PLoS ONE: MYC Deregulation in Magenkrebs und seine Clinicopathological Implications

Abstrakt

Unsere Studie untersuchte die Beziehung zwischen MYC
Veränderungen und klinisch-pathologischen Eigenschaften in Magenkrebs. Wir untersuchten die Wirkung von MYC
mRNA-Expression und seine Protein-Immunreaktivität sowie Kopienzahl Variation, Promotor-DNA-Methylierung und Punktmutationen, in 125 Adenokarzinom des Magens und 67 paried nichtneoplastische Geweben. Wir beobachteten, dass 77% der MYC Immunreaktivität präsentiert Tumoren, die signifikant mit einer erhöhten mRNA-Expression assoziiert war ( p
< 0,05). Diese Beobachtungen wurden mit tiefer Tumorausdehnung und das Vorhandensein von Metastasen ( p
< 0,05) zugeordnet ist. MYC Protein-Expression wurde ebenfalls häufiger in Darm-Typ beobachtet als bei diffusem Typ-Tumoren ( p
< 0,001). Zusätzlich MYC
mRNA und Protein-Expression signifikant mit seiner Kopienzahl assoziiert waren ( p
< 0,05). Die Verstärkung von MYC
Kopien wurde mit late-onset, Darm-Typ, fortgeschrittenen Tumorstadium, und das Vorhandensein von Fernmetastasen ( p
< 0,05) assoziiert. Ein hypomethylierten MYC
Promotor wurde in 86,4% der Tumorproben nachgewiesen. MYC
hypomethylation wurde mit diffuser-Typ, fortgeschrittenen Tumorstadium, tiefer Tumorausdehnung und das Vorhandensein von Lymphknotenmetastasen ( p
< 0,05) assoziiert. Außerdem präsentiert achtzehn Tumorproben mindestens eine bekannte Mutation. Die Anwesenheit von MYC
Mutationen wurde mit diffuser-Typ Tumor-assoziierte ( p
< 0,001). Unsere Ergebnisse zeigten, dass MYC
Deregulierung vor allem mit schlechter Prognose Funktionen verbunden war und verstärkt auch die Anwesenheit von verschiedenen Wegen in Darm-Typ beteiligt und diffus-Typ Magen-Karzinogenese. So sind unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass MYC
für klinische Schichtung und die Prognose ein nützlicher Marker sein kann

Citation:. De Souza CRT, Leal MF, Calcagno DQ, Costa Sozinho EK, Borges BdN, Montenegro RC, et al. (2013) MYC
Deregulation in Magenkrebs und seine Clinicopathological Implikationen. PLoS ONE 8 (5): e64420. doi: 10.1371 /journal.pone.0064420

Editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japan

Received: 30. Januar 2013 beginnen; Akzeptiert: 12. April 2013 beginnen; Veröffentlicht am: 22. Mai 2013

Copyright: © 2013 de Souza et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Die Autoren sind Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico dankbar (CNPq; CRTD, AKCRdS, SEBdS, RRB und MDACS) und Fundação de Amparo à Pesquisa Estado de São Paulo (FAPESP; DQC und MFL) zu tun, die diese Studie als Zuschüsse und Stipendien unterstützen. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Magenkrebs ist die vierthäufigste Krebsart und bleibt die zweithäufigste Ursache von Krebs-Todesfälle weltweit [1]. Dieser Krebs ist in der Regel in einem fortgeschrittenen Stadium diagnostiziert und die einzige kurative Therapie erfordert verfügbar chirurgische Resektion [2]. Somit ist Magenkrebs ein ernstes Problem der öffentlichen Gesundheit in der Welt. Ein besseres Verständnis der Biologie dieser Neubildung ist kritisch und kann nützlich sein, Patienten-Management zu führen, sowie neue Therapiemöglichkeiten zu entwickeln.

MYC
ist eine der am besten untersuchten Onkogenen stamm von seiner Verbindung mit einer großen Anzahl von Krankheiten, [3]. MYC spielt eine Rolle in mehreren grundlegenden Funktionen der Zellbiologie, einschließlich der Regulation von Zellwachstum und Proliferation, Metabolisierung, Differenzierung, Apoptose und Angiogenese (für eine Übersicht siehe [4], [5]). Daher MYC ist ein Integrator von extrazellulären und intrazelluläre Signale und seinen zellulären Phänotyp ist auf Gewebeort dependent [6], [7]. Nicht überraschend, die Deregulierung der MYC-Funktionen trägt zur Tumorphänotyp.

MYC
Deregulierung aufgrund Genamplifikation [8], [9], chromosomale Translokation oder Einfügung [10], [11] Mutationen [12] und epigenetischen Veränderungen [13], [14] wurde in verschiedenen Arten von Krebserkrankungen, insbesondere bei Magenkrebs berichtet. MYC-Expression wird häufig erhöht oder in menschlichen Tumoren dereguliert [4], und scheint an der Kreuzung von mehreren wichtigen Wege und Prozesse in der Karzinogenese beteiligt zu sein [15], ein wichtiges Ereignis in der Karzinogenese des Magens zu sein [9]. Zuvor zeigten unsere Gruppe, dass MYC
mRNA-Expression und die Kopienzahl erhöht sich während der aufeinanderfolgenden Schritte Darm-Typ Magen-Karzinogenese in einem nicht-menschlichen Primatenmodell [16], was darauf hindeutet, dass MYC
kann sein beteiligt in Magentumor Initiierung und Progression.

Das Verständnis von MYC
Biologie ist von größter Bedeutung, ihre Rolle in der Pathogenese von Magenkrebs aufzuklären. Bis heute gibt es keine Studie korreliert MYC
Mutation, Verstärkung, Protein /mRNA-Spiegel und Methylierung in dieser Neoplasien. Hier untersuchten wir die Beziehung zwischen MYC
Veränderungen und klinisch-pathologischen Eigenschaften in Magenkrebs. Darüber hinaus MYC
mRNA-Expression und Protein-Immunreaktivität sowie mehrere molekulare Mechanismen zuvor in Zusammenhang mit ihrer Deregulierung als Kopienzahl Variation (CNV), Mutation und DNA-Methylierung, wurden in der gleichen Reihe von Magenkrebs analysiert Proben.

Materialien und Methoden

Ethik Statement

Alle Proben mit schriftlicher Einwilligung und Genehmigung von der Universitätsklinik (Belém, Pará, Brasilien) ethischen Begutachtungsverfahren abgeleitet wurden ( Protokollnummer. 142004)

Klinische Proben

125 Adenokarzinom des Magens und 67 entsprechende nicht-neoplastischer Magengewebe (Kontrollproben) wurden von Patienten des João de Barros Barreto University Hospital erhalten chirurgisch in Pará State, Brasilien. Alle Probanden wurden weder auf eine Chemotherapie oder Strahlentherapie vor der Operation ausgesetzt. Magentumoren wurden nach Lauren klassifiziert [17] und Tumoren wurden unter Verwendung von Standardkriterien von TNM inszeniert Inszenierung [18]. Die klinisch-pathologischen Eigenschaften sind in Tabelle 1 und 2

Dissected Tumor und Kontrollproben wurden schnell in flüssigem Stickstoff gefroren, bis die Nukleinsäureaufreinigung gezeigt. Ein weiterer Teil der gleichen Geweben wurde in Formalin fixierten und in Paraffin eingebettet. Für die fluoreszierende in situ
Hybridisierung (FISH) Assay, der verbleibende Tumorprobe aufgeschlüsselt wurde, wie zuvor beschrieben [19].

MYC Immunreaktivität

Immunhistochemische für MYC Protein-Analysen wurden durchgeführt auf 125 Formalin-fixierten, in Paraffin eingebetteten Tumorschnitten. Immunhistochemische Färbung erfolgte nach Calcagno ausgeführt et al.
[10]. Tumorgewebeschnitten (3 oder 4 mm dick) wurden in Xylol und rehydriert in einer abgestuften Reihe von Ethanol entparaffiniert. (; Sc-40, Santa Cruz Biotechnology, USA und Zymed®, USA Verdünnung 1:50) Nach hitzeinduzierten Epitopdemaskierung wurden die Gewebeschnitte mit primären monoklonalen Maus-Antikörper gegen MYC inkubiert. Eine universelle Peroxidase-konjugiertem sekundärem Antikörper-Kit (LSAB System, DakoCytomation, USA) wurde für das Detektionssystem verwendet. Wir verwendeten 3,30-Diamino-Benzidin /H _{2 O 2 (Dakocytomation, Dänemark) als Chromogen und Hämatoxylin als Gegenfärbung. Jede Kernfärbung mit oder ohne zytoplasmatische Färbung wurde als ein positives Ergebnis zu sein, unabhängig von Intensität. Ein MYC-positiven Fall wurde definiert als eine für dieses Protein 10% oder mehr Tumorzellen positiv mit.}

Nukleinsäureextraktion

Die genomische DNA (gDNA) wurde unter Verwendung des QIAamp DNA Mini Kit extrahiert (Qiagen, Deutschland) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Gesamt-RNA wurde mit Tri-reagent® (Life Technologies, USA) nach dem Protokoll des Herstellers extrahiert. DNA und RNA-Konzentration und Qualität wurden unter Verwendung des ND-Spektrophotometer (Kisker, Deutschland) bestimmt. RNA-Integrität wurde durch Gelelektrophorese (1% Agarose-Gelen) bestimmt. Alle Proben wurden bei -80 ° C bis zur Verwendung gelagert.

MYC
mRNA Expression

mRNA Niveaus der quantitativ zu bestimmen MYC
, Gesamt-RNA isoliert wurde, von 49 gepaart normalen und Tumorgeweben unter Verwendung von Trizol (Life Technologies, USA). Die RNA wurde revers transkribiert die High-Capacity cDNA Archive Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers (Life Technologies, USA). Komplementäre DNA wurde dann durch Echtzeit-PCR unter Verwendung der TaqMan-Sonden gekauft als Assays-on-Demand-Produkte für die Genexpression (Life Technologies, USA) auf einem 7500 Fast Real Time PCR (Life Technologies, USA). GAPDH
Gen wurde als interne Kontrolle für die RNA-Eingang ausgewählt und die Transkriptionseffizienz umkehren. und die interne Kontrolle ( GAPDH
: NM_002046.3): Alle Echtzeit-Reverse Transkription quantitative PCR (RT-qPCR) wurden in dreifacher Ausführung für beide Zielgens (Hs00153408_m1 MYC
) durchgeführt.

Relative Quantifizierung (RQ) der Genexpression wurde gemäß Livak und Schmittgen berechnet [20]. Die entsprechende Kontrollprobe als Kalibrator von jedem Tumor bezeichnet wurde.

MYC
Nummer des Exemplars

FISH und qPCR wurden verwendet, um zu auswerten MYC
Kopienzahl in einer Untergruppe von 49 Tumoren in die Untersuchung der Expression verwendet gleich. FISH wurde nach dem Protokoll von Pinkel ausgeführt et al.
[21] mit Änderungen von Calcagno eingeführt et al.
[22]. Die Zellen wurden hybridisiert mit Spectrum orange und Probe (LSI Vysis /Abbott, Inc., IL) für die MYC
Genregion (8q24.12-q24.13) und Kerne wurden counterstained mit 4 ', 6-Diamidino-2-phenylindol Antifade. Die Fluoreszenz wurde ein Olympus BX41 Fluoreszenzmikroskop (Olympus, Japan) mit Anregungsfilter für 4 'detektiert unter Verwendung von 6-diamidino-2-phenylindole (260 nm) und Rhodamin (570 Mio). Für jeden Fall wurden 200 Interphase-Kernen mit einem ASI-Bildanalysesystem (Applied Spectral Imaging, Israel) untersucht. Positiv MYC
Gensignalen erschienen als rote Flecken in den Kernen und wurden anhand der Kriterien von Hopman erzielte et al.
[23]. Um Fehlinterpretationen zu vermeiden aufgrund technischer Fehler, normale Lymphozytenkerne und normale Magen-Gewebe als Kontrolle verwendet wurden. Die FISH Ergebnisse wurden als Prozentsatz der präsentierte MYC
Verstärkung durch eine Zelle, in der wir den Prozentsatz der Zellen berechnet zeigt 3 oder mehr Signale für die MYC
Sonde durch Zelle.

qPCR wurde mittels quantitativer TaqMan CNV-Assays durchgeführt (Life Technologies, USA) für die MYC
Gen (Hs01764918_cn) und für die interne Kontrolle RNAse P
(Ƹ3326). Multiplex qPCR Reaktionen wurden in vierfacher Ausfertigung mit gDNA erfolgt nach dem Protokoll des Herstellers und Zyklusbedingungen in 7500 Fast Real-Time PCR (Life Technologies, USA). Die relative Kopienzahl wurde für jede Probe mit der Copy Caller Software V1.0 (Life Technologies, USA) geschätzt. Kommerzielle menschliche gDNAs (G1521 und G1471, Promega, USA) wurden für die Kalibrierung verwendet

MYC
Methylierung

Das Methylierungsmuster und Frequenz des MYC Promotor wurden in 125 Tumoren und 67 angepaßten Kontrollproben durch Methyl spezifische PCR (MSP), wie zuvor beschrieben [24] untersucht. gDNA (2 ug) aller Proben wurde durch Bisulfit-Behandlung modifiziert, nicht methylierten Cytosine zu urazile Umwandlung und methylierte cytosins unverändert [25] zu verlassen. Spezifische Primer für die MYC
Promoter waren wie folgt: F5'-TAGAATTGGATTGGGGTAAA-3 'und R5'-CCAACCAAAAATCAACATGAAT-3' für den nicht methylierten Reaktionen (erwartete Produktgröße von 291 bp); F5'-TAGAATTGGATCGGGGTAAA-3 'und R5'-CGACCGAAAATCAACGCGAAT-3' für die methylierte Reaktionen (erwartete Produktgröße von 290 bp), wie frühere beschrieben [26].

PCR-Reaktionen wurden mit 0,1 durchgeführt mmol /l dNTPs, 2 &mgr; mol /l MgCl _{2, 0,5 umol Primer, 1,25 U Taq-DNA-Polymerase und 100 ng Bisulfit-modifizierte DNA. Nach der anfänglichen Denaturierung für 5 min bei 94 ° C, 40 Zyklen bei 9 4 ° C für 45 s, 52,4 ° C für 45 s und 72 ° C für 30 s durchgeführt, gefolgt von einer abschließenden Verlängerung gefolgt für 5 min bei 72 ° C. PCR-Produkte wurden auf 3% Agarosegelen elektrophoresiert und direkt geladen. Das Gel wurde mit SYBR® sicherer DNS-Gel Stain (Life Technolgies, USA) gefärbt und direkt unter UV-Beleuchtung sichtbar gemacht. Als positive Kontrolle aller MSP Reaktionen war eine gDNA Probe vollständig methylierte CpG Methylase mit (SssI, New England Biolabs, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers. . Des Weiteren wurden die Primer für die Wildtyp verwendet vollständige Umwandlung von DNA in der Bisulfit-Reaktion erhalten überwachen}

Proben wurden als geschichtete: 1) Proben hypomethyliert wenn positive Amplifikationsprodukt nur in der PCR mit spezifischen Primern nachgewiesen wurde für nicht-methylierten Sequenzen; 2) Proben hypermethyliert wenn positive Amplifikation nur in der PCR mit spezifischen Primern für methylierte Sequenzen festgestellt wurde; 3) Teil methylierte Proben, wenn eine positive Verstärkung in der PCR mit den beiden Primersätze erkannt wurde.

MYC
Genotyping

Die drei Exons des MYC
Gen wurden für die Mutationsanalyse in allen 125 Magenkrebs Proben ausgewählt. Die folgenden Primer wurden für die PCR-Amplifikation und Sequenzierung entwickelt: Exon 1 F5'-TTTATAATGCGAGGGTCTGGA-3 'und R5'-GCATTCGACTCATCTCAGCA-3' (erwartete Produktgröße von 654 bp); 2 Exon F5'-CTGCCTCCCGCTTTGTGT-3 'und R5'-TTTGATGAAGGTCTCGTCGT-3' (erwartete Produktgröße von 423 bp), F5'-TGGGAGGAGACATGGTGAA-3 'und R5'-TGCCAATGAAAATGGGAAAG-3' (erwartete Produktgröße von 507 bp); Exon 3 F5'-TGTCCAGAGACCTTTCTAACGTAT-3 'und 5'-CCGTAGCTGTTCAAGTTTGTG-3' (erwartete Produktgröße von 663 bp), 5'-TGTCCGTCCAAGCAGAGG-3 'und 5'-TGATGAAAACAAACAGGGATG-3' (erwartete Produktgröße von 639 bp).

Die PCR-Reaktionen wurden mit 0,1 &mgr; mol /l dNTPs durchgeführt wird, 2 &mgr; mol /l MgCl _{2, 0,5 &mgr; mol /L von Primern, 1 U Taq-Polymerase und 100 ng der DNA. Die PCR-Bedingungen waren 95 ° C für 10 min, gefolgt von 35 Zyklen von 1 min Denaturierung bei 95 ° C, 1 min Annealing-Temperatur (im Bereich von 59 bis 61 ° C) und 1 min Extension bei 72 ° C. Die Amplifikate wurden auf einem 2% Agarosegel mit SYBR® Sichere DNA Gel Stain (Life Technolgies, USA) und direkt unter UV-Beleuchtung sichtbar gefärbt getrennt.}

Amplicons wurden unter Verwendung der Sanger-Methode sequenziert [27]. Direkte Sequenzierung wurde durchgeführt unter Verwendung des Big Dye® Terminatorv3.1 Cycle Sequencing Kit (Life Technologies, USA) und analysiert auf einem ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer (Life Technologies, USA) Pop 7 Polymer verwendet wird. Die in silico Mutation Suche wurde mit der Chromas Pro 1.5 (Technelysium Pty Ltd, Australien) durchgeführt. Die Referenzsequenz war Gene-ID: 4609 (NCBI). Varianten mit weniger als 1% minor Allel-Häufigkeit berichtet. Die Pathogenität von Missense-Mutationen wurde durch in silico-Analyse untersucht unter Verwendung von PolyPhen (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph/) und SIFT (http://sift.jcvi.org).

Die statistische Analyse

MYC
Methylierung, Mutation oder seine Produkte "Immunreaktivität Odds Ratio (OR) für clinicophatological Merkmale wurde durch logistische Regression geschätzt. Das Alter, in Magengewebeentnahme wurde als Kovariate in das Regressionsmodell definiert.

Die Normalität der Verteilung der quantitativen Variablen wurde von der Shapiro-Wilk-Test getestet. Daten, die nicht normal verteilt wurden (z-Score-Transformation) transformiert in eine Normalverteilung für die Analyse. Analyse von MYC
mRNA-Expression und Nummer des Exemplars wurden von der General Linear Model (GLM) mit Adjustierung für Alter, durchgeführt, die die Wirkung Größe liefert und beobachtete Leistung (OP) von jeder Analyse. Die Effektgröße für GLM-Analysen auf Eta Squared basiert (η ^{2), in dem 0,15 und darunter wurde als kleiner Effektgröße bestimmt, 0,16 bis 0,40 als Medium Effektgröße und über 0,40 als eine große Wirkung Größe.}

die Korrelation zwischen mRNA-Expression und Kopienzahl durch die Pearson-Test analysiert wurde, in dem ein Wert der Korrelationskoeffizient (r) unter 0,30 wurde als eine schwache Korrelation bestimmt, 0,30-0,70 als Medium Korrelation und über 0,70 als eine starke Korrelation.

In allen Analysen wurde das Konfidenzintervall von 95% und p
weniger als 0,05-Werte wurden als signifikant angesehen.

Ergebnisse

MYC
Verstärkung ist bekannt, dass hohe Protein /mRNA-Expression im Magen Karzinogenese [28], jedoch bezogen werden, nach bestem Wissen unseren Erkenntnissen haben nur wenige Studien durchgeführt worden, um die Rolle der Methylierung zu beschreiben und MYC
Mutationen in diesem Prozess. Um dieses Ziel zu erreichen, haben wir analysiert, 125 Fälle, in denen 68% waren Männer und 32% waren Frauen. Das Durchschnittsalter unserer Probensatz betrug 62 Jahre (Bereich von 26 bis 89 Jahre). Eine etwas höhere Frequenz von Darm-Typ (56,8%) und Nicht-cardic (58,4%) Tumoren beobachtet wurden (Tabelle 1 und 2).

MYC Kernprotein wurde als positiv in 76,8% (96/125) gefunden von Magentumoren (Abbildung 1). MYC Protein-Expression wurde häufiger in Darm-Typ als diffuse Typ-Tumoren beobachtet ( p
< 0,001, OR = 7,856, CI 95% = 2,803 bis 22,013) (Tabelle 1). (; CI 95% = 1,152 bis 9,315 p = 0,026, OR = 3,276), tiefer Tumorausdehnung ( p
= 0,045, OR = 2,975, CI 95% = 1,027 MYC Immunfärbung wurde auch mit late-onset assoziiert -8,623) und das Vorhandensein von Fernmetastasen ( p
< 0,001, OR = 17,682, CI 95% = 3,914 bis 79,882) (Tabelle 1). Futhermore, MYC Immunreaktivität wurde mit einer erhöhten mRNA-Expression assoziiert ( p
= 0,003, η ^{2 = 0,178, OP = 0,870) und MYC
Kopienzahl von FISH ( p
= 0,009, η 2 = 0,139, OP = 0,759) und durch qPCR ( p
= 0,003, η 2 = 0,177, OP = 0,869) (Tabelle 1).}

Das Expressionsniveau von MYC
mRNA war in allen Tumorproben als ihre gepaarte Kontrollen (RQ = 3,39 ± 0,14; Bereich von 1,57 bis 5,18). Eine erhöhte MYC
mRNA-Expression wurde mit tiefer Tumorausdehnung ( p
= 0,006, η ^{2 = 0,152, OP = 0,801) assoziiert, das Vorhandensein von Lymphknotenmetastasen ( p
= 0,023, η 2 = 0,107, OP = 0,632) und Fernmetastasen ( p
< 0,001, η 2 = 0,788, OP = 1) (Tabelle 2 ). Zusätzlich wurde die mRNA-Ebene direkt in die korrelierten MYC
Kopienzahl ( p
< 0,01; r = 0,716).}

Verstärkung von MYC
Kopien wurde in allen Proben Adenokarzinom des Magens durch FISH und qPCR-Assays gefunden. Durch FISH, war der mittlere Prozentsatz der präsentierenden Zellen MYC
Verstärkungs 72,1% (Bereich von 50 bis 83,5% Zellen mit Verstärkung) (Abbildung 2 A und B). Der Mittelwert von MYC
Kopien von qPCR betrug 4,5 (Bereich 3 bis 9 Kopien) (Abbildung 2 C).

FISH und qPCR-Analysen zeigten, dass erhöhte MYC
Nummer kopieren verbunden war mit late-onset ( p
< 0,001; η ^{2 = 0,257, OP = 0,976; p
= 0,025; η 2 = 0,103, OP = 0.662, beziehungsweise), Darm-Typ Krebs ( p
= 0,037; η 2 = 0,091, OP = 0,557; p
= 0,009; η 2 = 0,139, OP = 0,762, respectively) und das Vorhandensein von Fernmetastasen ( p
= 0,001; η 2 = 0,221, OP = 0,942; p
< 0,001; η 2 = 0,356, OP = 0,999, respectively). Darüber hinaus MYC
Verstärkung durch FISH wurde mit fortgeschrittenen Tumorstadien assoziiert ( p
= 0,037; η 2 = 0,091, OP = 0,558), jedoch nur zwei frühen Tumoren in dieser Untergruppe von Proben (Tabelle 2) analysiert.}

Alle Proben Magenkrebs präsentiert positive Verstärkung mit einem nicht-methylierte Primer-Set. Interessanterweise waren 86,4% der Krebsproben hypomethyliert. Auf der anderen Seite kann das Vorhandensein von nicht-methylierten Sequenzen am MYC
Promotor wurde in 28,4% der Kontrollproben (teilweise methylierte Proben), was den Verlust der Methylierung in diesen Proben (Abbildung 3) beobachtet. Die Primer der Spezifität und MSP Ergebnisse wurden unter Verwendung der Bisulfit-Sequenzierung PCR (BSP) Ansatz bestätigt [29], in denen wir zufällig fünf hypomethylierten Proben ausgewählt; fünf hypermethylated Proben und fünf Teil methylierten Proben (Daten nicht gezeigt). MYC
hypomethylation mehr wurde häufig im diffusen Typ beobachtet, verglichen mit dem Darm-Typ Magenkrebs ( p
= 0,007; OR = 8,554; 95% CI = 01.798-40.695, mit diffuse-Typ als Referenzgruppe). Darüber hinaus MYC
hypomethylation mit fortgeschrittenen Tumorstadien assoziiert war ( p
= 0,033; OR = 6,602; 95% CI = 1,162 bis 37,501), tiefer Tumorausdehnung ( p
= 0,022; OR = 4,752; 95% CI = 1,257 bis 17,965) und das Vorhandensein von Lymphknotenmetastasen ( p
= 0,032; OR = 5,12; 95% CI = 1,149 bis 22,814) (Tabelle 1).

im Hinblick auf die Gen-Sequenzierung wurde keine neue Mutation in Magentumoren nachgewiesen. Dreizehn (10,4%) Tumorproben mindestens eine bekannte Mutation vorgestellt, mit Varianten auf weniger als 1% minor Allel-Frequenz. Insgesamt wurden 18 Mutationen identifiziert, mit 4 Proben zeigen, Co-auftretende Mutationen. In Exon 1, fünf mit GG und vier mit CG bei rs117856857; bei rs73707292 ein mit GG; und vier mit CT bei rs4645949. In Exon 2, Missense-Mutationen betreffend, beherbergte zwei Tumoren mit einer Mutation im Codon 47, was zu einer Änderung von Tyrosin zu Histidin (rs114570780; SIFT Vorhersage = schädlich; PolyPhen Vorhersage = wahrscheinlich schädlich), und zwei bei Codon 72, was zu einer Änderung von Prolin zu Serin (rs28933407; SIFT Vorhersage = toleriert; PolyPhen Vorhersage = schädigen wahrscheinlich). Alle Tumor mit einer Mutation in Exon 2 präsentiert ein oder zwei bekannte Mutation im Exon 1. Exon 2 Mutationen nur bei diffusem Typ-Tumoren im fortgeschrittenen Stadium erkannt wurden. Keine Mutation wurde in Exon 3. Die Anwesenheit von bekannten identifiziert MYC
Mutationen mit diffuser Typ-Tumoren ( p
= 0,004, OR = 21,717, 95% CI = 2,678-176,111 verbunden war; unter Verwendung von diffusen Typs als Referenzgruppe) und das Vorhandensein von Fernmetastasen ( p
= 0,032, OR = 4,492, 95% CI = 1,141 bis 17,679).

Diskussion

die MYC Protein hat etwa 15% der Gene im menschlichen Genom eine Wirkung auf [30]. So wird in Veränderungen MYC Deregulierung in verschiedenen biologischen Wege in der Krebs Initiierung und Progression beteiligt führen kann [5]. wurde jedoch auf dem neuesten Stand, die Beziehung zwischen MYC
Veränderungen und klinischen Parametern nicht gut verstanden. Unsere Proben stellte ein männlich-weiblich-Verhältnis von 2.01 und die Mehrheit der Patienten waren älter als fünfundfünfzig. Darüber hinaus war die Darm-Typ Magenkrebs häufiger als die diffuse-type und Tumoren wurden häufiger in nicht-Cardia. Diese epidemiologischen Daten stehen im Einklang mit früheren Studien [28], [31] - [33].

chromosomalen Translokationen in der MYC
Locus ist sehr commun in hämatopoetischen Krebserkrankungen. Doch in soliden menschlichen Tumoren wie Magenkrebs, MYC
Veränderungen sind häufig aufgrund von Gen-Amplifikation [34]. Des Weiteren MYC Was ist die am häufigsten verstärkten Protein-kodierenden Gen in allen Krebsarten [35] zu erkennen. In der vorliegenden Studie beobachteten wir drei oder mehr MYC
Genkopien in allen Magentumoren untersucht, bestätigende mit früheren Studien in der primären Tumoren des Magens von Personen aus unserer Bevölkerung [10], [28], [36] - [39], sowie aus Ostasien und Europa [40] - [42]. Auch MYC
Amplifikation wurde in Plasma [43] und bei Magenkrebs-Zelllinien etabliert in unserer Gruppe beobachtet [44] - [47]. Darüber hinaus hatten unsere Gruppe beobachtet, dass klonalen hohe Verstärkung von MYC
ist weniger häufig bei diffusem-Typ als in Darm-Typ primären Magenkrebs [10], [22], [28], und diese verstärkt wurde durch diese Studie.

MYC-Überexpression ist als im Bereich von 15,6% bis 100% in primären Magenkrebs [9] beschrieben. In-vitro-Studien mit
zerlegten demonstriert MYC-Expression in Magenkrebs-Zelllinien die entscheidende Rolle der MYC-Expression in Magentumorzellwachstum, Überleben und die Aufrechterhaltung der Tumorzellparameter, die für maligne Potential beitragen kann [48 ]. Außerdem Mehndiratta et al.
, [49] zeigte eine signifikante Abnahme (40%) in MYC Expression sowohl von mRNA und Protein und seine nachgelagerten Ziele siRNA verwenden.

In der vorliegenden Studie, 76,8% der Magentumoren zeigte MYC Immunreaktivität und alle Tumoren, Darm- und diffuse Art präsentierte erhöhte Expression mRNA im Vergleich zu ihren gepaart Kontrollen. Ferner beobachteten wir, dass MYC Immunreaktivität und eine erhöhte mRNA-Expression wurden mit tieferen Tumorausdehnung und das Vorhandensein der Metastasierung assoziiert. Diese Ergebnisse legen nahe, dass MYC eine Rolle in der Tumorinvasions, Metastasen hat und damit Aggressivität, bestätigende einer früheren Studie [37]. Obwohl einige Analysen eine geringe Wirkung Größe dargestellt, sind diese Ergebnisse auch in Übereinstimmung mit einer früheren Studie unserer Gruppe in nicht-menschlichen Primaten, in dem wir eine kontinuierliche Steigerung von MYC
mRNA-Expression unter Beweis gestellt und die Kopienzahl während der aufeinanderfolgenden Schritte des intestinalen Typs Magen Karzinogenese in N-Methyl-nitrosoharnstoff (MNU) -behandelten nichtmenschlichen Primaten [16]. Auf der anderen Seite, jede Assoziation zwischen MYC und histologischen Grad, Tumorlokalisation, Lymphknotenmetastasen oder Krankheitsstadium wurde in einem Magenkrebs-Studie in einer chinesischen Bevölkerung [50], verstärkt entwickelt festgestellt, dass die ethnische Zugehörigkeit der betroffenen Bevölkerung kann dazu führen, biologisch und klinisch Magenkrebs Untergruppen [51].

Obwohl Genamplifikation nicht notwendigerweise verbunden ist, oder für die Überexpression erforderlich, unsere Studie zeigt, dass MYC Immunreaktivität, MYC
mRNA-Level und der Anzahl kopieren wurden direkt korreliert.

DNA-Methylierung ein potenter Mechanismus der Transkriptionsrepression ist. Proper genomische Methylierungsmuster tief geworden in Krebszellen verändert: beide Gewinne (Hyper) und Verluste (Hypomethylierung) von methylierter Stellen beobachtet wurden [52], [53]. Die Hypomethylierung an spezifische Promotoren können die aberrante Expression von Onkogenen und den Verlust der Prägung in einigen Loci [44] aktivieren. Bisher wenige Studien diskutiert, die die Beziehung zwischen dem Methylierungsmuster MYC Karten und ihre Wirkung auf die Genexpression und karzinogenen Prozessen. MYC
hypomethylation wurde zuvor mit dem onkogenen Progression und Metastasierung Induktion in einem Rattenmodell von Leberkrebs [54] und in der menschlichen Darmkrebs-Proben [55] verbunden. [58] und Zelllinien [48] - Zusätzlich MYC
hypomethylation wurde auch mit MYC
Expression in Magentumoren [26], [56] verbunden. Allerdings waren wir nicht in der Lage eine signifikante Assoziation zwischen MYC
hypomethylation und seinen Ausdruck in unseren Proben zu beobachten. Unter anderen Faktoren kann dieser Mangel an Vereinigung der Anwesenheit von fällig MYC
Verstärkung in allen Tumoren mit hypomethylierten Vermittler (86,4% der Proben) und damit die mögliche Wirkung dieser epigenetischen Modifikation Maskierung auf MYC
Transkriptionsregulation.

Suzuki et al.
[59] haben bereits gezeigt, dass ein hohes Maß an hypomethylation ein Indikator für schlechte Prognose in beiden Magen-und Darmkrebs war, und epigenetischen Veränderungen waren altersabhängig, bevor genetische Veränderungen auftreten. In der vorliegenden Studie wurden einige Kontrollen präsentierte bereits unmethylierten Sequenzen in der MYC
Promotor. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass MYC
hypomethylation mit einem aggressiveren Phänotyp (Tumoraggressivität, das Vorhandensein von Lymphknotenmetastasen, und histologischen Arten von Krebs) verbunden war. Diese Ergebnisse legen nahe, dass MYC
Demethylierung während der Tumorprogression akkumuliert werden können, und dies könnte eine gemeinsame Veranstaltung in Magen carinogenesis sein [60], [61], da dieser Mechanismus für andere Gene in verschiedenen Tumorarten beobachtet [ ,,,0],62], [63]. Wie bereits für die DNA-Hypermethylierung vorgeschlagen [64], kann der Promotor Hypomethylierung als eine neue Generation von Biomarkern verwendet werden und hält diagnostische und prognostische Versprechen für Kliniker.

Nach bestem Wissen und Gewissen, MYC
Gen Exons wurden nie in menschlichen Magentumoren vollständig sequenziert. Hier haben wir sequenziert, um die drei Exons von MYC
: Exon 1 ist ein nicht-kodierenden Protein, Exons 2 und 3 sind Protein-kodierenden [zur Übersicht siehe (Pelengaris & Khan, 2003)]. Wir fanden keine neue Mutation finden wir jedoch festgestellt, dass 4-Tumore Missense-Mutationen präsentiert (rs114570780 und rs28933407) auf Exon 2. Diese Mutationen in einer evolutionär konservierte Sequenz von waren MYC
: die Transaktivierungsdomäne [4] [65]. Darüber hinaus wurden beide identifizierten Mutationen als wahrscheinlich beschädigen gemäß der PolyPhen Software betrachtet. Die Änderung von Prolin zu Serin an Codon 72 wurde auch als pathogene Variante in der NCBI Datenbank dbSNP (http://omim.org/) zuvor berichtet. Somit können beide Mutationen in Exon 2 MYC-Aktivität in Tumoren des Magens beeinflussen. Zusätzlich wurde die Anwesenheit von MYC
Mutationen mit Fernmetastasen assoziiert. Allerdings sind weitere Untersuchungen notwendig, um zu klären, ob MYC
Mutationen eine Rolle bei der metastatischen Prozess.

Nach Laurén Klassifizierung wird Adenokarzinom des Magens klassifiziert hauptsächlich in Darm und diffuse Typen [17]. Darm-Typ Magenkrebs durchläuft eine Reihe von aufeinanderfolgenden Schritten, mit atrophischer Gastritis durch intestinale Metaplasie gefolgt beginnend intraepitelial Neoplasien und Karzinomen [66]. Auf der anderen Seite wird die diffuse-type nicht entwickeln im allgemeinen nicht von präkanzerösen Läsionen [67], [68]. In der vorliegenden Studie beobachteten wir, dass die Darm-Typ häufiger MYC Immunreaktivität präsentiert, sowie eine höhere Anzahl von MYC
Kopien als diffuse Typ-Tumoren, die mit früheren Studien unserer Gruppe bestätigt [10] [22], [28], [38]. Darüber hinaus MYC
hypomethylation und Punktmutationen wurden häufiger bei diffus-Typ beobachtet im Vergleich zu Darmtyp-Tumoren. So unterstützen unsere Ergebnisse, dass diese beiden histologischen Subtypen unterschiedlichen genetischen Pfade folgen und zwei sein können getrennte Einheiten [67].

Abschließend unsere Daten deuten darauf hin, dass MYC
Überexpression und Promotor-Hypomethylierung kann eine Rolle in der Magen-Karzinogenese Prozess. MYC
Deregulierung verbunden war vor allem auf schlechte prognostische Funktionen. Unsere Ergebnisse auch die Anwesenheit von verschiedenen Wegen verstärken in Darm-Typ beteiligt und diffus-Typ Magen-Karzinogenese. So sind unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass MYC ein nützlicher Marker für die klinische Schichtung und die Prognose sein.

• PLoS ONE: Entdeckung von Tumormarker für Magenkrebs von Proteomics
• PLoS ONE: Gastric Cancer Staging mit Dual Energy CT Spectral Imaging