PLOS ONE: Desregulamentação MYC no câncer gástrico e suas implicações clínicopatológicos

Abstract

Nosso estudo investigou a relação entre MYC
alterações e características clínico-patológicas em cancros gástricos. Foi avaliado o efeito de MYC
expressão de mRNA e sua imunorreactividade de proteínas, bem como a variação do número de cópia, a metilação do DNA promotor, e mutações pontuais, em 125 adenocarcinoma gástrico e 67 tecidos não-neoplásicas paried. Observou-se que 77% dos tumores apresentou MYC imunorreatividade que foi significativamente associada com o aumento da expressão do mRNA ( p Art < 0,05). Estas observações foram associadas a extensão do tumor mais profunda e a presença de metástases ( P
< 0,05). a expressão da proteína MYC também foi mais frequentemente observada em intestinal-tipo do que em tumores do tipo difuso ( p Art < 0,001). Além disso, MYC
mRNA e expressão da proteína foram significativamente associados com o seu número de cópia ( p Art < 0,05). O ganho de MYC
cópias foi associada a início tardio, do tipo intestinal, estágio do tumor avançado, ea presença de metástases à distância ( p Art < 0,05). A hypomethylated MYC
promotor foi detectado em 86,4% das amostras de tumor. MYC
hipometilação foi associada com difusa do tipo, estágio do tumor avançado, extensão do tumor mais profundo, ea presença de metástase ganglionar ( p Art < 0,05). Além disso, dezoito amostras de tumores apresentaram pelo menos uma mutação conhecida. A presença de MYC
mutações foi associado com o tipo difuso tumoral ( P
< 0,001). Nossos resultados mostraram que MYC
desregulamentação foi associada principalmente com pobres características prognósticos e também reforçou a presença de diferentes vias envolvidas na intestinal-tipo e carcinogênese gástrica difusa do tipo. Assim, nossos resultados sugerem que Myc
pode ser um marcador útil para a estratificação clínica e prognóstico

Citation:. De Souza CRT, Leal MF, Calcagno DQ, Costa Sozinho EK, Borges BDN, Montenegro RC, et ai. (2013) MYC
desregulamentação no câncer gástrico e suas implicações clínicopatológicos. PLoS ONE 8 (5): e64420. doi: 10.1371 /journal.pone.0064420

editor: Masaru Katoh, National Cancer Center, Japão

Recebido: 30 Janeiro, 2013; Aceito: 12 de abril de 2013; Publicado em: 22 de maio de 2013

Direitos de autor: © 2013 de Souza et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores Agradecemos ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq; CRTdS, AKCRdS, SEBdS, RRB e MDACs) e Fundação de Amparo à pesquisa do Estado de são Paulo (FAPESP; DQC e MFL) que suportam este estudo como subsídios e bolsas de estudo. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer gástrico é o quarto tipo de câncer mais freqüente e continua a ser a segunda principal causa de morte relacionada ao câncer em todo o mundo [1]. Esse tipo de câncer é geralmente diagnosticada em estádios avançados ea única terapia curativa disponível requer a ressecção cirúrgica [2]. Assim, o câncer gástrico é um grave problema de saúde pública no mundo. Uma melhor compreensão da biologia desta neoplasia é crítica e pode ser útil para orientar o manejo do paciente, bem como para desenvolver novas opções terapêuticas.

MYC
é um dos oncogenes mais estudados decorrentes a partir da sua associação com um grande número de doenças [3]. MYC desempenha um papel em várias funções fundamentais da biologia das células, incluindo a regulação do crescimento e proliferação celular, metabolismo, diferenciação, apoptose, e a angiogénese (para revisão ver [4], [5]). Assim, MYC é um integrador de sinais extracelulares e intracelulares, e o seu fenótipo celular é dependente da localização do tecido [6], [7]. Não surpreendentemente, a desregulamentação das funções MYC contribui para o fenótipo tumoral.

MYC
desregulamentação devido à amplificação do gene [8], [9], translocação cromossômica ou inserção [10], [11] , mutações [12], e modificações epigenéticas [13], [14], tem sido relatada em diferentes tipos de cânceres, especialmente no câncer gástrico. expressão MYC é muitas vezes elevados ou desregulada em neoplasias humanos [4], e parece ser no cruzamento de várias vias importantes e processos envolvidos na carcinogênese [15], sendo um evento chave na carcinogênese gástrica [9]. Anteriormente, nosso grupo demonstrou que MYC
expressão de mRNA e copiar número aumenta durante os passos sequenciais de carcinogênese gástrica do tipo intestinal em um modelo primata não humano [16], sugerindo que MYC o mundo Mai estar envolvido na iniciação do tumor gástrico e progressão.

o entendimento da MYC
biologia é de suma importância para elucidar o seu papel na patogênese do câncer gástrico. Até à data, não há nenhum estudo correlacionando MYC
mutação, amplificação, proteína /níveis de mRNA, e metilação nesta neoplasia. Aqui, foi avaliada a relação entre a MYC
alterações e características clínico-patológicas do câncer gástrico. Além disso, MYC
expressão de ARNm e proteína de imunorreactividade, assim como os diversos mecanismos moleculares anteriormente relacionados com a sua desregulação como variação do número de cópias (CNV), mutação, e a metilação do DNA, foram analisados ​​no mesmo conjunto de cancro gástrico amostras.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

Todas as amostras foram obtidas com consentimento informado por escrito e aprovação do Hospital Universitário (Belém, Pará, Brasil) conselhos de revisão ética ( número de protocolo:. 142004)

amostras clínicas

125 adenocarcinoma gástrico e 67 correspondentes tecidos gástricos não neoplásicas (amostras de controlo) foram obtidas cirurgicamente de pacientes do Hospital João de Barros Barreto Universidade no Pará Estado, Brasil. Todos os indivíduos não foram expostas a quimioterapia ou radioterapia antes da cirurgia. tumores gástricos foram classificados de acordo com Lauren [17] e os tumores foram encenadas usando critérios padronizados pela TNM encenação [18]. As características clinicopatológicas são mostrados na Tabela 1 e 2.

espécimes de tumor de controlo e dissecados foram rapidamente congeladas em azoto líquido até à purificação de ácido nucleico. Outra parte dos mesmos tecidos foi fixado em formol e incluído em parafina. Para o fluorescente in situ
ensaio de hibridização (FISH), a amostra de tumor restante foi desagregado, como descrito anteriormente [19].

imuno MYC

análises imuno-histoquímica para a proteína MYC foram realizada em 125, secções de tumores embebidos em parafina fixadas em formalina. coloração imuno-histoquímica foi realizada de acordo com Calcagno et ai.
[10]. secções de tecido de tumor (3 ou 4 mm de espessura) foram desparafinados em xileno e re-hidratadas numa série gradual de etanol. Após recuperação de epítopo induzida pelo calor, as secções de tecido foram incubadas com anticorpo monoclonal de ratinho contra MYC primário (diluição 1:50; SC-40, Santa Cruz Biotechnology, EUA e Zymed®, EUA). Um kit de anticorpo secundário conjugado com peroxidase universal (LSAB Sistema, DakoCytomation, EUA) foi utilizado para o sistema de detecção. Utilizou-se 3,30-diamino-benzidina /H _{2O 2 (DakoCytomation, Dinamarca) como cromógeno e hematoxilina como contrastante. Qualquer corante nuclear com ou sem coloração citoplasmática foi considerado um resultado positivo, independentemente da intensidade. Um caso MYC-positiva foi definida como uma que tem 10% ou mais das células tumorais positivas para esta proteína.}

ácido nucleico extracção

O ADN genómico (ADNg) foi extraído utilizando o Kit QIAamp DNA Mini (Qiagen, Alemanha), seguindo as instruções do fabricante. O ARN total foi extraído com Tri-reagent® (Life Technologies, EUA), de acordo com o protocolo do fabricante. DNA e RNA concentração e qualidade foram determinados utilizando o espectros otómetro NanoDrop (Kisker, Alemanha). a integridade de ARN foi determinada por electroforese em gel (geles de 1% de agarose). Todas as amostras foram armazenadas a -80 ° C até à sua utilização.

MYC
expressão de ARNm

para quantificar os níveis de ARNm de
MYC, o ARN total foi isolado a partir de 49 tecidos normais e tumorais usando emparelhados Trizol (Life Technologies, EUA). O ARN foi transcrito de forma inversa utilizando o kit High-Capacity cDNA Archive de acordo com o protocolo do fabricante (Life Technologies, EUA). DNA complementar foi então amplificado por PCR em tempo real utilizando as sondas TaqMan compra Assays-on-demand produtos para Gene Expression (Life Technologies, EUA) em um 7500 Rápido PCR em tempo real (Life Technologies, EUA). gene GAPDH
foi selecionado como um controlo interno para a entrada de RNA e eficiência de transcrição reversa. Tudo em tempo real transcrição reversa PCR quantitativa (RT-qPCR) foram realizadas em triplicata para ambos gene alvo ( MYC
: Hs00153408_m1) e controle interno ( GAPDH
: NM_002046.3).

a quantificação relativa (RQ) da expressão do gene foi calculada de acordo com Livak e Schmittgen [20]. A amostra de controlo correspondente foi designado como um calibrador de cada tumor.

MYC
copiar número

FISH e qPCR foram utilizados para avaliar MYC
número de cópias em um subconjunto de 49 tumores, o mesmo utilizado no estudo da expressão. FISH foi realizada de acordo com o protocolo do Pinkel et al.
[21] com as modificações introduzidas pela Calcagno et al.
[22]. As células foram hibridizadas com Spectrum Laranja
Probe (LSI Vysis /Abbott, Inc., IL) para a MYC e região gene (8q24.12-q24.13) e os núcleos foram contrastadas com 4 ', 6-diamidino-2-fenilindole antifade. A fluorescência foi detectada utilizando um microscópio de fluorescência Olympus BX41 (Olympus, Japão) com filtros de excitação de 4 ', 6-diamidino-2-fenilindole (260 nm) e rodamina (570 mn). Para cada caso, 200 núcleos interfásicos foram analisados ​​utilizando um sistema de análise de imagem ASI (Applied Spectral Imaging, Israel). sinais positivos MYC
gene apareceu como manchas vermelhas nos núcleos e foram registados com os critérios de Hopman et al.
[23]. Para evitar uma interpretação errada devido a um erro técnico, núcleos de linfócitos normais e de tecido gástrico normal foram usadas como controlo. Os resultados de FISH foram apresentados como a percentagem de MYC
amplificação por uma célula, na qual foi calculada a percentagem de células mostrando 3 ou mais sinais para o MYC
sonda por celular.

qPCR foi realizada utilizando quantitativos ensaios TaqMan CNV (Life Technologies, EUA) para o MYC
gene (Hs01764918_cn) e para o controle interno RNAse P
(Ƹ3326). reações de qPCR multiplex foram realizadas em quadruplicado com gDNA acordo com as condições do protocolo e ciclismo do fabricante em 7500 Rápido Real-Time PCR (Life Technologies, EUA). O número de cópias relativa foi estimada para cada amostra usando a cópia Caller Software V1.0 (Life Technologies, EUA). gDNAs comerciais humanos (G1521 e G1471; Promega, EUA) foram utilizados para a calibração

MYC
metilação

O padrão de metilação e frequência do MYC promotor foram avaliados em tumores 125 e 67 amostras de controlo correspondentes por PCR específicos de metilo (MSP) como anteriormente descrito [24]. ADNg (2 ug) de todas as amostras foi modificado pelo tratamento com bissulfito, converter citosinas não metiladas em uracilos e deixando inalterada cytosins metilados [25]. iniciadores específicos para o MYC
promotor foram como se segue: F5'-TAGAATTGGATTGGGGTAAA-3 'e R5'-CCAACCAAAAATCAACATGAAT-3' para as reacções não metilados (tamanho do produto esperado de 291 pb); F5'-TAGAATTGGATCGGGGTAAA-3 'e R5'-CGACCGAAAATCAACGCGAAT-3' para as reacções metilados (tamanho esperado do produto de 290 pb), como descritos anterior [26].

As reacções de PCR foram realizadas com 0,1 umol /L de dNTPs, 2 mmol /L de MgCl _{2, 0,5 pmol de iniciadores, 1,25 U de Taq DNA polimerase e 100 ng de ADN modificado com bissulfito. Após desnaturação inicial de 5 min a 94 ° C, 40 ciclos a 9 4 ° C durante 45 s, 52,4 ° C durante 45 s, e 72 ° C durante 30 s foram levadas a cabo, seguidos de uma extensão final de 5 min a 72 ° C. Os produtos de PCR foram directamente carregado sobre geles de agarose a 3% e a electroforese. O gel foi corado com SYBR® Seguro DNA Gel Stain (Vida Technolgies, EUA) e directamente visualizados sob iluminação UV. Como um controlo positivo de todas as reacções de MSP, uma amostra ADNg foi completamente metilado usando CpG metilase (SSSI, New England Biolabs, EUA) seguindo as instruções do fabricante. . Além disso, os iniciadores para a de tipo selvagem foram usadas para monitorizar a conversão completa do ADN obtido na reacção de bissulfito}

As amostras foram estratificados como: 1) hypomethylated amostras quando o produto de amplificação positivo foi detectado apenas no PCR com iniciadores específicos para sequências metiladas; 2) hipermetilado amostras quando a amplificação positiva foi detectada apenas na PCR com primers específicos para sequências metiladas; 3) amostras metiladas parciais quando amplificação positiva foi detectada na PCR com os dois conjuntos de iniciadores.

MYC
Genotipagem

Os três exons do MYC
foram selecionados para análise de mutação do gene em todos os 125 amostras de cancro gástrico. Os seguintes iniciadores foram concebidos para amplificação por PCR e sequenciação: exão 1 F5'-TTTATAATGCGAGGGTCTGGA-3 'e R5'-GCATTCGACTCATCTCAGCA-3' (tamanho do produto esperado de 654 pb); exão 2 F5'-CTGCCTCCCGCTTTGTGT-3 'e R5'-TTTGATGAAGGTCTCGTCGT-3' (tamanho do produto esperado de 423 pb), F5'-TGGGAGGAGACATGGTGAA-3 'e R5'-TGCCAATGAAAATGGGAAAG-3' (tamanho do produto esperado de 507 pb); exão 3 F5'-TGTCCAGAGACCTTTCTAACGTAT-3 'e 5'-CCGTAGCTGTTCAAGTTTGTG-3' (tamanho do produto esperado de 663 pb), 5'-TGTCCGTCCAAGCAGAGG-3 'e 5'-TGATGAAAACAAACAGGGATG-3' (tamanho do produto esperado de 639 pb).

As reacções de PCR foram realizadas com 0,1 mmol /L de dNTPs, 2 mmol /L de MgCl _{2, 0,5 mmol /L de iniciadores, 1 U de Taq polimerase e 100 ng de ADN. As condições de PCR foram 95 ° C durante 10 min, seguido de 35 ciclos de 1 min de desnaturação a 95 ° C, 1 min de temperatura de emparelhamento (variando de 59 e 61 ° C), e 1 minuto de extensão a 72 ° C. Os produtos de amplificação foram separados num gel de agarose a 2% corado com SYBR® segura do gel do ADN da mancha (Vida Technolgies, EUA) e directamente visualizados sob iluminação UV.}

amplicons foram sequenciados utilizando o método de Sanger [27]. A sequenciação directa foi realizada utilizando o kit de sequenciação do ciclo grande Dye® Terminatorv3.1 (Life Technologies, EUA) e analisado num ABI PRISM® 3130 Genetic Analyzer (Life Technologies, EUA), utilizando Pop 7 polímero. A pesquisa de mutação in silico foi realizada utilizando o Chromas Pro 1.5 (Technelysium Pty Ltd, Austrália). A sequência de referência era Gene ID: 4609 (NCBI). Foram relatadas variantes com menos de 1% de frequência de alelos menores. Patogenicidade de mutações missense foi avaliada por análise in silico utilizando PolyPhen (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph/) e peneirar (http://sift.jcvi.org).

A análise estatística

MYC
metilação, odds ratio imunorreatividade mutação, ou os seus 'produtos (oR) para recursos clinicophatological foi estimada pela regressão logística. A idade em amostras de tecido gástrico foi definida como covariável no modelo de regressão.

A normalidade da distribuição das variáveis ​​quantitativas foi testado pelo teste de Shapiro-Wilk. Os dados que não foram distribuídos normalmente foram transformados (transformação z-score) em uma distribuição normal para análise. Análise do MYC
expressão de mRNA e número do exemplar foram realizados pelo Modelo Linear Geral (GLM) com ajuste para idade, que fornece o tamanho do efeito e observou potência (OP) de cada análise. O tamanho do efeito para análises GLM foi baseado em eta quadrado (η ^{2), em que 0,15 e a seguir foi determinada como um pequeno tamanho do efeito, 0,16-0,40 como um tamanho médio efeito, e acima de 0,40, como um grande tamanho do efeito.}

a correlação entre a expressão do ARNm e do número de cópias foi analisada pelo teste de Pearson, em que um valor do seu coeficiente de correlação (r) abaixo de 0,30 foi determinada como uma fraca correlação, 0,30-,70 como uma correlação média, e acima de 0,70 como uma forte correlação.

Em todas as análises, o intervalo de confiança foi de 95% e p
valores inferiores a 0,05 foram considerados significativos.

Resultados

MYC
amplificação é conhecido por estar relacionado com alta expressão de proteína /mRNA na carcinogênese gástrica [28], no entanto, com o melhor de nosso conhecimento, poucos estudos têm sido realizados para descrever o papel da metilação e MYC
mutações nesse processo. Para alcançar este objetivo, foram analisados ​​125 casos nos quais 68% eram do sexo masculino e 32% eram do sexo feminino. A média de idade do nosso conjunto de amostras foi de 62 anos (variação de 26-89 anos). Um ligeiramente maior frequência de tipo intestinal (56,8%) e (58,4%) tumores não-digestiva foram observadas (Tabela 1 e 2).

MYC proteína nuclear foi positiva em 76,8% (96/125) de tumores gástricos (Figura 1). a expressão da proteína MYC foi mais frequentemente observada em tipo intestinal do que os tumores do tipo difuso ( p Art < 0,001, OR = 7,856, IC 95% = 2,803-22,013) (Tabela 1). MYC imunocoloração também foi associada a início tardio (p = 0,026, OR = 3,276; IC95% = 1,152-9,315), extensão do tumor mais profunda ( p
= 0,045, OR = 2,975, IC 95% = 1.027 -8,623), ea presença de metástases à distância ( p Art < 0,001, OR = 17,682, IC 95% = 3,914-79,882) (Tabela 1). Futhermore, MYC imunorreatividade foi associada ao aumento da expressão do mRNA ( p = 0,003
, η ^{2 = 0,178, OP = 0,870) e MYC
número de cópias por FISH ( p
= 0,009, η 2 = 0,139, OP = 0,759) e pela qPCR ( p = 0,003
, η 2 = 0,177, OP = 0,869) (Tabela 1).}

O nível de expressão de MYC
mRNA foi maior em todas as amostras de tumores do que os seus controles pareados (RQ = 3,39 ± 0,14; intervalo de 1,57-5,18). Um aumento da MYC
expressão de mRNA foi associado a extensão do tumor mais profunda ( p = 0,006
, η ^{2 = 0,152, OP = 0,801), presença de metástase ganglionar ( p = 0,023
, η 2 = 0,107, OP = 0,632), e metástases à distância ( p Art < 0,001, η 2 = 0,788, OP = 1) (Tabela 2 ). Além disso, o nível de mRNA foi diretamente correlacionada com a MYC
número de cópias ( p Art < 0,01; r = 0,716).}

Ganho de MYC
cópias foi encontrada em todas as amostras de adenocarcinoma gástrico por ensaios FISH e qPCR. Por FISH, o percentual médio de células apresentadoras de MYC
amplificação foi de 72,1% (faixa de 50 a 83,5% de células com amplificação) (Figura 2 A e B). A média de MYC
cópias por qPCR foi de 4,5 (intervalo de 3 a 9 cópias) (Figura 2 C).

FISH e análises qPCR mostrou que o aumento da MYC
número de cópias foi associada a início tardio ( p Art < 0,001; η ^{2 = 0,257, OP = 0,976; p
= 0,025; η 2 = 0,103, OP = 0,662, respectivamente), do tipo intestinal cancro ( p
= 0,037; η 2 = 0,091, OP = 0,557; p
= 0,009; η 2 = 0,139, OP = 0,762, respectivamente), ea presença de metástases à distância ( p
= 0,001; η 2 = 0,221, OP = 0,942; p Art < 0,001; η 2 = 0,356, OP = 0,999, respectivamente). Além disso, MYC
amplificação por FISH foi associado com estágios tumorais avançados ( p
= 0,037; η 2 = 0,091, OP = 0,558), no entanto, apenas dois tumores primitivos eram analisados ​​neste subconjunto de amostras (Tabela 2).}

Todas as amostras com câncer gástrico apresentaram amplificação positiva com um conjunto de primers não metilado. Curiosamente, 86,4% das amostras de câncer foram hypomethylated. Por outro lado, a presença de sequências metiladas no MYC
promotor foi observada em 28,4% de amostras de controlo (amostras parciais metilados), sugerindo que a perda de metilação nestas amostras (Figura 3). resultados de especificidade e MSP das primários foram confirmados usando a abordagem de seqüenciamento bissulfito PCR (BSP) [29], no qual foram selecionados aleatoriamente cinco amostras hypomethylated; cinco amostras hipermetilado e cinco amostras metilados parciais (dados não mostrados). MYC
hipometilação foi mais frequentemente observada no tipo difuso em relação ao câncer gástrico do tipo intestinal ( p
= 0,007; OR = 8,554; IC95% = 01.798-40.695, usando -tipo difuso como grupo de referência). Além disso, MYC
hipometilação foi associado com estágios tumorais avançados ( p
= 0,033; OR = 6,602; IC95% = 1,162-37,501), extensão do tumor mais profunda ( p
= 0,022; OR = 4,752; IC95% = 1,257-17,965), ea presença de metástase ganglionar ( p
= 0,032; OR = 5,12; IC 95% = 1,149-22,814) (Tabela 1).

Com relação ao sequenciamento de genes, sem nova mutação foi detectada em tumores gástricos. amostras Treze (10,4%) tumorais apresentaram pelo menos uma mutação conhecida, com variantes em menos de 1% freqüência do alelo menor. No total, foram identificados 18 mutações, com 4 amostras que exibiram mutações que ocorrem simultaneamente. Do exão 1, cinco com GG e quatro com CG em rs117856857; um com a rs73707292 GG; e quatro com CT em rs4645949. No exão 2, referente mutações missense, dois tumores abrigava uma mutação no códon 47, resultando em uma mudança de tirosina para histidina (rs114570780; SIFT previsão = deletério; previsão PolyPhen = provavelmente prejudicial), e dois no códon 72, resultando em uma mudança de prolina para serina (rs28933407; SIFT predição = tolerado; predição PolyPhen = provavelmente danificar). Todos os tumores com uma mutação no exão 2 apresentaram uma ou duas mutações conhecidas no exão 1. O exão 2 mutações foram detectadas apenas em tumores do tipo difuso em fase avançada. Nenhuma mutação foi identificada no exão 3. A presença do conhecido MYC
mutações foi associado a tumores do tipo difuso ( p
= 0,004, OR = 21,717; IC95% = 2,678-176,111; usando difusa do tipo como grupo de referência) ea presença de metástases à distância ( p
= 0,032, OR = 4,492, IC 95% = 1,141-17,679).

Discussão

a proteína MYC tem um efeito sobre a cerca de 15% dos genes no genoma humano [30]. Assim, MYC desregulação pode resultar em alterações em diferentes vias biológicas envolvidas na iniciação e progressão do cancro [5]. No entanto, até à data, a relação entre o MYC
alterações e os parâmetros clínico não foi bem compreendido. Nossas amostras apresentaram uma relação homem-mulher de 02:01 ea maioria dos pacientes tinham mais de cinquenta e cinco anos. Além disso, o câncer gástrico do tipo intestinal foi mais frequente do que a do tipo difusa e tumores foram mais frequentes em não-cárdia. Estes dados epidemiológicos estão em conformidade com estudos anteriores [28], [31] - [33].

translocações cromossômicas no MYC
lugar é muito commun em cancros hematopoiéticos. No entanto, em tumores humanos sólidos, como câncer gástrico, MYC
alterações são geralmente devido a amplificação do gene [34]. Além disso, MYC
é reconhecida como sendo o gene que codifica a proteína mais frequentemente amplificada em todos os tipos de cancro [35]. No presente estudo, observou-se três ou mais MYC
cópias do gene em todos os tumores gástricos estudadas, corroborando com estudos anteriores em tumores gástricos primários de indivíduos de nossa população [10], [28], [36] - [39], bem como a partir de Oriental Ásia e Europa [40] - [42]. Além disso, MYC
amplificação foi observada no plasma [43] e em linhas celulares de cancro gástrico estabelecidos no nosso grupo [44] - [47]. Além disso, o nosso grupo tinha observado que a alta amplificação clonal de MYC
é menos frequente em difusa do tipo do que no cancro gástrico primário do tipo intestinal [10], [22], [28], e isso foi reforçado pela este estudo.

MYC sobre-expressão é descrito como variando de 15,6% a 100% em cancros gástricos primários [9]. In vitro
estudos com knocked-down MYC expressão em linhas celulares de cancro gástrico demonstrou o papel crucial de expressão MYC no crescimento de células de tumor gástrico, sobrevivência e a manutenção de parâmetros de células tumorais que podem contribuir para o potencial maligno [48 ]. Além disso, Mehndiratta et al.
, [49] mostraram uma diminuição significativa (40%) na expressão MYC de ambos mRNA e proteína e os seus alvos a jusante usando siRNA.

No presente estudo, 76,8% dos tumores gástricos mostrou MYC imunorreatividade e todos os tumores, tipo intestinal e difuso, apresentou aumento da expressão de mRNA em comparação com seus controles pareados. Além disso, observou-se que imunorreatividade MYC e aumento da expressão de mRNA foram associados com a extensão do tumor mais profunda e presença de metástase. Estes achados sugerem que MYC tem um papel na invasão de tumor, metástase, agressividade e, portanto, corroborando um estudo anterior [37]. Embora algumas análises apresentou um pequeno tamanho do efeito, esses resultados também estão de acordo com um estudo prévio do nosso grupo em primatas não-humanos, em que demonstrou um aumento contínuo de MYC
expressão de mRNA e número do exemplar durante o passos sequenciais de carcinogénese gástrico do tipo intestinal em N-metil-nitrosoureia (MNU) tenha sido tratada com primatas não-humanos [16]. Por outro lado, qualquer associação entre MYC e grau histológico, localização do tumor, linfonodo metástases, ou estágio patológico foi detectada num estudo de câncer gástrico desenvolvido em uma população chinesa [50], reforçando que a etnia da população afetada pode levar a biologicamente e clinicamente subconjuntos câncer gástrico [51].

Embora, a amplificação do gene não está necessariamente associada ou necessária para a sua sobre-expressão, nosso estudo mostra que MYC imunorreatividade, MYC
níveis de mRNA, e número do exemplar estavam diretamente correlacionados.

a metilação do DNA é um mecanismo potente de repressão da transcrição. Proper genômicas de metilação-padrões tornam-se profundamente alterada em células cancerosas: ambos os ganhos (hipermetilação) e perdas (hipometilação) de sites metiladas foram observadas [52], [53]. A hipometilação de promotores específicos pode activar a expressão anormal de oncogenes e perda de impressão em alguns loci [44]. Até agora, alguns estudos discutiu a relação entre o padrão de metilação de MYC
e o seu efeito sobre a expressão do gene e em processos cancerígenos. MYC
hipometilação foi previamente associada com a progressão oncogênico e indução metástase em um modelo de rato de câncer de fígado [54] e em amostras de câncer colorretal humanos [55]. Além disso, MYC
hipometilação foi também associada a MYC
expressão nos tumores gástricos [26], [56] - linhas [58] e células [48]. No entanto, não fomos capazes de observar uma associação significativa entre o MYC
hipometilação e sua expressão em nossas amostras. Entre outros fatores, essa falta de associação pode ser devido à presença de MYC
amplificação em todos os tumores com os promotores hypomethylated (86,4% das amostras) e, portanto, mascarando o possível efeito dessa modificação epigenética em MYC
transcricional regulamentação.

Suzuki et al.
[59] anteriormente mostrou que um alto nível de hipometilação foi um indicador de mau prognóstico tanto em câncer gástrico e do cólon e alterações epigenéticas eram dependentes idade, ocorrendo antes de alterações genéticas. No presente estudo, alguns controles já apresentadas sequências metiladas no MYC
promotor. Além disso, demonstrou-se que MYC
hipometilação foi associada com um fenótipo mais agressivo (a agressividade do tumor, metástase presença de linfonodo, e tipos histológicos de cancro). Estes achados sugerem que MYC
desmetilação pode ser acumulada durante a progressão do tumor e isso pode ser um evento comum em carinogenesis gástrica [60], [61], uma vez que este mecanismo tem sido observada para outros genes em vários tipos de tumores [ ,,,0],62], [63]. Como já foi proposto para hipermetilação DNA [64], a hipometilação do promotor pode ser usado como uma nova geração de biomarcadores e tem a promessa de diagnóstico e prognóstico para os clínicos.

Para o melhor de nosso conhecimento, MYC
exons do gene nunca foram completamente sequenciado em tumores gástricos humanos. Aqui, nós sequenciados os três exões do MYC
: exão 1 é uma proteína não-codificantes, exões 2 e 3 são de codificação da proteína [para revisão ver (Pelengaris & Khan, 2003)]. Nós não encontramos nenhuma nova mutação, no entanto, observou-se que 4 tumores apresentaram mutações missense (rs114570780 e rs28933407) no exon 2. Estas mutações estavam em uma sequência conservada evolucionária da MYC
: o domínio de transativação [4] , [65]. Além disso, ambas as mutações identificadas eram considerados como provavelmente danificar acordo com o software PolyPhen. A mudança da prolina para serina no codão 72 foi também previamente relatada como uma variante patogénica na base de dados NCBI dbSNP (http://omim.org/). Assim, ambas as mutações no exão 2 pode afectar a actividade MYC em tumores gástricos. Além disso, a presença de MYC
mutações foi associada com metástases distantes. No entanto, outras investigações são necessárias para esclarecer se MYC
mutações tenham um papel no processo metastático.

De acordo com a classificação de Lauren, adenocarcinoma gástrico é principalmente classificados em tipos intestinal e difuso [17]. cancro gástrico do tipo intestinal progride através de uma série de passos sequenciais, começando com gastrite atrófica seguido por metaplasia intestinal, neoplasia intraepitelial, carcinoma e [66]. Por outro lado, o tipo difuso não tem geralmente a partir de lesões pré-cancerosas [67], [68]. No presente estudo, observou-se que o tipo intestinal apresentou imunorreatividade MYC mais frequentes, bem como um maior número de MYC
cópias do que tumores do tipo difuso, o que corrobora com estudos anteriores de nosso grupo [10] [22], [28], [38]. Além disso, MYC
hipometilação e mutações pontuais foram mais frequentemente observadas em difusa do tipo, em comparação com tumores do tipo intestinal. Assim, nossos resultados suportam que estes dois subtipos histológicos seguir diferentes caminhos genéticos e podem ser duas entidades distintas [67].

Em conclusão, nossos dados sugerem que MYC
superexpressão e hipometilação do promotor pode ter um papel no processo de carcinogénese gástrica. MYC
desregulamentação foi associado principalmente ao pobres características prognósticos. Os nossos resultados também reforçam a presença de diferentes vias envolvidas no tipo intestinal e carcinogénese gástrico difuso-tipo. Assim, nossos resultados sugerem que MYC pode ser um marcador útil para a estratificação clínica e prognóstico.

• PLOS ONE: Descoberta de marcadores tumorais para o câncer gástrico por Proteomics
• PLOS ONE: Câncer Gástrico Staging com Dupla Energia Spectral CT Imaging