PLOS NËMMEN: Overexpression vun Nuclear Apoptosis-Pinguin Factor 1 der Proteomic Profil vun Mënscherechter Gastric Cancer Zell MKN45 verännert a Zell Cycle Arrest um G1 /S Phase entschlof

Wat VerfÜgung

Nuclear apoptosis-Pinguin Faktor 1 (NAIF1) war virdrun apoptosis zu induce gemellt. Ausserdem, huet den Ausdrock vun NAIF1 bedeitend erof-reglementéiert Mënsch gastric Kriibs Stoffer Verglach zu bascht normal Stoffer. Allerdéngs, déi de Mechanismus der NAIF1 Gentherapie apoptosis induces ass net ganz verstan. Eis Resultater weisen, datt NAIF1 minimally an all déi getest gastric Kriibs Zell Linnen ausgedréckt huet. Eis Daten beweist och dass NAIF1 an de Kären vun Zellen vun iwwerwaacht de grénge fluorescence vun NAIF1-GFP Fusioun FAQ benotzt unisse confocal microscopy als erwëscht en der ass. Next, war e Komparativ proteomic Approche benotzt den Ënnerscheed Ausdrock vu Proteinen tëscht gastric Kriibs Zell Linnen MKN45 /NAIF1 z'identifizéieren (-) an MKN45 /NAIF1 (+). Mir fonnt fënnef Proteinen (proteasome 26S subunit 2, proteasome 26S subunit 13, NADH dehydrogenase géréiert-S FAQ 1, chaperonin wouvun TCP1 subunit 3 an thioredoxin reductase 1) datt weider-reglementéiert an dräi Proteinen waren (ribonuclease inhibitor 1, 14-3- 3 FAQ Epsilon isoform an apolipoprotein AI bindend FAQ) dass verwandelt-regulariséiert goufen an der MKN45 Zellen overexpressing NAIF1. Mir entdeckt och déi NAIF1 konnt Zell Zyklus verhaft um G1 /S Phase vun Wou muss ech den Ausdrock vun Zell Zyklus Proteinen cyclinD1, cdc2 an p21 induce. D'differentially ausgedréckt Proteinen hei identifizéiert ginn zu verschiddenen bewosst Programmer Zesummenhang mat Zell Zyklus, apoptosis, an Signal transduction Regulatioun a virschloen, datt NAIF1 entholl suppressor zu gastric Kriibs kann. Eis Fuerschung stellt Beweis datt d'Roll vun wéi NAIF1 Funktiounen am gastric Kriibs elucidates VerfÜgung

Fro:. Yang M, Zhong J, Zhao M, Wang J, Gu Y, Yuan X, et al. (2014) Overexpression vun Nuclear Apoptosis-Pinguin Factor 1 der Proteomic Profil vun Mënscherechter Gastric Cancer Zell MKN45 verännert an entschlof Zell Cycle Arrest um G1 /S Phase. PLoS NËMMEN 9 (6): e100216. Doi: 10.1371 /journal.pone.0100216 VerfÜgung

Redakter: Rossella Rota, Ospedale Pediatrico Bambino Gesu ", Italien VerfÜgung

Arnaque: 27 Oktober 2013; Akzeptéiert: 23 Mee, 2014; Publizéiert: 13. Juni 2014 VerfÜgung

Copyright: © 2014 Yang et al. Dëst ass eng oppen-Zougang Artikel ënnert de Bedingunge vun der Lizenz BY Creative Commons verdeelt, déi bereet benotzen Genehmegungen, Distributioun, an Reproduktioun vun all mëttelgrouss, gëtt d'Original Auteur an d'Quell Kaiser sinn VerfÜgung

Funding:. Dëst Fuerschung gouf vun der National Key Grondakommes Research plangen vu China (2007CB914700) ënnerstëtzt. D'funders hu keng Roll am Etude Design, Daten Kollektioun an Analyse, Décisioun, oder Virbereedung vun der mëttelalterlech Handschrëft ze publizéieren VerfÜgung

Wettsträit Interessen:.. D'Auteuren hunn deklaréiert, datt keng Competitioun Interessen existéieren VerfÜgung

Aféierung VerfÜgung

Gastric Kriibs ass eent vun de meescht genannten malignancies an der Welt dauernd ongeféier 8% an 10% vun eisen alljährlechen Kriibs Fäll an Doudesfäll, bzw.. Laut der Welt-grouss Epidemie Rapport vun der Weltgesondheetsorganisatioun, bal eng Millioun gastric Kriibs Fäll an 738.000 Doudesfäll belafe 2008 Doudesfäll ze hunn [1], [2]. Vill Efforten goufen zu Medeziner geholl; der veruerteelt vun gastric Kriibs Patienten awer, ass nach méi héich ass wéi 70% [2]. Eng Ursaach fir dës héich veruerteelt ass, datt gastric Kriibs Patienten sinn oft net bis de Bal Etapp diagnostizéiert, déi ze spéit ass efficace Behandlung ze bidden. Dofir, ass et eng kloer muss nei Bio-lues an effikass Strategien fir fréi Diagnos a Behandlung vun gastric Kriibs ze fannen. VerfÜgung

Proteomics zu vill Fuerschung Domäner benotzt gouf, dorënner Kriibsfuerschung. Gemeinsam Echantillon vun proteomic Analyse fir Kriibsfuerschung och Otemschwieregkeeten a Blutt aus Kriibs Patienten, souwéi Kriibs Zell Linnen mat verschiddenen Hannergrënn oder verschidde Behandlunge [3] - [6]. Dës proteomic analyséiert goufen benotzt der origination an Entwécklung vu Kriibs ze ermëttelen oder fir diagnostic biomarkers ze kucken. D'Resultater mir duerch proteomic Methoden kritt sinn net nëmme wéinst direkten Regulatioun vun transcriptional Niveau, awer och spigelen Post-respektiv Modifikatioune vun Proteinen [3], [7]. Dofir kënne mer souwuel Ausdrock a Regulatioun vun FAQ mat proteomic Analysë analyséieren. Trotz vill vun de Schwellelänner Techniken, 2-Dimensiounen electrophoresis zesummen mat Mass spectrometry huet déi geheescht Method fir proteomic Analyse bliwwen. VerfÜgung

De Mënsch Gentherapie Zeechesaatz nuklear apoptosis-Pinguin Faktor 1 (NAIF1) op chromosome 9q34.11 etabléiert ass . NAIF1 encodes engem FAQ mat enger Myb VerfÜgung -like Domän op seng N-Uschloss Regioun [8], [9]. Virdrun Studien hunn zu Mënsch Kriibs Zell Linnen Hela datt overexpression vun NAIF1 dës Distanz an MKN45 induces apoptosis [8], [10]. . Desweideren, Luo et al VerfÜgung fonnt dass NAIF1 wiesentlech zu normal gastric Otemschwieregkeeten ausgedréckt ass, iwwerdeems seng Ausdrock ass erof-reglementéiert oder zu gastric Kriibs Stoffer verluer ( P &Si besteet; VerfÜgung 0.001). Ausserdeem war NAIF1 Ausdrock héich an d'Gutt-ënnerscheet ( P VerfÜgung = 0.004) wéi an moderately- oder Pro-ënnerscheet gastric Kriibs [10]. Allerdéngs ass d'Roll vun NAIF1 am bewosst FAQ Ausdrock Profil Regulatioun onbekannt. VerfÜgung

Am Moment studéieren, mir proteomic Technologie baséiert op 2-Dimensiounen electrophoresis kombinéiert mat MALDI-Ënnerportal Mass spectrometry Proteinen ze identifizéieren mat der verbonne ugestallten biologesch Funktiounen vun NAIF1. D'FAQ Ausdrock Profiler vun der gastric Kriibs Zell Linn, MKN45 mat oder ouni NAIF1 overexpression goufen analyséiert an am Verglach mat 24 cm pH 3-10 NL Rei Sommet pH packt (IPG) Dicher. Fir dës Donnéeën validéieren, gemooss mir RNS Ausdrock Niveau vun all de anescht ausgedréckt Proteinen an dräi Proteinen sech weider duerch westlech blotting ubelaangt. Eis Resultater weisen, datt NAIF1 Zell Zyklus verhaft um G1 /S Phase induces vun der Ausdrock Niveau vun cyclinD1, cdc2 an p21 FAQ Regulatioun. D'Resultater vun eiser Etude zu engem bessere Verständnis vun der vläicht wéi NAIF1 Wierker apoptosis zu Pinguin an och Liicht op d'Diagnos an Therapie vun gastric Cancers an Zukunft Archeologie kann. VerfÜgung

spontan a Methode VerfÜgung

Zell Kultur an transfection VerfÜgung

Mënscherechter gastric Kriibs Zell Linnen MKN45, BGC823, AGS an SGC7901 sech aus der entholl Zell Bank vun Chinese Akademesch vun Medical Sciences an cultured zu flësseg Dulbecco d'minimum Néideg mëttelfristeg (DMEM) kritt ergänzt mat 10% Hëtzt-inactivated an et Bovine serum (FBS), 100 IU /ml penicillin, 100 μg /ml streptomycin bei 37 ° C an enger humidified 5% CO _{2 Atmosphär. DNA transfection war mat der X-tremeGENE HP DNA transfection reagent (Roche, Schwäiz) standing no der Taktik vum Produzent. VerfÜgung}

Expression plasmids VerfÜgung

Den Ausdrock plasmids pEGFP-N1-NAIF1, déi eng äussert NAIF1-GFP Fusioun FAQ, an pEGFP-N1, déi, war gréng unisse FAQ (GFP) dréckt Audit vum Dr. Qing Luo gëtt [10]. VerfÜgung

Zell Zyklus VerfÜgung Verdeelung Analyse

Exponentially wuessen Zellen sech mat der pEGFP-N1 Vecteure oder der pEGFP-N1-NAIF1 plasmid transfected. Zellen sech um 24 h oder 48 h Post transfection gesammelt, an 1 × 10 6 Zellen sech fir 1 h zweemol mat phosphate-gefiermt Salins (PBS) an fix mat 4% paraformaldehyde bei 4 ° C zou. No centrifugation, goufen d'Zell Pellets am staining Léisung-du gespaart (0,05 mg /ml propidium Kaliumiodid (PI), 0,2 mg /ml RNase, an 0,1% Triton X-100) bei 4 ° C fir 15 min an der donkel. Flow cytometry Analyse fir GFP an PI war mat enger BD LSR II Zell Organer gesuergt (BD, San Jose, CA, USA). PI fluorescence war ënnert der GFP positive Zell Populatioun gemooss an der distributions vun der Zell geknuppt benotzt ModFit LT3.2 Software analyséiert. Dräi separat Echantillon waren bereet an all assays sech zu triplicate gesuergt. VerfÜgung

Quantification vun apoptosis VerfÜgung

Quantification vun apoptosis Leeschtung war mat der PE Annexin V Apoptosis Detektioun Kit ech (BD). Kuerz, goufen BGC823 oder MKN45 Zellen mat der Vecteure pEGFP-N1 transfected oder der pEGFP-N1-NAIF1 plasmid. No 24 h oder 48 h Post transfection, goufen d'Zellen recoltéiert, gewäsch mat kal PBS zweemol an duerno mat verbindlechen Prellbock (10 mm Hepes /NaOH (pH 7,4), 140 mm NaCl, 2,5 mm CaCl _{2) s-gespaart . Déi nei-suspendéiert Zellen sech mat Phycoerythrin (PE) conjugated Annexin V (AV) a 7-Aminosaier-Actinomycin (7-vunda) incubated, an duerno duerch onkontrolléiert gemooss cytometry der BD LSR II Zell Organer benotzt. Véier isoléiert Zell Populatiounsschichte kéint zu engem Punkt-Komplott nogewise ginn:, fréi-Phase apoptotic Zellen (AV + /7-vunda liewensfäeg Zellen (- - /7-vunda AV ) - ), spéide-Phase apoptotic Zellen (AV + /7-vunda +), an necrotic Zellen (AV - /7-vunda +). E Minimum vu 10.000 GFP positive Zellen sech pro Echantillonen an d'Donnéeë gezielt gouf als de Prozentsaz vun apoptotic Zellen (AV + /7-vunda Rapport - an AV + /7-vunda + ) ënnert total Zellen. Dräi onofhängeg Prouf Preparatiounen gemaach goufen an all assays sech zu triplicate widderholl. VerfÜgung}

Confocal Scannen VerfÜgung

Forty--aacht Stonnen Post transfection, goufen Zellen Katakombe dräimol mat PBS an fix mat 4% paraformaldehyde fir 15 min. bei Raumtemperatur. Fir d'permeability vun der Zell Membran verbesseren, huet Zellen incubated mat 0,5% Triton X-100, gefollegt vun incubation mat 4 ", 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) un d'Käre stain. Bewosst Verdeelung vun NAIF1 war vun iwwerwaacht de grénge fluorescence vun der NAIF1-GFP Fusioun FAQ mat enger Leica Microsystems Heidelberg GmbH microscope analyséiert. VerfÜgung

Protein Virbereedung fir 2-DE VerfÜgung

Fir all Prouf, 5 × 10 6 Zellen sech am 1 ml lysis Prellbock (7 M urea, 2 M thiourea, 2% Haréi, 20 mm DL-Dithiothreitol (DTT), 1 mm phenylmethylsulfonylfluoride (PMSF), 30 mm Natrium fluoride gesammelt an lysed, an 0,25 mg /ml RNaseA) fir 1 h bei Raumtemperatur, an da fir 30 min bei 4 ° C centrifuged. bei 12.000 Ziichter. D'supernatant gouf zu engem neie Rouer transferéiert an Konzentratioun mat 0,1 M NH _{4COOH. Lysis gefiermt gouf zu enger definitiver Volume vun 800 μl dobäi, an d'FAQ Konzentratioun war mat engem Bradford assay alles (Tiangen, Peking, China). VerfÜgung}

Zwee-Dimensiounen electrophoresis VerfÜgung

Zwee-Dimensiounen electrophoresis wéi virdru beschriwwen gesuergt huet [5]. An dowéinst, 1 mg vu Proteinen war bis 450 μl mat abordablel gefiermt verdënntem (7 M urea, 2 M thiourea, 2% Haréi, an 20 mm DTT). IPG Strips (IPG, 24 cm, pH 3-10, NL, GE Limit.) Huet sech fir 18 Stonnen bei Raumtemperatur mat der rehydrated Echantillon rehydrated. D'Proteinen sech mat engem Ettan IPGphorIII (GE, CT, USA) agesaat fir 1 h op 100 v, 1 h op 250 v, 1 h op 500 v, 1 h op 1000 v, 1 h op 3000 v zu isoelectric ënnerworf leeën, 1 h op 5000 v, 2 h op 8.000 v, a 6 h op 8.000 v Ganzen 80 kvh ze kréien. No der isoelectric leeën, sech IPG Strips equilibrated mat equilibrating gefiermt ech (6 M urea, 150 mm Tris-HCl (pH 8,8), 30% glycerol, 2% SDS, 1% DTT) fir 15 min. gefollegt vun engem zweete incubation mat aneren equilibrating gefiermt II (6 M urea, 150 mm Tris-HCl (pH 8,8), 30% glycerol, 2% SDS, 2,5% iodoacetamide) fir 15 min. Déi zweet-Dimensioun vun SDS-PAGE war mat 12,5% SDS-PAGE gels duerchgefouert der Ettan Dalt Six vertikalen Systemer (GE) benotzt. VerfÜgung

gelies staining an Bild Analyse VerfÜgung

der SDS-PAGE gels sech zu Bauer-Prellbock (10% CH _{3COOH, 40% C 2H 5OH, an 50% ddH 2O) fir 30 min fest. D'gels sech dann zu ddH 2O fir 10 min gewäsch. 3 mol an Kierchefënster mat Coomassie blo G-250. VerfÜgung}

D'gels mat engem Bild Scanner benotzt MagicScan Software gescannt huet d'Plaz Musteren ze diskutéieren. Imagemaster Platin Software (Versioun 5.0) war Employé de gelies Biller ze analyséieren. Déi Flecken déi op béide d'Kontroll gelies an NAIF1 gelies observéiert huet sech analyséiert an d'Intensitéit vun all Plaz war vun Paien der Plaz Volumen laachen nom gelies Bild norméierend. Chemeschen Analyse vun gelies Biller (dräi gefaart /Prouf) sech geholl a Flecken mat statistesch vill Differenzen (t-Test, * P VerfÜgung &Si besteet; 0,05). Décidéiert fir Identifikatioun excised a verdaut VerfÜgung

Protein vun 50 mm NH _{4HCO 3 /acetonitrile (50/50) a gedréchent vun Vakuum centrifugation identifications VerfÜgung}

Differentially ausgedréckt FAQ Flecken huet ofgebaut an de-Kierchefënster. D'gelies Stécker goufen dann Iwwernuechtung mat 10 Dummeldéng /ml trypsin (Promega, allem, USA) vun 50 mm NH _{4HCO 3 gefiermt bei 37 ° C verdaut. D'trypsin flësseg war, fir eng propper eraus transferéiert, mat 100 μl 60% acetonitrile /0,1% trifluoroacetic Seier verdënntem, a fir 15 min mat Ultraschall behandelt, dräimol. All d'Société flësseg war gesammelt an Vakuum gedréchent a bei -80 ° C gespäichert. D'eluted peptides sech mat engem Bruker ultraflex MALDI-Ënnerportal /Ënnerportal mat uerdentleche Quell vun BGI-Peking equipéiert analyséiert. D'Resultater vun Mass Spektrum géint mammalian Message vum NCBInr (Net-iwwerflësseg) Datebank fir peptide Mass fingerprinting Identifikatioun Géigesaz goufen. VerfÜgung}

RNS Isolatioun, RT a Real-Zäit Q Hinnen alleguer VerfÜgung

Total RNS war Hëllef TRIzol reagent (Invitrogen) no de Protokoll d'Hiersteller ofgebaut. cDNA war vun ëmgedréint Transkriptiouns mat 1 μg total RNS mat oligo (DT) Wierderbuch _{18 primers an M-MuLV transcriptase ëmgedréint (TAKARA). VerfÜgung}

Fir ëmgedréint transcriptional Hinnen alleguer, primers fir NAIF1 an β-actin sech wéi follegt zesummen: NAIF1 Sënn, 5'- AGCCACGGTCACCCTGACACA-3 ", an anti-Sënn, 5'- CGTGTCTGCATGCTGGGCCAT-3"; β-actin Sënn, 5'- GGGCACGAAGGCTCATCATT-3 ", an anti-Sënn, 5'- AGCGAGCATCCCCCAAAGTT. All d'primers sech entworf mat NCBI Héichuewen an kaaft aus Sangon, Peking. VerfÜgung

Chemeschen Hinnen alleguer war mat der SYBR Green qPCR Kit gesuergt (TAKARA, Japan) mat enger 20 μl Reaktioun System Ariichten no der Taktik vum Produzent. Target Gentherapie Ausdrock war mat passenden real-Zäit qPCR primers (Table 1) analyséieren. β-actin war fir normalization benotzt. D'real-Zäit qPCR war op en ABI7300 LS (Abi, MA, USA) mat dëse Konditiounen gesuergt: denaturation fir 30 ass bei 95 ° C, gefollegt vun 40 Zykle vun denaturation fir 5 ass bei 95 ° C, an Extensioun vum 31. ass um 60 ° C. Melting rop Analyse gouf um Enn standing der Spezifizitéit vun der erwaart Hinnen alleguer Produit ze validéieren. Relativer Ausdrock war berechent déi zwee Standard rop Methode benotzt. Dräi onofhängeg Echantillon waren fir all Conditioun virbereet an all Experimenter war zu triplicate gesuergt. VerfÜgung

Western Blotting VerfÜgung

Western blotting Leeschtung war wéi virdru beschriwwen. Kuerz, 2 × 10 6 Zellen mat mëttelfristeg Flux, pelleted vun centrifugation fir 5 min bei 500 gesammelt goufen g VerfÜgung, an Katakombe 3 Mol mat PBS. D'Zellen sech dann mat 100 μl lysis gefiermt lysed (50 mm Tris-HCl, pH 7.4, 150 mm NaCl, 1,5% NP-40, 0,1% SDS, an 50 μg /ml PMSF, mat frësch dobäi proteinase inhibitor Cocktail) op Äis fir 30 min. Lysates sech fir 15 min bei 13.000 Ziichter centrifuged. an d'FAQ Konzentratioun war mat Bradford Methoden gemooss. Fofzeg micrograms Proteinen gouf op 12% SDS-PAGE getrennt an zu polyvinylidene difluoride Schläimhait transferéiert. D'Schläimhait sech fir eng Stonn bei Raumtemperatur vun incubation mat Primärschoul antibody Léisungen duerno mat 5% BSA zu TBST blockéiert laut den Hiersteller d'Instruktioune (β-actin, 1:5000, Fläch; NAIF1, 1:1000, Santa Cruz; 14- 3-3 ε, 1:500, Santa Cruz; TCP1-γ, 1:1000, Abcam; TXNRD1, 1:1000, Abcam; CyclinD1, 1:1000, CST; cdc2, 1:500, CST; an p21, 1 :500, CST). D'Schläimhait waren 3 Mol mat TBST gewäsch, gefollegt vun incubation mat passenden Secondaire antibodies fir zwou Stonnen bei Raumtemperatur. D'Signaler sech mat der ECL Chemiluminescence System fonnt. β-actin war wéi d'Kontroll agestallt. VerfÜgung

statistique Analys VerfÜgung

All Statistik analyséiert goufen benotzt standing SPSS 13,0 Software (SPSS Galaxy Chicago, IL, USA). Date goufen ausdrécke wéi heescht ± Fils. Den T-Test d'Schüler war fir statistesch Verglach benotzt. En assoziéierten Wäert vun P &Si besteet;. VerfÜgung 0,05 bedeitendst considéréiert gouf VerfÜgung

Resultater VerfÜgung

Transfected NAIF1 an der VerfÜgung Keimzell en der

Béid transcriptional Hinnen alleguer a westlech blotting Experimenter ëmgekéierte bewisen, datt NAIF1 zu gastric Kriibs Zell Linnen, MKN45, BGC823, AGS, an SGC7901 minimally war ausgedréckt; Obschonn NAIF1 war einfach fonnt wann et an d'Zellen transfected war (Dorënner. 1A an B). Mir transfected engem NAIF1-GFP Fusioun Bau an MKN45 an BGC823 Zellen an enger GFP Vecteure war wéi d'Kontroll benotzt. Confocal microscopy bewisen, dass, wann Zellen mat der pEGFP-N1-NAIF1 bauen transfected waren, war gréng fluorescence nëmmen an de Käre fonnt; am Géigendeel, huet de grénge flurescent Signal duerch de ganze Zell fonnt wou mat der GFP Vecteure (Dorënner. 1c) transfected. D'selwecht Resultat sech och an anere Zell Linnen wéi BGC823 (Dorënner S1) observéiert. Dës Conclusiounen confirméiert datt NAIF1 FAQ transfected ass am helle en der. VerfÜgung

NAIF1 entschlof Zell Zyklus verhaft um G1 /S Phase VerfÜgung

D'Zell Zyklus Profil vun gastric Kriibs Zellen ënnert der Wierkung vun NAIF1 propagéieren war nächsten. GFP-positiv Zellen sech analyséiert déi richteg Bevëlkerung ze garantéieren war benotzt (Dorënner S2). Flow cytometric Analyse bewisen, dass NAIF1 e wesentleche Changement vun der Verdeelung vun der Zell Zyklus entschlof: eng Erhéijung vun der Zell Populatioun an der G0 /G1 Phase an enger Ofsenkung vun der S Phase war vun Zellen observéiert NAIF1 overexpressing Verglach mat Zellen mat den eidelen transfected Vecteure, souwuel an der transfection 24 h an 48 h. Als zu Dorënner gewisen. 2A, Flux cytometry Teamchef 24 h Post transfection, ongeféier 54% vun BGC823 Zellen transfected mat pEGFP-N1 Vecteure an der G0 /G1 Phase goufen, an 34% an 12% vun Zellen sech am S Phase an G2 /M Phas, bzw. . Op der aner Hand, an BGC823 mat der pEGFP-N1-NAIF1 transfected Zellen bauen war do enger definitive Erhéijung vun de Prozentsaz vun Zellen an G0 /G1 Phase (74%), souwéi eng Diminutioun vun de Prozentsaz vun Zellen am S Phas (26%) an G2 /M Phase (0%). Véierzeg-aacht Stonnen Post transfection, ongeféier 36% vun der BGC823 Kontroll Zellen an G0 /G1 Phase goufen, an 59% a 5% vun Zellen sinn an S Phase an G2 /M Phase bzw.. An BGC823 mat der pEGFP-N1-NAIF1 transfected Zellen bauen, ongeféier 55% vun Zellen sech am G0 /G1 Phas, an 37% an 8% vun Zellen sech am S Phase an G2 /M Phas, bzw.. An MKN45 Zellen, 24 h folgenden transfection, ongeféier 56% vun Zellen mat der Vecteure pEGFP-N1 transfected goufen G0 /G1 Phas, an 29% an 15% vun Zellen sech am S Phase an G2 /M Phas, bzw.. Ongeféier 76% vun MKN45 transfected Zellen mat der pEGFP-N1-NAIF1 bauen sech zu G0 /G1 Phas, an d'Prozentzuelen vun Zellen am S Phase an G2 /M Phas sech zu 24% an 0% erofgaangen ass, bzw.. Véierzeg-aacht Stonnen no transfection, ongeféier 43% vun der MKN45 Kontroll Zellen sech am G0 /G1 Phas, an 43% an 14% vun Zellen sech am S Phase an G2 /M Phas, bzw.. An MKN45 mat der pEGFP-N1-NAIF1 transfected Zellen bauen, ongeféier 56% vun Zellen sech am G0 /G1 Phas, an 28% an 16% vun Zellen sech am S Phase an G2 /M Phas, bzw. (Dorënner. 2B). Dës Resultater kloer bewisen, datt overexpression vun NAIF1 entschlof Zell Zyklus verhaft um G1 /S Phase vun gastric Kriibs Zellen BGC823 an MKN45. VerfÜgung

de Mechanismus ze klären, déi NAIF1 Zell Zyklus verhaft entschlof, iwwerpréift mir de méiglech Rollen vun cyclinD1 , p21 an cdc2 Proteinen, déi zu Zell Zyklus Regulatioun vun G1 /S Phase wichteg sinn. Véierzeg-aacht Stonnen no transfection, huet den Ausdrock Niveau vun cyclinD1 an cdc2 mat der Kontroll Zellen ofgeholl Verglach, souwuel zu BGC823 an MKN45 Zellen. Zousätzlech goufen d'Ausdrock Niveau vun p21 fräi (Dorënner. 2C). VerfÜgung

Vergläichend proteomic Analyse vun der gastric Kriibs Zell Linn MKN45 mat oder ouni extra Ausdrock vun NAIF1 FAQ VerfÜgung

D'FAQ Profiler vun MKN45 Zellen mat der pEGFP-N1-NAIF1 transfected gesond wéi déi behandelt Grupp oder mat der pEGFP-N1 Vecteure wéi d'Kontroll Grupp vun 2-dE 48 h der transfection gemooss goufen. Am Ganzen, waren iwwer 700 Plazen geléist, vun deenen 11 Proteinen war > 1,5-fantastesch differentially vun Analyse mat Imagemaster Versioun 5.0 wéi sech ausgedréckt. D'differentially ausgedréckt FAQ Flecken sech aus dem gelies excised, an 8 Proteinen sech duerch MALDI-Ënnerportal /Ënnerportal Analyse identifizéiert. Vertrieder behandelt a Kontroll Grupp 2-DE gelies Kaarten sinn am Dorënner gewisen. 3A an der differentially ausgedréckt FAQ Flecken geprägt. Megascopic 2-DE gelies Biller vun jidderengen vun den differentially ausgedréckt FAQ Flecken sinn zu Dorënner vertrueden. 3B an 3C. Fënnef vun de Proteinen sech weider-reglementéiert an d'behandelt Grupp dorënner NADH dehydrogenase (ubiquinone) géréiert-S FAQ 1 (NADUSF1), chaperonin wouvun TCP1 subunit 3 (TCP1-γ), thioredoxin reductase 1 (TXNRD1), proteasome 26S subunit 2 ( PSMC2) an proteasome 26S subunit 13 (PSMD13). 3 Proteinen sech verwandelt-reegelen, dorënner ribonuclease inhibitor 1 (RNH1), 14-3-3 FAQ Epsilon isoform (14-3-3 ε) an apolipoprotein E-Ech bindend FAQ (APOAIBP). Table 2 beschreiwen spezifesch Informatiounen iwwert dësen Proteinen an hirem Niveau vun Ënnerscheed Ausdrock. VerfÜgung

Validatioun vun differentially ausgedréckt Proteinen VerfÜgung

Real-Zäit qPCR a westlech blotting standing waren der 2-DE Resultater fir z'iwwerpréiwen. Gene Ausdrock Niveau vun der identifizéiert Proteinen sech vun real-Zäit qPCR analyséiert a sinn konsequent mat der 2-DE Resultater, ausser fir eng FAQ, 14-3-3ε (Dorënner. 4A). Dräi Proteinen baséieren op hir Wichtegkeet an wahrscheinlech Funktiounen fir weider Analyse vum südwestlechen blotting ausgewielt der 2-DE Resultater fir z'iwwerpréiwen. D'Resultater weisen, dass d'FAQ Ausdrock Niveau vun TXNRD1 an TCP1-γ waren am NAIF1 Grupp am Verglach zu der Kontroll Grupp ( P VerfÜgung &Si besteet; 0,05) vill fräi, während d'FAQ Ausdrock Niveau vun 14-3-3ε war vill an der NAIF1 Grupp ofgeholl ( P &Si besteet; VerfÜgung 0,05) (Dorënner 4B.). Am Allgemengen, sidd der westlecher blot Resultater konsequent mat der 2-DE Resultater VerfÜgung

Diskussioun VerfÜgung

Rei Etuden gemaach goufen d'NAIF1 Gentherapie ze beschreiwen. awer wéineg bekannt ass iwwer d'proteomic Profil NAIF1 overexpressed ass. D'Zil vun dëser Etude war bis Proteinen z'entdecken an z'identifizéieren deem Ausdrock ass zu MKN45 Zellen overexpressing NAIF1 geännert. Weider, ass de Beweis wéi NAIF1 Funktiounen apoptosis an aner Aktivitéiten am Pinguin Zell ze erklären gëtt. Eng 2-DE Trainer war vun dëser Etude wéinst hirer praktesch Methodik an héich Effizienz agestallt. Am Ganzen, nogewise mir an identifizéiert 5 Proteinen datt weider-reglementéiert an 3 waren Proteinen datt verwandelt-regulariséiert goufen MKN45 Zellen NAIF1 overexpressing Verglach zu der Kontroll Grupp. D'identifizéiert Proteinen Debaten Zuel vun gestallt Aktivitéiten, wéi FAQ ofgeschnidden, Kontroll vun Zell redox homeostasis, Zell Zyklus Werdegang, cytoskeleton Regulatioun, bewosst Stress Äntwert, apoptosis a Regulatioun vun ukuerbelt. D'Zell Zyklus Profil vun gastric Kriibs Zell Linnen, BGC823 an MKN45 war och propagéieren, an eis Resultater bewisen, dass overexpression vun NAIF1 kënnt via Wou muss ech den Ausdrock Niveau vun Zell Zyklus Regulatioun Proteinen cyclinD1, cdc2 an p21 um G1 /S Phase Zell Zyklus verhaft induce . VerfÜgung

Resultater vum südwestlechen blotting an ëmgedréint transcriptional Hinnen alleguer bewisen, dass NAIF1 minimally war zu gastric Kriibs Zellen ausgedréckt. D'Daten virgestallt ëmzestoussen ass Gewässer bis Luo d'Opklärung vun Stoffer [10]. Desweideren, confirméiert mir dat NAIF1 engem nuklearen FAQ am gastric Kriibs Zell Linnen MKN45 an BGC823 ass. Zanter haaptsächlech Frankräich DNA am helle existéiert, proposéiert dës Donnéeën, déi NAIF1 am helle Funktioun ka mat Frankräich DNA an nucleoprotein fir déi proposéiert globaalt den Ausdrock vun Genen an Proteinen ze beaflossen. Aus deem Grond standing mir proteomic Analyse der proteomic profiling vun MKN45 Zellen overexpressing NAIF1 ze ermëttelen. VerfÜgung

Manque Regulatioun vun Zell Zyklus eng bemierkenswäert Charakteristik vun Kriibs Zellen ass [11]. Etuden hu bewisen, dass vill kleng Molekülle kann Zell Zyklus checkpoints aktivéieren an Zell Zyklus verhaft induce, déi Zellen erlaben Mängel ze flécken. Allerdéngs, Mëssgléckt repairation zu apoptosis Féierung kann [12] - [15]. Eis Resultater weisen, datt NAIF1 Zell Zyklus verhaft um G1 /S Phase induces. Iwwergank vum G1 bis S Phase verlaangt der Aktivatioun vun Versammlung vun cyclinD-Cdk4 /6 a cyclinE-cdc2 (och als Cdk1 bekannt). Mëttlerweil, bremst p21 der Aktivitéit vun cdc2 an mediates Versammlungs- a Aktivatioun vun cyclinD-cdk4 /6 an der Zytoplasma, souwéi hir Aktivitéit am helle inhibiting [16]. An dëser Etude, nogewise westlech blotting Analyse datt FAQ Ausdrock Niveau vun cyclinD1 an cdc2 huet ofgeholl, iwwerdeems d'FAQ Ausdrock Niveau vun p21 vun Zellen fräi war overexpressing NAIF1. Dës Resultater hindeit, datt G1 /S Zell Zyklus verhaft vun NAIF1 entschlof ass duerch d'p21 an cyclinD1 Passerelle mediated. Zousätzlech, hien mir dass 48 h der transfection, d'Populatioun vun apoptotic Zellen ongeféier 10% vun Zellen fräi overexpressing NAIF1 als Resultat vun Zell Zyklus verhaft (Dorënner S3). VerfÜgung

26S proteasome engem konservativen Organell an all ass eukaryotic Zellen an et ass responsabel fir intracellular FAQ ofgeschnidden [17]. Proteinen déi vun 26S proteasome deforméiert sinn si an enger Serie vun biologesche Prozesser dorënner apoptosis, Zell Zyklus Équipe, an Wuesstem a Regulatioun vum Ausdrock vu ville Genen déi am Tour aner Prozesser regléieren [18]. Stéierunge vun der FAQ ofgeschnidden Gläichgewiicht féiert zu der origination an Entwécklung vum Kriibs. Sou, 26S proteasome ass eng attraktiv Kriibs Therapie viséieren. Hei, hunn mir déi zwee subunits vun der 26S proteasome, PSMC2 an PSMD13, waren zwee weider-reglementéiert MKN45 Zellen overexpressing NAIF1. PSMC2 an PSMD13 sinn subunits vun der 19S proteasome, déi de reglementaresche ëm (RP) vun der 26S proteasome ass. PSMC2 ass eng ATPase iwwerdeems PSMD13 engem Net-ATPase ass. Verschidde Fuerscher mengen dass 26S proteasome inhibition zu apoptosis vun carcinoma Zellen Féierung kann, an proteasome inhibitors benotzt ginn hätt Kriibs unzegesin [19] - [21]. Mä, eng Etude vum Tan et al. VerfÜgung hindeit datt entholl necrosis Faktor (TNF) -α der 26S proteasome System activéiert vun up-Regulatioun den Ausdrock Niveau vun der 26S subunits proteasome [22]. TNF-α ass eng bekannt cytokine déi apoptosis zu enger Rei vu Kriibs Zellen induce kann, an elo ass et an der Klinik wéi eng regional Behandlung vu lokalen fortgeschratt mëll Otemschwieregkeeten sarcomas an Metastasen melanomas benotzt vun amputation fofzeng ze verhënneren [23]. Wéi TNF-α, huet NAIF1 och d'Fähegkeet apoptosis zu induce, deen dat an de apoptosis Prozess vun NAIF1 entschlof Équipe gin der 26S proteasome beinhalt kann. VerfÜgung

Eis Daten beweisen och, datt zwee Proteinen, TXNRD1 an NDUFS1, sinn up-reegelen NAIF1. TXNRD1 reguléieren der redox Staat FAQ thiols zu mammalian Zellen, a Fonctioun vun souwuel der Promotioun an Kriibs an ënnerschiddlëch Arte vun carcinomas bedengt [24] - [27]. Et muss keen Studien gouf d'Roll vun TXNRD1 zu gastric Kriibs ze ermëttelen. An eiser Meenung no, TXNRD1 kann an dem Ophiewe vun gastric Kriibs Moses oder déi weider-Regulatioun vun TXNRD1 kann een de Lycée Mechanismus an Äntwert ze oxidative Stress entsteet duerch overexpression vun NAIF1 deelhuelen. D'NDUFS1 Gentherapie encodes engem 75 kDa géréiert-S subunit, wat ee vun de siwe Kënschtlech subunits vun komplex ass ech [28]. Komplex ech ass de gréisste vun der Otmungsproblemer Kette Enzymen an hunn vun komplex ech ass de groussen Ursaach vun enger Serie vun ugebuėrent Kënschtlech Krankheeten, wéi Leigh Syndrom [29]. Ausserdeem, ass den 75. kDa subunit vun komplex ech eng caspase Realitéiten, déi am Kënschtlech apoptosis Passerelle Équipe ass. Caspase Rëss vun NDUFS1 ass fir e puer Kënschtlech Verännerunge mat apoptosis verbonne néideg, dorënner ATP Niveauen, Ros Produktioun, an Verloscht vun Integritéit Plasma Membran an sou op [30]. Zanter NAIF1 apoptosis duerch d'Kënschtlech Passerelle induces [8], hypothesize mir dass de weider-Regulatioun vun NDUFS1 am vun NAIF1 entschlof apoptosis Prozess bedeelegt. VerfÜgung

TCP1-γ gouf als chaperonin zu eukaryotic Zytosol identifizéiert. Virdrun Fuerschung huet fonnt dass TCP1-γ bedeitendst ass zu erhéijen vun hepatocellular carcinoma ausgedréckt Verglach zu der vläit bascht Net-malignant entholl Stoffer [31], [32]. Mä, ass d'Relatioun tëscht TCP1-γ an gastric Kriibs nach onbekannt a weider studéieren ass waren. VerfÜgung

Wéinst dem identifizéiert mir dräi Proteinen, 14-3-3ε, RNH1 an APOAIBP, datt sech down- overexpressing NAIF1 zu MKN45 Zellen reegelen. 14-3-3 ass eng FAQ Famill vun Salle Proteinen aus datt bis kruet an der Fonctioun vun engem Netzwierk vu bewosst Proteinen well. Weider, si bei Objeten biologesche Prozesser, dorënner Zell Zyklus Bomm Regulatioun, apoptosis, an Zell Wuesstem Kontroll [33]. Puer Studien hu bericht, dass 14-3-3ε Ausdrock an haett Kriibs, hepatocelluar Kriibs fräi ass, Broscht Kriibs an vulvar squamous Zell carcinoma [34] - [37]. Déi eenzeg Ausnam zu dëser fräi 14-3-3ε Ausdrock ass zu gastric Kriibs Stoffer, wou d'Expressioun rofgaang ass [38]. Ausserdeem hu virdrun Etuden bewisen, dass weider-Regulatioun vun 14-3-3ε Bad-ausgeléist apoptosis zu endothelial Zellen verhënneren kann [39], an Net-steroidal anti-demagogesch Drogen kann colorectal Kriibs Zell apoptosis induce 14-3- vun suppressing 3ε Ausdrock [40]. Desweideren, engem histopathological Etude confirméiert datt nik Ausdrock vun 14-3-3ε zu 114 hepatocellular carcinoma Patienten, vill mat engem héije Risiko Metastasen verbonne war a rofgaang Iwwerliewe Tariffer [35]. Bewosst Experimenter bestätegt dass 14-3-3ε Ausdrock fräi induces hepatocellular carcinoma Zell Wanderung an ënnerstëtzt epithelial-mesenchymal Transitioun (EMT) vun Pinguin Zeb-1 an Wéngertsschleek Ausdrock [41]. Fir ofzeschléissen, 14-3-3ε ass eng formidabel oncogene datt an der Entwécklung vun e puer erhéijen Participatiounen a spillt eng wichteg Roll an apoptosis an Metastasen. Hei, fonnt mir dass 14-3-3ε Minus-reglementéiert MKN45 Zellen overexpressing NAIF1 suggeréiert datt 14-3-3ε an der apoptosis Prozess vun NAIF1 entschlof Équipe kann. Desweideren, beinhalt eis Daten datt apoptosis an Zell Zyklus verhaft niewt Pinguin, NAIF1 eng Roll am Zell Wanderung an Metastasen spille kann. Eis Resultater bewisen, datt d'FAQ Ausdrock Niveau vun 14-3-3ε huet ofgeholl, iwwerdeems den RNS Niveauen eropzesetzen. Dës Resultater opzeweisen, datt NAIF1 den Ausdrock Niveau vun 14-3-3ε posttranslationally reguléieren. Eis Daten der Ënnerscheed Ausdrock Niveau vun 14-3-3ε sinn Géigendeel zu Leal d'[38] weisen, déi tëschent Zellen an Stoffer wéinst der Differenz kann, oder vläicht fir d'Schold vu senge Politiker an specimen Auswiel zougeschriwwen ginn. VerfÜgung

RNH1 ass eng cytosolic FAQ datt RNases a Formen héich-Affinitéit heterodimers mat hinnen bremst eng kontrovers Roll an angiogenesis ze spillen [42]. Et gouf eng Hausse vun Forschungsstudien goufen d'Relatioun tëscht RNH1 a Kriibs ze ermëttelen.

• PLOS NËMMEN: Epidermal Wuesstem Factor-Like Domain-haltege Protein 7 (EGFL7) verbessert EGF Receptor-AKT sécher, Epithelial-Mesenchymal Transitioun, an Metastasen vun Gastric Cancer Cells
• PLOS NËMMEN: D'gewënnt-Like Receptor Material Passerelle an Helicobacter pylori Wonn an Contenu Gastric Cancer: Eng Case-Control Sécuritéit an Gene Expression Analyses