PLoS ONE: MYC sääntelyn purkaminen mahasyövän ja sen kliinispatologiset Implications

tiivistelmä

Tutkimuksessa selvitettiin suhde MYC
muutoksia ja kliinis-in syöpien. Arvioimme vaikutus MYC
mRNA ilmaisun ja sen proteiinin immunoreaktiivisuus sekä kopioluvun vaihtelu, promoottori DNA metylaatio, ja pistemutaatioita, 125 mahalaukun adenokarsinooman ja 67 paried ei-neoplastisia kudoksia. Havaitsimme, että 77%: n kasvainten esitteli MYC immunoreaktiivisuus, joka oli merkitsevästi yhteydessä lisääntyneeseen mRNA: n ilmentymisen ( p
< 0,05). Nämä havainnot liittyivät syvemmälle kasvain laajennus ja läsnäolo etäpesäkkeiden ( p
< 0,05). MYC -proteiiniekspressio myös yleistyneet suoliston-tyyppinen kuin diffuusi-tyypin kasvaimet ( p
< 0,001). Lisäksi MYC
mRNA ja proteiinin ilmentyminen liittyi merkittävästi sen kopiomäärä ( p
< 0,05). Vahvistus MYC
kopiot liittyi viiveellä ilmaantuvia, suoliston-tyyppinen, kehittynyt kasvain vaiheessa ja läsnäolo kaukainen etäpesäke ( p
< 0,05). Hypometyloidut MYC
promoottori havaittiin 86,4% kasvaimen näytteistä. MYC
hypometylaatio liittyi diffuusi-tyyppinen, kehittynyt kasvain vaiheessa syvempi kasvain laajennus, ja läsnäolo imusolmuke etäpesäke ( p
< 0,05). Lisäksi kahdeksantoista kasvain näytteet esitellään vähintään yksi tunnettu mutaatio. Läsnäolo MYC
mutaatioita liittyi diffuusi-tyypin kasvain ( p
< 0,001). Tuloksemme osoittivat, että MYC
sääntelyn purkamista lähinnä liittyy huono ennustetekijöiden ominaisuuksia ja myös vahvistanut läsnäolon eri reittejä mukana suoliston-tyypin ja hajanainen-tyypin mahasyövän. Täten havaintomme osoittavat, että Myc
voi olla käyttökelpoinen markkeri kliiniseen kerrostuminen ja ennustetta.

Citation: de Souza CRT, Leal MF, Calcagno DQ, Costa Sozinho EK, Borges jk, Montenegro RC, et ai. (2013) MYC
vapauttaminen mahasyövän ja sen kliinispatologiset vaikutukset. PLoS ONE 8 (5): e64420. doi: 10,1371 /journal.pone.0064420

Editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japani

vastaanotettu: 30 tammikuu 2013; Hyväksytty: 12 huhtikuu 2013; Julkaistu: 22 toukokuu 2013

Copyright: © 2013 de Souza et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ovat kiitollisia Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq; CRTdS, AKCRdS, SEBdS, RRB ja MdACS) ja Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, DQC ja MFL), jotka tukevat tätä tutkimusta apurahojen. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mahasyöpä on neljänneksi yleisin syöpä ja se on edelleen toiseksi suurin syy syöpään liittyvät kuolemat maailmanlaajuisesti [1]. Tämä syöpä diagnosoidaan yleensä klo vaiheissa ja yksittäinen parantavaa hoitoa saatavilla edellyttää kirurginen resektio [2]. Siten mahasyöpä on vakava kansanterveydellinen ongelma maailmassa. Parannettu ymmärrystä biologian tämä kasvain on kriittinen ja se voi olla hyödyllistä ohjata potilaan hoidossa, sekä kehittää uusia terapeuttisia vaihtoehtoja.

MYC
on yksi tutkittu onkogeenien aiheutuvia sen yhdessä suuren määrän sairauksia [3]. MYC on rooli useissa perustehtävä solubiologian, säätely mukaan lukien solujen kasvua ja lisääntymistä, aineenvaihduntaa, erilaistuminen, apoptoosi ja angiogeneesi (katsausta varten katso [4], [5]). Siksi MYC on integraattorina solunulkoisia ja solunsisäisiä signaaleja, ja sen solu- fenotyyppi riippuu kudosten sijainti [6], [7]. Ei ole yllättävää, vapautuminen MYC toimintojen myötävaikuttaa kasvaimen fenotyypin.

MYC
sääntelyn takia geenimonistukseen [8], [9], kromosomi translokaatio tai insertio [10], [11] mutaatiot [12], ja epigeneettiset muutokset [13], [14], on raportoitu erilaisia ​​syöpiä, erityisesti mahasyövän. MYC ilme on usein koholla tai vapautettiin ihmisen kasvaimet [4], ja näyttää olevan risteyskohdassa useita tärkeitä reittejä ja prosessien karsinogeneesissä [15], joka on keskeinen tapahtuma mahasyövän [9]. Aiemmin ryhmämme osoittivat, että MYC
mRNA ilmaisun ja kopion numero kasvaa aikana peräkkäiset vaiheet suoliston-tyyppinen mahasyövän ei-apinoilla [16], mikä viittaa siihen, että MYC
voi olla mukana mahakasvaimen aloittamista ja etenemiseen.

ymmärtäminen MYC
biologia on ensiarvoisen tärkeää valaista rooliaan patogeneesissä mahasyövän. Ajan tasalla, ei ole olemassa tutkimus korreloivat MYC
mutaatio, vahvistus, proteiini /mRNA-tasoja, ja metylaation tässä neoplasia. Täällä me arvioida suhdetta MYC
muutoksia ja kliinis-mahasyövän. Lisäksi MYC
mRNA ilmaisun ja proteiinin immunoreaktiivisuus, sekä useita molekyylitason mekanismeja aiemmin liittyvät sen sääntelyn purkamisesta kopioluvun vaihtelu (CNV), mutaatio, ja DNA: n metylaatio, analysoitiin samojen mahasyövän näytteitä.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Kaikki näytteet olivat peräisin kirjallisen tietoon perustuvan suostumuksen ja hyväksynnän yliopistollisen sairaalan (Belém, Pará, Brasilia) eettinen tarkastuslautakunta ( protokolla numero: 142004).

Kliiniset näytteet

125 mahalaukun adenokarsinoomaa ja 67 vastaavat ei-neoplastisia mahalaukun kudokset (kontrolli näytteet) saatiin kirurgisesti potilailta on João de Barros Barreto University Hospital Parán valtion, Brasilia. Kaikki koehenkilöt ei altistettu joko kemoterapian tai sädehoidon ennen leikkausta. Mahalaukun kasvaimet luokiteltiin Lauren [17] ja kasvaimia lavastettuja käyttäen standardia kriteerit TNM lavastus [18]. Kliinis on esitetty taulukossa 1 ja 2.

Leikellyt kasvain ja valvonta Näytteet pakastettiin nopeasti nestemäisessä typessä kunnes nukleiinihappojen puhdistamiseen. Toinen osa samaa kudosten oli formaliinilla kiinnitetyt ja parafiiniin. Fluoresoivaan in situ
-hybridisaatio (FISH) määritys, jäljellä kasvaimen näyte eriteltynä kuten aiemmin on kuvattu [19].

MYC immunoreaktiivisuus

immunohistokemiallinen analyysit MYC-proteiinia oli suoritettiin 125 formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut kasvaimen osia. Immunohistokemiallinen värjäys suoritettiin Calcagno et al.
[10]. Kasvainkudossektioista (3 tai 4 mm paksu) poistettiin parafiini ksyleenillä ja rehydratoitiin luokiteltujen sarjojen etanolia. Sen jälkeen kun lämmön epitooppisup- haku, kudoksen leikkeitä inkuboitiin ensisijaisen hiiren monoklonaalinen vasta-aine MYC (laimennus 1:50; sc-40, Santa Cruz Biotechnology, USA ja Zymed®, USA). Universaali peroksidaasi-konjugoidun sekundaarisen vasta-aineen kit (LSAB System, DakoCytomation, USA) käytettiin tunnistusjärjestelmä. Käytimme 3,30-diamino-bentsidiinin /H _{2O 2 (DakoCytomation, Tanska) Kromogeenin ja hematoksyliinillä kuin vastavärinä. Jokainen tumaväriä tai ilman sytoplasmista värjäytymistä katsottiin positiivinen tulos riippumatta intensiteetin. Myc-positiivinen tapaus määriteltiin yhdeksi jolla 10% tai enemmän kasvainsoluja positiivisia tämän proteiinin.}

Nukleiinihappojen uutto

genominen DNA (gDNA) eristettiin käyttäen QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Saksa) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kokonais-RNA uutettiin Tri-reagent® (Life Technologies, USA) valmistajan protokollan. DNA: n ja RNA-pitoisuus ja laatu määritettiin käyttämällä NanoDrop spektrofotometriä (Kisker, Saksa). RNA eheys määritettiin geelielektroforeesilla (1% agaroosi geelejä). Kaikki näytteet säilytettiin -80 ° C: ssa käyttöön asti.

MYC
mRNA: n ilmentymisen

kvantitoimiseksi mRNA-tasoja on MYC
, kokonais-RNA eristettiin 49 pariksi normaalin ja kasvaimen kudoksissa käyttämällä Trizol (Life Technologies, USA). RNA käänteistranskriboitiin käyttäen High-Capacity cDNA Archive Kit mukaan valmistajan protokollan (Life Technologies, USA). Täydentävä DNA monistettiin sitten reaaliaikaisella PCR: llä käyttäen Taqman ostetaan määritykset-on-demand Tuotteet Gene Expression (Life Technologies, USA) on 7500 Fast Real Time PCR (Life Technologies, USA). GAPDH
geeni valittiin sisäisenä kontrollina RNA tulo ja käänteistranskriptio tehokkuutta. Kaikki reaaliaikaiset käänteistranskriptio kvantitatiivinen PCR (RT-qPCR) suoritettiin kolmena kappaleena sekä kohdegeenin ( MYC
: Hs00153408_m1) ja sisäisen valvonnan ( GAPDH
: NM_002046.3).

suhteellinen kvantitointi (RQ) geenin ilmentymisen laskettiin Livak ja Schmittgen [20]. Vastaava kontrollinäyte nimettiin kalibroijana kustakin kasvain.

MYC
kopioluvun

FISH ja qPCR käytettiin arvioimaan MYC
kopioiden määrä alaryhmässä 49 kasvaimia, sama tutkimuksessa käytetty ilmaisua. FISH suoritettiin protokollan Pinkel et al.
[21] kanssa tekemät muutokset Calcagno et al.
[22]. Solut hybridisoitiin Spectrum Orange
Probe (LSI Vysis /Abbott, Inc., IL) ja MYC
geenialueen (8q24.12-q24.13) ja tumat vastavärjättiin 4 ', 6-diamino-2-fenyyli mikroskooppipreparaatin haalistumista estävää. Fluoresenssi havaittiin käyttäen Olympus BX41 fluoresenssimikroskooppia (Olympus, Japani), jossa heräte suodattimet 4 ', 6-diamino-2-fenyyli (260 nm) ja rodamiini (570 mn). Kullekin tapauksessa 200 interphase tumat analysoitiin käyttämällä ASI kuva-analyysi-järjestelmän (Applied Spectral Imaging, Israel). Positiivinen MYC
geeni signaaleja esiintyi punaisia ​​pilkkuja ytimet ja pisteytettiin käyttäen kriteereinä Hopman et al.
[23]. Virheellisten tulkintojen välttämiseksi johtuu teknisestä virheestä, normaali lymfosyyttien ytimet ja normaali mahan kudos käytettiin kontrollina. FISH tulokset esitettiin prosenttiosuutena MYC
monistus solu, jossa me lasketaan solujen prosenttiosuus näytetään 3 tai enemmän signaalit MYC
koetin solu.

qPCR suoritettiin käyttäen kvantitatiivista TaqMan CNV määrityksissä (Life Technologies, USA) MYC
geeni (Hs01764918_cn) sekä sisäisen valvonnan RNaasia P
(Ƹ3326). Multiplex qPCR reaktiot suoritettiin neljänä rinnakkaisena kanssa gDNA mukaan valmistajan protokollaa ja pyöräily olosuhteet 7500 Fast Real-Time PCR (Life Technologies, USA). Suhteellinen kopioluku arvioitiin kunkin näytteen käyttämällä Copy Caller Software V1.0 (Life Technologies, USA). Kaupalliset ihmisen gDNAs (G1521 ja G1471, Promega, USA) käytettiin kalibrointiin.

MYC
metylaatio

mety- ja taajuus MYC
promoottori arvioitiin 125 kasvaimia ja 67 sovitettua kontrolli näytteitä metyyli-PCR (MSP) kuten aiemmin on kuvattu [24]. gDNA (2 ug) kaikista näytteistä muutettiin vetysulfiittikäsittelyä, muuntaa metyloitumattomat sytosiinit urasiilit ja jättää metyloidut cytosins ennallaan [25]. Spesifisiä alukkeita MYC
promoottori olivat seuraavat: F5'-TAGAATTGGATTGGGGTAAA-3 'ja R5'-CCAACCAAAAATCAACATGAAT-3' varten metyloitumattomalla reaktioita (odotettu tuotteen koko 291 bp); F5'-TAGAATTGGATCGGGGTAAA-3 'ja R5'-CGACCGAAAATCAACGCGAAT-3' metyloidulle reaktioita (odotettu tuotteen koko 290 bp), kun edellinen on kuvattu [26].

PCR-reaktiot suoritettiin 0,1 umol /L dNTP, 2 umol /l MgCl _{2, 0,5 umol alukkeita, 1,25 U Taq-DNA-polymeraasia ja 100 ng bisulfiitti-modifioitua DNA: ta. Alkuvaiheen denaturaatio 5 minuutin ajan 94 ° C: ssa, 40 sykliä 9 4 ° C: ssa 45 s, 52,4 ° C: ssa 45 s, ja 72 ° C: ssa 30 s tehtiin, minkä jälkeen suoritettiin lopullinen pidennys 5 minuutin ajan 72 ° C. PCR-tuotteet suoraan ladattiin 3% agaroosigeeleillä ja elektroforeesi. Geeli värjättiin SYBR® Safe DNA Gel Stain (Life Technolgies, USA) ja sitä näkyviksi UV valaistus. Positiivisena kontrollina kaikki MSP reaktioista gDNA näyte oli täysin metyloitu käyttäen CpG-metylaasilla (SSSI, New England Biolabs, USA) noudattaen valmistajan ohjeita. Lisäksi alukkeet villityypin niitä käytetään mittaamaan täydellisen konversion DNA saadaan bisulfiittireaktion.}

Näytteet ositettu, kuten: 1) hypometyloidut näytteitä positiivinen vahvistus tuote havaittiin ainoastaan ​​PCR-spesifisiä alukkeita for metyloimaton sekvenssit; 2) hypermetyloitunut näytteitä positiivinen vahvistus havaittiin ainoastaan ​​PCR erityisiä alukkeita metyloitu sekvenssit; 3) osittainen metyloitua näytteitä positiivinen vahvistus havaittiin PCR kahden alukkeen sarjaa.

MYC
genotyypin

kolme eksonia MYC
geeni valittiin mutaation analyysi kaikissa 125 mahasyövän näytteitä. Seuraavia alukkeita suunniteltiin PCR-monistus ja sekvensointi: eksoni 1 F5'-TTTATAATGCGAGGGTCTGGA-3 'ja R5'-GCATTCGACTCATCTCAGCA-3' (odotettu tuotteen koko 654 bp); eksoni 2 F5'-CTGCCTCCCGCTTTGTGT-3 'ja R5'-TTTGATGAAGGTCTCGTCGT-3' (odotettu tuotteen koko 423 bp), F5'-TGGGAGGAGACATGGTGAA-3 'ja R5'-TGCCAATGAAAATGGGAAAG-3' (odotettu tuotteen koko 507 bp); eksoni 3 F5'-TGTCCAGAGACCTTTCTAACGTAT-3 'ja 5'-CCGTAGCTGTTCAAGTTTGTG-3' (odotettu tuotteen koko 663 bp), 5'-TGTCCGTCCAAGCAGAGG-3 'ja 5'-TGATGAAAACAAACAGGGATG-3' (odotettu tuotteen koko 639 emäsparia).

PCR-reaktiot suoritettiin 0,1 umol /l dNTP, 2 umol /l MgCl _{2, 0,5 umol /l alukkeita, 1 U Taq-polymeraasia ja 100 ng DNA: ta. PCR-olosuhteet olivat 95 ° C: ssa 10 min, mitä seurasi 35 sykliä 1 min denaturaatio 95 ° C: ssa, 1 min hehkutus lämpötila (joka vaihtelee 59-61 ° C), ja 1 minuutin pidennys 72 ° C: ssa. Amplikonien erotettiin 2% agaroosigeelissä, värjättiin SYBR® Safe DNA Gel Stain (Life Technolgies, USA), ja sitä visualisoitiin UV-valaisun.}

Amplikonit sekvensoitiin käyttäen Sanger menetelmällä [27]. Suora sekvensointi suoritettiin käyttäen Big Dye® Terminatorv3.1 Cycle Sequencing Kit (Life Technologies, USA) ja analysoitiin ABI PRISM® 3130 Genetic Analyzer (Life Technologies, USA) käyttäen Pop 7 polymeeriä. In silico mutaatio Haku suoritettiin käyttäen täyteläisyyden Pro 1.5 (Technelysium Pty Ltd, Australia). Viitesekvenssi oli Gene ID: 4609 (NCBI). Variantit, joissa on vähemmän kuin 1% vähäisiä alleelin frekvenssi on raportoitu. Patogeenisyyden missensemutaatioita arvioitiin in silico analyysi käyttäen PolyPhen (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph/) ja SEULOA (http://sift.jcvi.org).

Tilastollinen analyysi

MYC
metylaatio, mutaatio, tai sen tuotteiden immunoreaktiivisuus kerroinsuhde (OR) varten clinicophatological ominaisuuksia arvioitiin logistisella regressiolla. Ikä, mahalaukun kudoksesta näytteenotto määriteltiin kovariaattina on regressiomalli.

normaalius jakelu määrällisten muuttujien testattiin Shapiro-Wilkin testi. Tiedot, joita ei normaalisti jakautunut transformoitiin (z-muunnos) osaksi normaalijakaumaa analysoitavaksi. Analyysi MYC
mRNA ilmaisun ja kopioluvun suoritettiin yleisen Linear Model (GLM) korjattuna iän, joka antaa vaikutuksen koko ja havaittu teho (OP) kunkin analyysin. Vaikutus koko GLM analyysit perustui Eta Squared (η ^{2), jossa 0,15 ja alle määritettiin pieni vaikutus koko, 0,16-0,40 mediana vaikutus koko, ja yli 0,40 suurena vaikutus koko.}

korrelaatio mRNA ilmaisun ja kopioluvun analysoitiin Pearson koe, jossa arvo sen korrelaatiokerroin (r) alle 0,30 määritettiin heikko korrelaatio, 0,30-,70 mediana korrelaatio, ja edellä 0.70 niin vahva korrelaatio.

kaikissa analyyseissä, luottamusväli oli 95% ja p
arvot alle 0,05 pidettiin merkittävinä.

Tulokset

MYC
vahvistusta tiedetään liittyvän proteiinipitoista /mRNA: n ekspression mahasyövän [28], mutta parhaan tietomme mukaan joitakin tutkimuksia on tehty kuvaamaan roolia metylaation ja MYC
mutaatiot tässä prosessissa. Tämän tavoitteen saavuttamiseksi, analysoimme 125 tapausta, joissa 68% oli miehiä ja 32% oli naisia. Keskimääräinen ikä näytteen sarja oli 62 vuotta (vaihteluväli on 26-89 vuotta). Hieman korkeampi taajuus suoliston-tyyppinen (56,8%) ja ei-cardic (58,4%) kasvaimia havaittiin (taulukko 1 ja 2).

MYC ydin- proteiinin havaittiin positiivinen 76,8% (96/125) mahalaukun kasvaimet (kuvio 1). MYC-proteiinin ekspressio havaittiin useammin suolen-tyypin kuin diffuusi-tyypin kasvaimet ( p
< 0,001, OR = 7,856, CI 95% = 2,803-+22,013) (taulukko 1). MYC immunovärjäyksellä liittyi myös viiveellä ilmaantuvia (p = 0,026, OR = 3,276; CI 95% = 1,152-9,315), syvempi kasvain laajennus ( p
= 0,045, OR = 2,975, CI 95% = 1,027 -8,623), ja läsnäolo kaukainen etäpesäke ( p
< 0,001, OR = 17,682, CI 95% = +3,914-79,882) (taulukko 1). Futhermore, MYC immunoreaktiivisuus liittyi lisääntynyt mRNA: n ilmentymisen ( p
= 0,003, η ^{2 = 0,178, OP = 0.870) ja MYC
kopioluvun FISH ( p
= 0,009, η 2 = 0,139, OP = 0,759) ja qPCR ( p
= 0,003, η 2 = 0,177, OP = 0,869) (taulukko 1).}

ilmaisu taso MYC
mRNA oli korkeampi kaikissa tuumorinäytteissä kuin niiden pariksi ohjaimet (RQ = 3,39 ± 0,14; valikoima 1,57-5,18). Lisääntynyt MYC
mRNA ilmentyminen liittyi syvemmälle kasvain laajennus ( p
= 0,006, η ^{2 = 0,152, OP = 0,801), läsnäolo imusolmuke etäpesäke ( p
= 0,023, η 2 = 0,107, OP = 0,632), ja kaukainen etäpesäke ( p
< 0,001, η 2 = 0,788, OP = 1) (taulukko 2 ). Lisäksi mRNA taso korreloi suoraan MYC
kopioluvun ( p
< 0,01; r = 0,716).}

Gain MYC
kopiota löydettiin kaikista mahalaukun adenokarsinooman näytteistä FISH ja qPCR määrityksissä. FISH, keskimääräinen solujen prosenttiosuus esitetään MYC
vahvistus oli 72,1% (alueella 50-83,5% solujen vahvistus) (kuvio 2 A ja B). Keskiarvo MYC
kopioita qPCR oli 4,5 (vaihteluväli 3-9 kopiota) (kuva 2 C).

FISH ja qPCR analyysit osoittivat, että lisääntynyt MYC
kopioiden määrä liittyi myöhään ilmenevää ( p
< 0,001; η ^{2 = 0,257, OP = 0,976; p
= 0,025; η 2 = 0,103, OP = 0,662, tässä järjestyksessä), suoliston-tyyppinen syöpä ( p
= 0,037; η 2 = 0,091, OP = 0,557; p
= 0,009; η 2 = 0,139, OP = 0,762, vastaavasti), ja läsnäolo kaukainen etäpesäke ( p
= 0,001; η 2 = 0,221, OP = 0,942; p
< 0,001; η 2 = 0,356, OP = 0,999, tässä järjestyksessä). Lisäksi MYC
monistamisen FISH liittyi kehittynyt kasvain vaiheessa ( p
= 0,037; η 2 = 0,091, OP = 0,558), mutta vain kaksi aikaisin kasvaimia analysoidaan tässä osajoukko näytteistä (taulukko 2).}

Kaikki mahasyövän näytteet esitellään positiivinen vahvistus kanssa metyloimattoman alukesarjan. Mielenkiintoista, 86,4% syövän näytteitä hypometyloidut. Toisaalta, kun läsnä on metyloitumattoman sekvenssien MYC
promoottorin todettiin 28,4% kontrollinäytteiden (osittain metyloitu näytettä), mikä viittaa siihen, menetys metylaation näissä näytteissä (kuvio 3). Alukkeet n spesifisyys ja MSP tulokset vahvistettiin käyttäen bisulfiitin sekvensointia PCR (BSP) lähestymistapa [29], jossa me satunnaisesti valittua viittä hypometyloidut näytettä; viisi hypermetyloitunut näytettä ja viisi osittain metyloitu näytettä (tuloksia ei ole esitetty). MYC
hypometylaatio havaittiin useammin in diffuusi-tyypin verrattuna suoliston-tyyppinen mahasyöpä ( p
= 0,007; OR = 8,554; 95% CI = 01,798-40,695 käyttäen diffuusi-tyyppiä kuin vertailuryhmän). Lisäksi MYC
hypometylaatio liittyi kehittynyt kasvain vaiheessa ( p
= 0,033; OR = 6,602; 95% CI = +1,162-37,501), syvempi kasvain laajennus ( p
= 0.022; OR = 4,752; 95% CI = +1,257-17,965), ja läsnäolo imusolmuke etäpesäke ( p
= 0,032; OR = 5,12; 95% CI = +1,149-22,814) (taulukko 1).

Mitä tulee geenin sekvensointi, ei uuden mutaation havaittiin mahalaukun kasvaimet. Kolmetoista (10,4%) kasvainnäytteet esitetään vähintään yksi tunnettu mutaatio, jossa variantit alle 1% pieniä alleelin frekvenssi. Kaikkiaan 18 mutaatiot tunnistettiin, jossa 4 näytettä näytteille yhdessä esiintyvät mutaatiot. Eksonissa 1, viisi kanssa GG ja neljä CG osoitteessa rs117856857; yksi GG at rs73707292; ja neljä CT rs4645949. Eksonissa 2, joka koskee missensemutaatioita kaksi kasvaimia kanna kodonissa 47 johtaa muutos tyrosiinin histidiini (rs114570780; SIFT ennustuksen = haitallisia; PolyPhen ennustuksen = todennäköisesti vahingoittavat), ja kaksi kodonissa 72 johtaa muutos proliini seriini- (rs28933407; SIFT ennustus = siedettyjä PolyPhen ennustus = todennäköisesti vaurioidu). Kaikki kasvain eksonissa 2 esitetään yksi tai kaksi tiedossa eksonissa 1. eksonin 2 mutaatiot havaittiin vain diffuusi-tyyppinen kasvaimia pitkälle. Ei mutaatio tunnistettiin eksonissa 3. läsnäolo tiedossa MYC
mutaatioita liittyi diffuusi-tyypin kasvaimet ( p
= 0,004, OR = 21,717, 95% CI = 2,678-176,111; käyttämällä diffuusi-tyyppiä kuin vertailuryhmän) ja läsnäolo kaukainen etäpesäke ( p
= 0,032, OR = 4,492, 95% CI = 1,141-+17,679).

keskustelu

myc proteiini vaikuttaa noin 15%: n geenien ihmisen genomin [30]. Siten MYC sääntelyn purkaminen voi johtaa muutoksiin eri biologisia reittejä osallisina syövän taudin alkamisen ja etenemisen [5]. Kuitenkin, ajan tasalla, suhde MYC
muutoksia ja kliinis parametreja ei ole täysin ymmärretty. Meidän näytteet esitteli miesten ja naisten suhde 02:01 ja suurin osa potilaista oli yli viisikymmentäviisi. Lisäksi suoliston-tyyppinen mahasyöpä oli yleisempää kuin hajanainen-tyypin ja kasvaimet olivat useammin kuin cardia. Nämä epidemiologista tietoa mukaiset aikaisempien tutkimusten [28], [31] - [33].

kromosomitranslokaation MYC
paikka on hyvin commun Hematopoeettisten syövissä. Kuitenkin kiinteiden ihmisen kasvaimissa, kuten mahasyövän, MYC
muutokset ovat tavallisesti johtuu geenin monistaminen [34]. Lisäksi MYC
on tunnustettu useimmin monistettu proteiinia koodaavan geenin kaikkien syöpätyyppien [35]. Tässä tutkimuksessa havaitsimme kolme tai useampia MYC
geenin kopioita kaikissa mahalaukun kasvaimet tutkittu, jotka vahvistavat aikaisempien tutkimusten ensisijainen mahalaukun kasvaimet yksilöitä väestöstä [10], [28], [36] - [39] sekä Itä-Aasiassa ja Euroopassa [40] - [42]. Myös MYC
monistaminen plasmaan [43] ja mahasyövän solulinjoissa perustettu ryhmämme [44] - [47]. Lisäksi ryhmämme oli havaittu, että klonaalinen korkea monistuminen MYC
on harvemmin hajanainen-tyyppinen kuin suoliston-tyypin ensisijainen mahasyövän [10], [22], [28], ja tämä vahvistettiin tässä tutkimuksessa.

MYC yliekspressio on kuvattu vaihtelee 15,6%: sta 100%: in ensisijainen mahasyövistä [9]. In vitro
tutkimukset tippuu alas MYC ilmentymistä mahasyövässä solulinjoissa osoitti keskeistä roolia MYC ilmaisun mahakasvaimen solujen kasvua, selviytymistä, ja ylläpito tuumorisolun parametreja, jotka voivat myötävaikuttaa pahanlaatuinen potentiaalia [48 ]. Lisäksi Mehndiratta et al.
, [49] osoittivat merkittävää laskua (40%) vuonna MYC ilmentyminen sekä mRNA ja proteiini ja sen loppupään tavoitteet käyttäen siRNA.

Tässä tutkimuksessa, 76,8% mahalaukun kasvaimet osoitti MYC immunoreaktiivisuus ja kaikki kasvaimet, suoliston ja hajanainen tyyppi, esitteli lisääntynyt mRNA ilmaisu verrattuna niiden pariksi valvontaa. Lisäksi havaitsimme, että MYC immunoreaktiivisuus ja lisääntynyt mRNA: n ilmentymisen liittyivät syvemmälle kasvain laajentaminen ja läsnäolo etäpesäkkeitä. Nämä havainnot viittaavat siihen, että MYC on rooli kasvaimen invasiivisuus, etäpesäke, ja siten aggressiivisuus, joka vahvistaa aiemman tutkimuksen [37]. Vaikka jotkut analyyseihin pieni vaikutus koko, nämä havainnot ovat myös sopimukseen aiemman tutkimuksen ryhmämme kädellisten, jossa me osoitti jatkuva kasvu MYC
mRNA ilmaisun ja kopioi numero aikana peräkkäiset vaiheet suoliston-tyyppinen mahasyövän N-metyyli-nitrosoureaan (MNU) hoidetun kädellisten [16]. Toisaalta, mitään yhteyttä välillä MYC ja histologinen luokka, kasvain sijainti, imusolmuke etäpesäke, tai patologinen vaiheessa havaittiin mahalaukun syövän tutkimuksessa kehitetään Kiinan väestöstä [50], vahvistavat, että etnistä ahdistettujen väestöstä voi johtaa biologisesti ja kliinisesti mahasyövän alaryhmiä [51].

Vaikka geenien monistuminen ei välttämättä liittynyt tai joita tarvitaan sen yli-ilmentymisen, meidän tutkimus osoittaa, että MYC immunoreaktiivisuus, MYC
mRNA-tasoja, ja kopioluvun olivat suoraan korreloi.

DNA: n metylaatio on voimakas mekanismi transkription tukahduttaminen. Asianmukainen genomista metylaatiospe- jaksotukseen tulee muuttaneet perinpohjaisesti syöpäsoluissa: molemmat voitot (hypermetylaation) ja tappiot (hypometylaatio) metyloitua sivustoja on havaittu [52], [53]. Hypometylaatio at promoottorit voivat aktivoida poikkeavaa ilmentymistä onkogeenien ja menetys painamista joissakin loci [44]. Toistaiseksi harvat tutkimukset keskustelleet suhde mety- MYC
ja sen vaikutus geenien ilmentyminen ja syöpää aiheuttavia prosesseja. MYC
hypometylaatio aiemmin liittynyt onkogeenisel- etenemisen ja etäpesäkkeiden induktio rottamallissa maksasyövän [54] ja ihmisen peräsuolen syövän näytteitä [55]. Lisäksi MYC
hypometylaatio liittyi myös MYC
ilmentymistä mahan kasvaimissa [26], [56] - [58] ja solulinjat [48]. Emme kuitenkaan pystyneet noudattamaan Merkitsevä yhteys MYC
hypometylaatio ja sen ilmentymistä meidän näytteitä. Muiden tekijöiden ohella tämä puute yhdistys voi johtua läsnäolosta MYC
vahvistusta kaikissa kasvaimissa hypometyloidut promoottorit (86,4% näytteistä) ja siten, peittämällä mahdollinen vaikutus tämän epigeneettiset muutos on MYC
transkription säätelyyn.

Suzuki et al.
[59] aiemmin osoitti, että korkeatasoinen hypometylaatio oli osoitus huonon ennusteen sekä maha- ja paksusuolen syöpä, ja epigeneettiset muutokset olivat ikä riippuvainen, esiintyvien ennen geneettisiä muutoksia. Esillä olevassa tutkimuksessa, jotkut säätimet jo esitelty metyloitumattomia sekvenssit MYC
promoottori. Lisäksi olemme osoittaneet, että MYC
hypometylaatio liittyi aggressiivisemman fenotyypin (kasvain aggressiivisuus, läsnäolo imusolmuke etäpesäke, ja histologiset syöpien). Nämä havainnot viittaavat siihen, että MYC
demetylaatio voidaan kerätä aikana kasvainprogression ja tämä voisi olla yhteinen tapahtuma mahalaukun carinogenesis [60], [61], koska tämä mekanismi on havaittu muiden geenien useissa kasvaintyypeissä [ ,,,0],62], [63]. Kuten jo ehdotettu DNA hypermetylaation [64], promoottori hypometylaatio voidaan käyttää uuden sukupolven biomarkkereita ja omistaa ja ennustavia lupauksen Lääkäreille.

parhaan tietomme, MYC
geenin eksonien ole koskaan täysin sekvensoitu ihmisen mahalaukun kasvaimet. Täällä sekvensoitiin kolme eksonia MYC
: eksoni 1 on ei-koodaavan proteiinia, eksonit 2 ja 3 ovat proteiinia koodaavan [katsausta varten katso (Pelengaris & Khan, 2003)]. Emme löytäneet mitään uutta mutaatiota, mutta havaitsimme, että 4 kasvaimia esitetään missensemutaatioita (rs114570780 ja rs28933407) on eksonin 2. Nämä mutaatiot olivat evoluution konservoitunut sekvenssi MYC
: transaktivointidomainien domain [4] , [65]. Lisäksi molemmat tunnistetut mutaatiot katsottiin todennäköisesti vahingoittavat mukaan PolyPhen ohjelmiston. Muutos proliini seriini- kodonissa 72 oli myös aiemmin raportoitu patogeenisen muunnos NCBI dbSNP tietokanta (http://omim.org/). Siten molemmat mutaatiot eksonin 2 voivat vaikuttaa MYC toimintaa mahan kasvaimissa. Lisäksi läsnäolo MYC
mutaatioita liittyi kaukainen etäpesäke. Kuitenkin lisätutkimukset ovat tarpeen selventää, jos MYC
mutaatiot ovat rooli metastaattisen prosessin.

mukaan Laurén luokitusta, mahalaukun adenokarsinooman luokitellaan pääasiassa osaksi suoliston ja hajanainen tyypit [17]. Suoliston-tyyppinen mahasyöpä etenee läpi useita peräkkäisiä vaiheita, jotka alkavat atrofinen gastriitti seurasi suoliston metaplasiasta intraepitelial neoplasia, ja karsinooma [66]. Toisaalta, diffuusi-tyyppiä ei yleensä kehittyä syövän esiasteita [67], [68]. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että suoliston-tyyppinen esitteli useammin MYC immunoreaktiivisuus sekä suurempi määrä MYC
kopioita kuin diffuusi-tyyppinen kasvaimia, jotka vahvistavat aiempien tutkimusten ryhmämme [10] , [22], [28], [38]. Lisäksi MYC
hypometylaatio ja pistemutaatioita olivat useammin havaittiin diffuusi-tyypin verrattuna suoliston-tyypin kasvaimet. Siten meidän havainnot tukevat, että nämä kaksi histologinen alatyyppi seurata erilaisia ​​geneettisiä reittejä ja voi olla kaksi erillistä yksikköä [67].

Yhteenvetona tietomme viittaavat siihen, että MYC
yli-ilmentymisen ja promoottori hypometylaatio voi olla rooli mahasyövän prosessi. MYC
sääntelyn purkamista liittyi pääasiassa huonosta ennustetekijöitä ominaisuuksia. Tuloksemme vahvistavat myös esiintyy erilaisia ​​reittejä mukana suoliston-tyypin ja hajanainen-tyypin mahasyövän. Siten meidän tulokset viittaavat siihen MYC voi olla käyttökelpoinen markkeri kliiniseen kerrostuminen ja ennustetta.

• PLoS ONE: Discovery kasvainmarkkerien mahasyövän by Proteomiikka
• PLoS ONE: mahasyövän Pystytysympäristö Dual Energy Spectral CT Imaging