulira-u MKN45 stanicama ekspresijom NAIF1. Također smo otkrili da NAIF1 moglo poticajno staničnog ciklusa u G1 /S fazi mijenjajući izraz staničnog ciklusa bjelančevina cyclinD1, cdc2 i p21. Diferencijalno ekspresirana proteini ovdje identificirani su povezani s različitim staničnim od programa staničnog ciklusa, apoptozu i regulacije prijenosa signala i sugeriraju da NAIF1 može biti tumor supresor za raka želuca. Naše istraživanje donosi dokaze da razjašnjava ulogu tome kako NAIF1 funkcija u rak želuca pregled

Izvor:. Yang M, Zhong J, Zhao M, Wang J, Gu Y, Yuan X, et al. (2014) Prekomjerna ekspresija nuklearnu apoptoze inducira Faktor 1 preinačio proteomskog profila Ljudski raka želuca Cell MKN45 i izazvan staničnog ciklusa u G1 /S fazi. PLoS ONE 9 (6): e100216. doi: 10,1371 /journal.pone.0100216 pregled

Urednik: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesu ', Italija pregled

Primljeno: 27. listopada 2013. godine; Prihvaćeno: 23. svibnja 2014; Objavljeno: 13. lipanj 2014 pregled

Copyright: © 2014 Yang i sur. Ovo je otvorenog pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan

financiranja. Ovo istraživanje je podržan od strane National Key Basic Research programa Kine (2007CB914700). U financijeri nisu imali ulogu u studiju dizajna, prikupljanja i analize podataka, Odluka o objavi, ili pripremu rukopisa pregled

U konkurenciji interese.. Autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi pregled

Uvod pregled

rak želuca je jedan od najčešćih malignih bolesti u svijetu uzrokuje oko 8% i 10% godišnje slučajevima i smrti od raka, respektivno. Prema svjetski izvještaj epidemija od strane Svjetske zdravstvene organizacije, gotovo milijun slučajeva raka želuca i 738,000 smrtnih Procjenjuje se da su se dogodile u 2008. [1], [2]. Mnogi su napori poduzeti u Klinički; Međutim, smrtnost pacijenata oboljelih od raka želuca je još uvijek kao visok kao 70% [2]. Jedan od razloga za ovu visoku smrtnost je da pacijenti s rakom želuca često ne dijagnosticira dok poodmakloj fazi, što je prekasno pružiti učinkovito liječenje. Dakle, postoji očita potreba za pronalaženje novih bio-markera i učinkovite strategije za rano dijagnosticiranje i liječenje karcinoma želuca. Pregled

Proteomika se koristi u mnogim područjima istraživanja, uključujući istraživanje raka. Zajednički uzorci u proteomskog analiza za istraživanje raka uključuju tkivo i krvi od pacijenata oboljelih od raka, kao i staničnih linija raka različitog podrijetla ili različitih tretmana [3] - [6]. Ove proteomsku analizu korišteni su istražiti nastanak i razvoj raka ili tražiti dijagnostičke biomarkera. Rezultati smo dobiveni proteomskom metode su ne samo zbog direktne regulacije razini transkripcije, već također odražavaju post-translacijske modifikacije proteina [3], [7]. Stoga, možemo analizirati oba izraza i reguliranje proteina s proteomsku analizu. Unatoč mnogim novim tehnikama, 2-dimenzionalni elektroforeza u kombinaciji s masenom spektrometrijom ostao najviše koristi metodu za proteomskog analizu. Pregled

faktor koji kodira humani gen nuklearna apoptoza inducira 1 (NAIF1) nalazi se na kromosomu 9q34.11 , NAIF1 kodira protein s myb
su slični domenu na N-terminalnom području [8], [9]. Prethodne studije su pokazale da izražajnost NAIF1 u ljudskim staničnim linijama karcinoma HeLa i MKN45 inducira apoptozu [8], [10]. , Štoviše, Luo sur pregled pronađeno da NAIF1 značajno izraženo u normalnom tkivu želuca, dok je ekspresija podregulirani ili izgubljene u želučanom tkivu karcinoma ( P < pregled 0,001). Osim toga, NAIF1 izraz lica bio je veći u dobro diferencirani ( P pregled = 0,004) nego u moderately- ili slabo diferenciranim rakom želuca [10]. Međutim, uloga NAIF1 u reguliranju stanične ekspresije proteina profil je nepoznat. Pregled

U ovoj studiji, zaposlen proteomsku tehnologija temelji se na 2-dimenzionalni elektroforezu u kombinaciji s MALDI-TOF masene spektrometrije se identificirali proteine ​​povezane s biološke funkcije NAIF1. U profilu ekspresije proteina želučanog raka stanične linije, sa ili bez MKN45 NAIF1 prekomjernom ekspresijom analizirani su i uspoređene pomoću 24 cm pH 3-10 NL raspon imobilizirani gradijent pH (IPG) trake. Za procjenu tih podataka, izmjerili smo RNA razine ekspresije svih različito izraženih proteina s tri proteini također potvrditi Western blota. Naši rezultati pokazuju da NAIF1 inducira staničnog ciklusa u G1 /S faze reguliranjem razine ekspresije cyclinD1 Cdc2 i p21 proteina. Rezultati naše studije može dovesti do boljeg razumijevanja kako NAIF1 radi u indukciji apoptoze te može baciti svjetlo na dijagnostici i terapiji želučanog karcinoma u budućnosti. Pregled

Materijali i metode

stanična kultura i transfekcija pregled

Human želučanih stanične linije raka MKN45, BGC823, AGS i SGC7901 su dobiveni iz tumora Celi Bank kineske Academic medicinskih znanosti i kultivirane u tekućem Dulbeccovom minimalnom esencijalnom mediju (DMEM) obogaćenom sa 10% toplinski inaktiviranog fetalnog goveđeg seruma (FBS), 100 IU /ml penicilina, 100 ug /ml streptomicina na 37 ° C u vlažnoj 5% CO _{2 atmosfere. DNA transfekcije je izvedena pomoću X-tremeGENE HP DNA transfekcije reagensa (Roche, Švicarska), u skladu s uputama proizvođača. Pregled}

Expression plazmidi

izražavanja plazmidi pEGFP-N1-NAIF1, koji izražava NAIF1-GFP fuzijskog proteina, a pEGFP-N1, koja izražava zeleni fluorescentni protein (GFP), ljubazno je ustupio dr Qing Luo [10]. pregled

Stanični ciklus distribucija analiza pregled

eksponencijalno raste stanice su transfektirane sa pEGFP-N1 vektor ili pEGFP-N1-NAIF1 plazmida. Stanice se prikupe nakon 24 sati ili 48 sati nakon transfekcije, te 1 × 10 ^{6 stanice su isprane dva puta s fosfatom-puferiranom fiziološkom otopinom (PBS), te su fiksirane s 4% paraformaldehidom pri 4 ° C tijekom 1 sata. Nakon centrifugiranja, stanične pelete se resuspendiraju u bojenje otopine (0.05 mg /ml propidij jodida (PI), 0,2 mg /ml RNase i 0,1% Triton X-100) na 4 ° C tijekom 15 min u mraku. Protočno citometrijska analiza za GFP i PI provedena je pomoću stanica analizatora BD LSR II (bd, San Jose, CA, USA). PI fluorescencija mjerena je među pozitivnim populacije stanica GFP i raspodjela staničnih ciklusa analizirani su pomoću ModFit LT3.2 softvera. Tri odvojena uzorka dobiveni su svi testovi su izvedeni u triplikatu. Pregled}

Kvantifikacija apoptoza

kvantifikaciju apoptoze provedena je uporabom PE aneksina V Detection Kit apoptoze I (BD). Ukratko, BGC823 ili MKN45 stanice su transfektirane s pEGFP-N1 vektor ili pEGFP-N1-NAIF1 plazmida. Nakon 24 sata ili 48 sati nakon transfekcije, stanice su skupljene, isprane s hladnim PBS dva puta i zatim se ponovno suspendiraju u puferu za vezanje (10 mM Hepes /NaOH (pH 7.4), 140 mM NaCl, 2,5 mM CaClz _{2) , Obnovljene suspendirane stanice se inkubiraju s fikoeritrinom (PE) konjugiranog aneksina V (AV) i 7-amino-aktinomicin (7-AAD) i mjereno protočnom citometrijom pomoću analizatora BD LSR II stanica. Četiri različita populacija stanica mogao biti otkriven u dot-zemljište: živih stanica (AV ^{- /7-AAD -), apoptotične stanice u ranoj fazi (AV + /7-AAD - ), kasne faze apoptotične stanice (AV + /7-AAD +) i nekrotične stanice (AV - /7-AAD +). Najmanje 10.000 GFP pozitivne stanice su izbrojene po uzorku, a podaci su prikazani kao postotak apoptotičnih stanica (AV + /7-AAD - i AV + /7-AAD + ) među ukupnog broja stanica. Tri neovisna uzorka su pripreme i sve analize ponavlja u triplikatu. Pregled}}

Konfokalni skenirajući pregled

Četrdeset osam sati nakon transfekcije, stanice su isprane tri puta s PBS-om i fiksirane s 4% paraformaldehidom tijekom 15 min. na sobnoj temperaturi. Kako bi se poboljšala propusnost stanične membrane, stanice su inkubirane s 0,5% Triton X-100, nakon čega slijedi inkubiranje s 4 ', 6-diamidino-2-fenilindolom (DAPI) mrlja jezgre. Stanična distribucija NAIF1 analiziran praćenjem zelene fluorescencije NAIF1-GFP spojenog proteina pomoću Leica Microsystems Heidelberg GmbH mikroskopa. Pregled

priprema Protein za 2-DE pregled

Za svaki uzorak, 5 × 10 ^{6 stanice su sakupljene i lizirane u 1 ml pufera za lizu (7 M urea, 2 M tiourea, 2% CHAPS, 20 mM DL-ditiotreitol (DTT), 1 mM fenilmetilsulfonilfluorida (PMSF), 30 mM natrijev fluorid, i 0,25 mg /ml RNaseA) kroz 1 sat na sobnoj temperaturi, a zatim centrifugirana pri 4 ° C tijekom 30 minuta. na 12.000 okretaja u minuti. Supernatant prenese u novu epruvetu i koncentrira u 0,1 M NH _{4COOH. Pufera je dodana do konačnog volumena od 800 ul, a koncentracija proteina je određena korištenjem Bradfordovog testa (Tiangen, Beijing, Kina). Pregled}}

Dvodimenzionalni elektroforeza pregled

Dvodimenzionalni elektroforeza je izvedena kao što je ranije [5] opisano. Ukratko, 1 mg proteina je razrijeđen u 450 ul sa rehidracije pufera (7 M urea, 2 M tiourea, 2% CHAPS i 20 mM DTT). IPG trake (IPG 24 cm, pH 3-10, NL, GE granica.) Su bile rehidrirane sa rehidratiranim uzorcima tijekom 18 sati na sobnoj temperaturi. Proteini su podvrgnute izoelektričnom fokusiranju s Ettan IPGphorIII (GE, CT, USA) sukcesivno se 1 sat na 100 V, 1 h pri 250 V, 1 h pri 500 V, 1 h pri 1000 V, 1 h na 3000 V, 1 h na 5000 V, 2 h na 8000 V, a 6 h pri 8000 v da bi dobili ukupno 80 KVH. Nakon izoelektričnog fokusiranja, IPG trake se uravnoteži sa ravnotežnim puferom I (6 M urea, 150 mM Tris-HCl (pH 8,8), 30% glicerol, 2% SDS, 1% DTT) kroz 15 minuta. nakon čega slijedi druga inkubacija s drugom uravnoteživanje pufera II (6 M urea, 150 mM Tris-HCl (pH 8,8), 30% glicerol, 2% SDS, 2,5% jodoacetamid) tijekom 15 min. Druga dimenzija SDS-PAGE je izvedena s 12,5% SDS-PAGE gelovima pomoću Ettan Dalt ŠEST vertikalne sustave (GE). Pregled

Gel za bojenje i slika analiza pregled

SDS-PAGE gelovi su fiksirani u pričvrsnog puferu (10% CH _{3COOH, 40% C 2H 5OH, a 50% DDH 2O) tijekom 30 minuta. Gelovi su potom isprani DDH 2O 10 min. 3 puta i obojani sa Coomassie blue G-250. Pregled}

Gelovi su skenirani uz skener pomoću MagicScan softvera za procjenu licu mjesta uzoraka. Imagemaster platine softvera (verzija 5.0), da se analiziraju slike gel. Analizirani su mrlje koje su uočene i na kontrolnoj gela i NAIF1 gel i intenzitet svakom mjestu se kvantificira izračunavanje volumena točke nakon normaliziranja sliku gel. Kvantitativna analiza gel slika (tri ponavljanja /uzorak) uzeti su i mjesta sa statistički značajna razlika (t-test, * P izvoznici < 0,05). Izrezani su i probavljaju za identifikaciju pregled

Protein identifikacije pregled

različito izražena proteinske mrlje su izvađeni i de-obojeni u 50 mM NH _{4HCO 3 /acetonitril (50/50) i suši vakuum centrifugiranjem. Gel komadići zatim razgrađen s 10 ng /ml tripsina (Promega, WI, USA) u 50 mM NH 4HCO 3 puferu pri 37 ° C preko noći. Tekućina tripsina je prebačena u čistu epruvetu, razrijedi se sa 100 ul 60% acetonitril /0,1% trifluoroctenom kiselinom i pomiješa se s ultrazvukom 15 min, tri puta. Sva stečena tekućina je sakupljena i osušena pod vakuumom i pohranjeni na -80 ° C. Eluirani peptidi su analizirane uporabom Bruker ultraflex MALDI-TOF /TOF opremljen izvorom izviđačevo do BGI-Beijing. Rezultati za masovno spektra su u suprotnosti protiv sekvence sisavaca iz NCBInr (bez suvišne) baza podataka za peptida masovnu identifikaciju otisaka prstiju. Pregled}

RNA, RT i real-time PCR Q pregled

Ukupna RNA bila ekstrahirana pomoću Trizol reagensa (Invitrogen) prema uputama proizvođača. cDNA je sintetizirana reverznom transkripcijom upotrebom 1 ug ukupne RNA pomoću oligo (dt) _{18 primeri i M-MuLV reverzne transkriptaze (TAKARA). pregled}

reverzne transkripcije PCR primeri za NAIF1 i β-aktin su kako slijedi: NAIF1 smisla, 5'AGCCACGGTCACCCTGACACA-3 ', i anti-sense, 5'CGTGTCTGCATGCTGGGCCAT-3'; ß-aktin smisla, 5'GGGCACGAAGGCTCATCATT-3 ', i anti-sense, 5'AGCGAGCATCCCCCAAAGTT. Svi primeri su dizajnirani pomoću NCBI eksplozije i kupiti od Sangon, Beijing. Pregled

Kvantitativna PCRjeizvedenas na SYBR Green qPCR Kit (TAKARA, Japan) sa reakcijski sustav 20 ul postavljen u skladu s uputama proizvođača. ekspresije ciljanog gena je analizirana pomoću odgovarajuće stvarnom vremenu qPCR primera (Tablica 1). β-aktin je korišten za normalizaciju. U stvarnom vremenu qPCR je izvedena na ABI7300 ciklički uređaj (ABI, MA, USA), uz sljedeće uvjete: denaturacija 30 sekundi pri 95 ° C, a zatim 40 ciklusa denaturacije na 5 s na 95 ° C, a proširenje za 31 s na 60 ° C. Topljenje analiza krivulja izvedena je na kraju za provjeru specifičnost očekivanog produkta PCR. Relativni izraz izračunata je pomoću dvije standardne metode krivulje. Tri neovisna Uzorci su pripravljeni za svaki uvjet i svaki eksperiment izveden trostruko. Pregled

Western blotting pregled

Western blot je izveden kako je prethodno opisano. Ukratko, 2 × 10 ^{6 stanice su sakupljene sa struje sredstva, skupljen centrifugiranjem 5 minuta pri 500 g pregled i ispere 3 puta s PBS-om. Stanice su zatim lizirane sa 100 ul pufera za lizu (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1,5% NP-40, 0,1% SDS, te 50 ug /ml PMSF, svježe dodane inhibitore proteinaze koktela) na ledu 30 min. Lizati su centrifugirani na 13000 rpm tijekom 15 minuta. i koncentracija proteina je određena korištenjem Bradford metode. Pedeset mikrograma proteina je odvojena na 12% SDS-PAGE i prenesen na polivinilidenfluorid membrane. Membrane su blokirane s 5% BSA u TBST tijekom jednog sata na sobnoj temperaturi, nakon čega slijedi inkubacija sa otopinama primarna antitijela u skladu s uputama proizvođača (β-aktina, 1:5000, Sigma, NAIF1, 1:1000, Santa Cruz, 14- 3-3 ε, 1:500, Santa Cruz, TCP1-γ, 1:1000, Abcam; TXNRD1, 1:1000, Abcam; CyclinD1, 1:1000, CST, cdc2, 1:500, CST, i p21, 1 :500, CST). Membrane su zatim isprane 3 puta s TBST, nakon čega slijedi inkubiranje s odgovarajućim sekundarnim antitijelima za dva sata na sobnoj temperaturi. Signali su detektirani pomoću ECL kemiluminiscencijom sustava. β-aktin je bio zaposlen kao kontrola. pregled}

Statistička analiza pregled

Sve statističke analize provedene su pomoću SPSS 13.0 softvera (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Podaci su izraženi kao prosjek ± SD. Student-ov t-test je korišten za statističku usporedbu. Pridruženom vrijednost P <. Pregled 0.05 je smatrana značajnom

Rezultati

Transfektirane NAIF1 lokaliziran u jezgri pregled

Oba preokrenuti transkripcije PCR i Western blot-eksperimenata pokazao da NAIF1 minimalno izražena u želučanim staničnim linijama karcinoma, MKN45, BGC823, AGS i SGC7901; a NAIF1 lako otkrivena kada je transfektiran u stanice (Slika 1A, i B). transfektirane smo NAIF1-GFP fuzijski konstrukciju u MKN45 i BGC823 stanica i GFP vektor je korišten kao kontrola. Konfokalna mikroskopija je pokazao da kada su stanice transfektirane sa pEGFP-N1-NAIF1 konstrukta, zeleni fluorescentni je otkriven samo u jezgri; naprotiv, zelena flurescent signal detektiran u cijeloj stanici kada se transfektira s GFP vektor (Slika. 1C). Isti rezultati su i kod ostalih staničnih linija kao što je BGC823 (Slika S1). Ovi pronalasci su potvrdili da transfektirane NAIF1 protein lokaliziran u jezgri. Pregled

NAIF1 induciranih staničnog ciklusa u G1 /S faze pregled

Profil staničnog ciklusa stanica želuca raka pod djelovanjem NAIF1 je istražena Sljedeći. GFP-pozitivne stanice su bile analizirane kako bi se osiguralo ispravnu populacije je korištena (Slika S2). Analiza protočnom citometrijom pokazala je da NAIF1 izazvao značajnu promjenu u raspodjeli staničnog ciklusa: povećanje stanične populacije u G0 /G1 fazi i smanjenje u S fazi opažena u stanicama ekspresijom NAIF1 usporedbi sa stanicama koje su transfektirane sa praznim vektor, i nakon transfekcije 24 i 48 h. Kao što je prikazano na slici. 2A, protočna citometrija pokazala da 24 h poslije transfekcije, približno 54% BGC823 stanica s transfektiranim pEGFP-N1 vektora su u fazi G0 /G1 i 34% i 12% stanica bilo je u S fazu i G2 /M fazi, odnosno , S druge strane, u BGC823 transfektiranih s pEGFP-N1-NAIF1 konstruirati bilo je određeno povećanje postotka stanica u G0 /G1 fazi (74%), kao i smanjenje postotka stanica u S fazi (26%) i G2 /M fazi (0%). Četrdeset osam sati nakon transfekcije, približno 36% od kontrolnih stanica su BGC823 su u G0 /G1 fazi i 59% i 5% od stanica u S fazu i G2 /M fazi respektivno. U BGC823 transfektiranih s pEGFP-N1-NAIF1 konstrukciju, oko 55% stanica bilo je u G0 /G1 fazi i 37% i 8% stanica bilo je u S fazu i G2 /M fazi, respektivno. U MKN45 stanicama 24 h nakon transfekcije, oko 56% stanica transficiranih s pEGFP-N1 vektora su u G0 /G1 fazi, i 29% i 15% stanica bilo je u S fazu i G2 /M fazi, respektivno. Približno 76% MKN45 stanicama transficiranim s pEGFP-N1-NAIF1 konstrukta su u G0 /G1 fazi i postoci stanica u S fazu i G2 /M fazi smanjene su do 24% i 0%, respektivno. Četrdeset osam sati nakon transfekcije, približno 43% od kontrolnih stanica MKN45 su u G0 /G1 fazi, a 43% i 14% stanica bilo je u S fazu i G2 /M fazi, respektivno. U MKN45 transfektiranih s pEGFP-N1-NAIF1 konstrukciju, oko 56% stanica bilo je u G0 /G1 fazi i 28% i 16% stanica bilo je u S fazu i G2 /M fazi, odnosno (Slika. 2B). Ovi rezultati jasno pokazuju da prekomjerna ekspresija izazvanog staničnog ciklusa NAIF1 u G1 /S faza želučane stanice raka BGC823 i MKN45. Pregled

Da bi se objasnio mehanizam kojim NAIF1 izazvanu staničnog ciklusa, ispitali smo moguće uloge cyclinD1 , P21 i cDC2 proteini, koji su važni u regulaciji staničnog ciklusa u G1 /S fazi. Četrdeset osam sati nakon transfekcije, ekspresijske razine cyclinD1 i cdc2 smanjeni u usporedbi s kontrolnim stanicama, kako u BGC823 i MKN45 stanica. Osim toga, razina ekspresije p21 povećane su (Slika. 2C).

Komparativna proteomic analiza želučanog raka stanične linije MKN45 sa ili bez dodatnog izražavanja NAIF1 proteina Netlogu

Profili proteina MKN45 stanice transfektirane s pEGFP-N1-NAIF1 konstrukti kao tretirane skupine ili s pEGFP-N1 vektorom kao što je kontrolna grupa su mjerene 2-DE 48 sati nakon transfekcije. Ukupno, više od 700 točke su riješeni, od kojih je 11 proteine ​​je > 1,5 puta različito izražen kao određena analizom s Imagemaster verziji 5.0. Diferencijalno ekspresirana proteina mrlje su izrezana iz gela i 8 proteini se identificiraju pomoću MALDI-TOF analiza /TOF. Predstavnik liječi i kontrolna skupina 2-DE gel Karte su prikazani na slici. 3A i različito izraženi proteinske točke su označene. Megaskopski 2-DE gel slike svake od različito izraženi proteinskih točaka zastupljeni na slici. 3B i 3C. Pet proteina bila viša u liječenoj skupini, uključujući NADH dehidrogenaza (ubikinonom) Fe-S proteina 1 (NADUSF1) chaperonin sadrži TCP1 podjedinicu 3 (TCP1-y), tioredoksin-reduktaze 1 (TXNRD1), proteazoma 26S podjedinica 2 ( PSMC2) i proteasoma 26S podjedinice 13 (PSMD13). 3. Proteini su podregulirani uključujući ribonukleaze inhibitora 1 (RNH1) 14-3-3 proteina Ns izoforme (14-3-3 ε) i apolipoproteina A-I-vezujući protein (APOAIBP). Tablica 2 prikazuje specifične informacije o tim proteinima i njihovu razinu diferencijalne ekspresije. Pregled

Validacija različito izraženi proteini

Real-time qPCR i Western blot su provedena za provjeru 2-DE rezultate. Razine ekspresije gena identificiranih proteina analizirani su u realnom vremenu qPCR te su u skladu s rezultatima 2-DE, osim jednog proteina 14-3-3ε (Slika. 4A). Tri proteini su izabrani na temelju njihove važnosti i mogućih funkcija za daljnju analizu pomoću Western blot za potvrđivanje rezultata 2-DE. Rezultati pokazuju da su razine ekspresije proteina od TXNRD1 i TCP1-y su bile značajno povišene u NAIF1 skupini u odnosu na kontrolnu skupinu ( P pregled 0,05), dok je razina ekspresije proteina 14-3-3ε bila je značajno smanjena u NAIF1 grupe ( P < pregled, 0,05) (Slika 4B).. Sve u svemu, zapadne rezultati blot su u skladu s rezultatima 2-DE pregled

Rasprava pregled

Nekoliko studija je provedena kako bi opisali gen NAIF1. Međutim, malo je poznato o proteomic profil NAIF1 ekspresija mu je povećana. Cilj ovog istraživanja bio je otkriti i identificirati proteine ​​čija bi ekspresija promijenilo u MKN45 stanicama ekspresijom NAIF1. Nadalje, dokaz je pod uvjetom da objasni kako NAIF1 funkcije u indukciji apoptoze stanica i drugih aktivnosti. A 2-DE strategija je korišten u ovom istraživanju zbog zgodan metodologije i visoku učinkovitost. Ukupno, otkrili smo i identificirali 5 proteine ​​koji su up-regulirana i 3 proteine ​​koji su dolje uređena MKN45 stanicama ekspresijom NAIF1 u odnosu na kontrolnu skupinu. Identificirani proteini uključuju brojne fiziološke aktivnosti, kao što su degradacija proteina, kontrola staničnog redoks homeostaze, napredovanja staničnog ciklusa, regulaciju citoskelet, stanični stres odgovor, apoptoze i regulaciju metabolizma. Profil staničnog ciklusa želučanih staničnim linijama raka, BGC823 i MKN45 također je istražen i naši su rezultati pokazali da prekomjerno eksprimiraju NAIF1 mogu inducirati prekid staničnog ciklusa u G1 /S faze preko promjene razine ekspresije proteina regulacije staničnog ciklusa cyclinD1 Cdc2 i p21 . pregled

Rezultati iz Western hibridizacija i obrnuto transkripcije PCR je pokazao da NAIF1 minimalno izražena u želučanim stanicama raka. Podaci predstavljeni ovdje analogna Luo je nalaz u tkivima [10]. Nadalje, utvrdili smo da NAIF1 je nuklearna proteina u želučanom staničnim linijama karcinoma MKN45 i BGC823. Budući da genomska DNA, uglavnom postoji u jezgri, ti podaci ukazuju da NAIF1 može funkcionirati u jezgri interakcijom s genomskom DNA i nukleoproteina kako bi se utjecalo na ekspresiju gena i proteina kompleksan. Iz tog razloga provedena proteomsku analizu da istraži proteomski profiliranje MKN45 stanica ekspresijom NAIF1. Pregled

Abnormalna regulacija staničnog ciklusa je izuzetan karakteristika stanica raka [11]. Studije su pokazale da su mnogi male molekule mogu aktivirati stanični ciklus kontrolne točke i izazivaju zaustavljanje staničnog ciklusa, koji omogućuju stanicama popraviti nedostatke. Međutim, neuspješni repairation može dovesti do apoptoze [12] - [15]. Naši rezultati pokazuju da NAIF1 inducira staničnog ciklusa u G1 /S fazi. Prijelaz iz G1 u S fazu zahtijeva aktivaciju montaže cyclinD-CDK4 /6 i ciklin-cdc2 (također poznat kao CDK1). U međuvremenu, p21 inhibira aktivnost cdc2 i posreduje montažu i aktivaciju cyclinD-cdk4 /6 u citoplazmi, i inhibira njihovu aktivnost u jezgri [16]. U ovom istraživanju, Western blot analizom otkrio da je razina ekspresije proteina u cyclinD1 i cdc2 bio smanjen, dok je razina ekspresije proteina p21 povećana je u stanicama ekspresijom NAIF1. Ovi rezultati sugeriraju da G1 /S staničnog ciklusa inducirana NAIF1 posredovana p21 i cyclinD1 puta. Osim toga, pokazalo se da je 48 h nakon transfekcije, populacija apoptičnih stanica povećava oko 10% u stanicama ekspresijom NAIF1 uslijed staničnog ciklusa (slika S3). Pregled

26S proteasoma je konzervativna organela u svim eukariotske stanice i ona je odgovorna za unutarstanične razgradnju proteina [17]. Proteini koji se razgrade 26S proteasoma sudjeluju u nizu bioloških procesa, uključujući apoptozu, stanični ciklus i rast i regulira ekspresiju mnogih gena koji pak regulirati druge procese [18]. Poremećaj ravnoteže razgradnje proteina dovodi do nastanka i razvoja raka. Tako, 26S proteasoma je atraktivna meta za terapiju raka. Evo, našli smo da su dvije podjedinice 26S proteasomalni, PSMC2 i PSMD13, bili su up-regulirana u MKN45 stanicama ekspresijom NAIF1. PSMC2 i PSMD13 su podjedinice proteasoma 19S, koji je regulatorni čestica (RP) na proteasoma 26S. PSMC2 je ATPaze a PSMD13 je ne-ATPaze. Neki istraživači smatraju da inhibicija 26S proteasoma može dovesti do apoptoze stanica karcinoma, i proteazom inhibitore može se upotrijebiti za liječenje karcinoma [19] - [21]. Međutim, studija Tan i sur.
Sugerira da čimbenik nekroze tumora (TNF) -α aktivira 26S proteasomalni sustav regulaciju razine ekspresije na 26S proteasomalni podjedinica [22]. TNF-α je dobro poznati citokin koji mogu potaknuti apoptozu u rasponu od stanica karcinoma, i sada se koristi u klinici, kao regionalni liječenje lokalno napredne sarkomi mekih tkiva, te metastaze melanoma bi se izbjeglo amputacije ekstremiteta. [23] Kao i TNF-a, NAIF1 također ima sposobnost da inducira apoptozu, što znači da je 26S proteasomalni mogu biti uključeni u proces apoptoze potaknute NAIF1. Pregled

Naši podaci također pokazuju da su dva proteina, TXNRD1 i NDUFS1 su up-regulirana NAIF1. TXNRD1 regulira redoks stanje proteina tiolima u stanicama sisavaca i funkcije u oba promociji i prevenciji raka u različitim vrstama karcinoma [24] - [27]. Nema studije koje istražuju ulogu TXNRD1 u raka želuca. Prema našem mišljenju, TXNRD1 mogu sudjelovati u suzbijanju želučani genezu raka ili regulaciji TXNRD1 može biti prilagodljiva mehanizam kao odgovor na oksidativni stres koji nastaje prekomjernom ekspresijom NAIF1. NDUFS1 gen kodira 75 kDa Fe-S podjedinicu, koji je jedan od sedam mitohondrija podjedinice kompleksa sam [28]. Kompleks sam je najveća lanca enzima dišnog sustava i nedostatak kompleksa I. je glavni uzrok niza urođenih mitohondrijske bolesti, kao što su Leigh sindrom [29]. Osim toga, 75 kDa podjedinica kompleksa I je kaspaza supstrat, koji je uključen u mitohondrijskog apoptoze putem. Kaspaze cijepanje NDUFS1 je potreban za nekoliko mitohondrija promjene povezane s apoptoze, uključujući razine ATP-a, ROS proizvodnje i gubitak integriteta plazmatske membrane i tako dalje [30]. Od NAIF1 inducira apoptozu preko mitohondrijske puta [8], mi pretpostavljamo da je up-regulacija NDUFS1 sudjeluje u procesu apoptoze potaknute NAIF1. Pregled

TCP1-γ je identificiran kao chaperonin u eukariotske citosolu. Prethodna su istraživanja pokazala da TCP1-γ je značajno izražen u tumorima hepatocelularnog karcinoma u usporedbi s uparenim susjedne ne-zloćudnih tumorskih tkiva [31], [32]. Međutim, odnos između TCP1-y i raka želuca je još uvijek nepoznat, a potrebno je daljnje istraživanje. Pregled

S druge strane, identificirali smo tri proteine, 14-3-3ε, RNH1 i APOAIBP, koji su bili na dolje regulirana MKN45 stanicama ekspresijom NAIF1. 14-3-3 je protein obitelj koja se sastoji od multifunkcionalnih proteina koji se vežu i moduliraju funkcije širokog raspona staničnih proteina. Nadalje, oni sudjeluju u različitim biološkim procesima, uključujući regulaciju staničnog ciklusa kontrolne točke, apoptoze i kontrolu rasta stanica [33]. Nekoliko studija pokazalo da 14-3-3ε ekspresija kojeg je povećana kod raka pluća, hepatocelluar crijeva, rak dojke i vulve karcinoma pločastih stanica [34] - [37]. Jedina iznimka od ovog povećanog 14-3-3ε izražavanja je u želučanim tkiva raka, gdje je smanjena ekspresija [38]. Osim toga, prethodne studije pokazale su da se na regulaciju 14-3-3ε može spriječiti loše pokreću apoptozu u endotelnim stanicama [39] i nesteroidni protuupalni lijekovi mogu izazvati apoptozu stanica raka debelog potiskivanjem 14-3- 3ε izraz [40]. Štoviše, patohistološko istraživanje izvijestio da je u 114 bolesnika hepatocelularnog karcinoma, pojačana ekspresija 14-3-3ε bila je značajno povezana s visokim rizikom od metastaza, te smanjena stopa preživljavanja [35]. Stanična eksperimenti potvrdili su da je povećana 14-3-3ε izraz potiče migraciju hepatocelularni karcinom i potiče prijelaz epitela-mezenhimalne (EMT) zbog izazivanja Zeb-1 i puž izraza [41]. Da zaključimo, 14-3-3ε je izvanredan onkogena koji sudjeluje u razvoju nekoliko tumora i igra važnu ulogu u apoptozi i metastaze. Evo, našli smo da 14-3-3ε je dolje regulirana MKN45 stanicama ekspresijom NAIF1, sugerirajući da 14-3-3ε mogu biti uključeni u proces apoptoze potaknute NAIF1. Nadalje, naši podaci podrazumijeva da osim induciranja apoptoze i staničnog ciklusa, NAIF1 mogu igrati ulogu u migraciji stanica i metastaziranje. Naši rezultati pokazuju da su razine ekspresije proteina od 14-3-3ε smanjeni, a RNA je povećana. Ovi rezultati pokazuju da NAIF1 regulira razine ekspresije 14-3-3ε posttranslationally. Naši podaci pokazuju razinu diferencijal ekspresije 14-3-3ε su u suprotnosti s Leal a [38], što može biti posljedica razlike između stanica i tkiva, ili se može pripisati pristranosti u odabiru uzoraka. Pregled

RNH1 je u citosolu protein koji inhibira RNases i tvori s visokim afinitetom heterodimera s njima igrati kontroverznu ulogu u angiogeneze [42]. Došlo je do povećanja istraživanja ispitati odnos između RNH1 i raka.

• PLoS ONE: epidermalni faktor rasta nalik domene koje sadrže protein 7 (EGFL7) Poboljšava EGF receptor-Akt signalizacije, epitelne-mczcnhimnog tranziciji, i metastaziranja raka želuca Cells
• PLoS ONE: NOD-like receptora Signalizacija Put u Helicobacter pylori infekcije i srodnih rak želuca: case-control studija i Gene Expression Analyses