PLoS ONE: Mutation at intronisekvenssejä Toistot on ataksia-verisuoniluomen mutaation (ATM) Gene ja ATM Protein tappio Ensisijainen mahasyövän kanssa microsatellite Epävakaus

tiivistelmä

ataksia-telangiektasiassa mutatoitunut (ATM) on Ser /Thr proteiinikinaasi että on ratkaiseva tehtävä DNA vaurioita aiheuttama signalointi ja aloittamisen solusyklin Checkpoint signalointi vastauksena DNA: ta vaurioittavien aineiden, kuten ionisoivaa säteilyä. Olemme aiemmin raportoitu ATM proteiinin tappio immunohistokemiallinen (IHC) 16% ihmisen mahasyövän (GC) kudosta. Oletimme, että ATM
geenin intronin mutaatioiden kohteena mikrosatelliittien epävakaus (MSI) aiheuttaa ATM proteiinia tappio osajoukko GC. Tutkimme mononukleotidi mutaatiot intronin ATM
geenin, ATM IHC ja MSI GC. Kymmenen ihmisen mahasyöpä solulinjoissa tutkittiin ATM
geenimutaation at introneja, RT-PCR, suora sekvensointi ja immunohistokemia. GC kudoksia 839 potilasta analysoitiin MSI ja ATM IHC. Niistä 604 tapausta analysoitiin ATM
mutaatiot intronit edellisessä eksonissa 6, eksonin 10 ja eksonin 20. Kaksi ihmisen GC solulinjoissa (SNU-1 ja -638) osoitti ATM
introni mutaatioita, deleetio RT-PCR ja suoralla sekvensoinnilla, ja ATM-proteiinin menetystä IHC. Taajuudet on ATM
mutaatio, MSI, ja ATM-proteiini tappio oli 12,9% (78/604), 9,2% (81/882) ja 15,2% (134/839), tässä järjestyksessä. Analyysi yhdistysten kesken MSI, ATM geenimutaatio, ja ATM-proteiini menetys paljastui erittäin rinnakkaisiin ATM
geenin muutokset ja MSI. ATM
intronin mutaatio ja ATM-proteiinia tappio havaittiin 69,3% (52/75) ja 53,3% (40/75) MSI positiivisia GC. MSI positiivisuus ja ATM-proteiinin menetys oli läsnä 68,4% (52/76) ja 48,7% (37/76) GC ATM introni mutaatio. ATM
mutaatio ja ATM-proteiinin menetys oli ominaispiirteet vanhuuden, distaalinen sijainnin kasvain, suuri kasvaimen koon ja histologinen suoliston tyyppi. Tutkimuksemme voitaisiin tulkita, että ATM
geenin mutaatio intronin voidaan kohdistaa MSI ja johtaa ATM proteiinin tappion valitussa ryhmässä GC.

Citation: Kim HS, Choi SI, Min HL, Kim MA, Kim WH (2013) Mutation at intronisekvenssejä Toistot on ataksia-verisuoniluomen mutaation (ATM) Gene ja ATM Protein tappio Ensisijainen mahasyövän kanssa microsatellite Epävakaus . PLoS ONE 8 (12): e82769. doi: 10,1371 /journal.pone.0082769

Editor: Hoguen Kim, Yonsei University College of Medicine, Korean tasavallan

vastaanotettu: 21 heinäkuu 2013; Hyväksytty: 27 lokakuu 2013; Julkaistu: 06 joulukuu 2013

Copyright: © 2013 Kim et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Basic Science Research Program kautta National Research Foundation of Korea (NRF) rahoittama tiede, ICT & Tulevaisuuden suunnittelu (NRF-2012R1A1A2004648). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

ataksia-telangiektasiassa mutatoitunut (ATM) geeni on osa DNA-vaurioita vastaus (DDR) ja aktivoidaan DNA kaksinkertainen katkeamisen (DSB: t), ja signaloi solusyklin Checkpoint hidastaa kulkua solujen läpi sykli helpottamiseksi DNA korjaukseen. Geeni on paikannettu kromosomiin 11q22-23. ATM
geeni on hyvin suuri, joka ulottuu genominen alue 150 kb, joka sisältää 66 eksonia, joiden koodaava sekvenssi 91668 bp.

ATM on sekaantunut vastauksissa DSB: ihin, joita esiintyy fysiologisesti erikoistuneissa solutyypeissä kuten itusolujen ja lymfosyytit. ATM-proteiini auttaa soluja tunnustaa ehjä DNA-säikeet. ATM-proteiini koordinoi DNA korjaukseen aktivoimalla entsyymejä, jotka korjaa rikkoutuneet säikeitä. Tehokas korjaus vahingoittuneiden DNA-juosteet auttaa säilyttämään vakautta solun geneettinen tieto [1].

ATM menetystä havaittiin 16% ihmisen GC kudoksen suuressa kohorttitutkimuksessa [2]. Inaktivointi ATM
geeni voi olla yleinen tapahtuma inhimillisen mahasyövän (GC); kuitenkin liittyvät tapahtumat menetys ATM
ilmaisun GC ei voitu selittää alhainen esiintyvyys ATM
mutaatio. Useimmat ATM
mutaatioita tunnistettiin ensisijaisesti GC solulinjoissa ja GC kudokset olivat pistemutaatioita [3].

DNA mismatch korjaus (MMR) järjestelmä korjaa virheet, joita saattaa syntyä DNA-replikaation, kun taas homologisen rekombinaation ja ei-homologisen end liittymällä osallistuvat korjaus DNA: n DSB. Mutaatiot DNA: n DSB korjaavien geenien kuten ATM, MRE11, RAD50, NBS1
ja ATR
, ovat oletettuja olevan merkitystä kehitettäessä ruoansulatuskanavan pahanlaatuisten kasvainten, joilla oli heikentyneen MMR toiminto. Peräsuolen kasvainten heikentynyt MMR-mekanismin, mutaatiot introni-mononukleotidi toistoja ATM
ja MRE11
havaittiin johtaa poikkeavaan liittämiseen, jonka jälkeen vähentää ilmentymistä villityypin proteiini [4 ].

Noin 10% GC liittyy mikrosatelliittien epävakaus (MSI). MSI viittaa muutoksia nukleotidisekvenssien määrä toistoja microsatellite alueilla sijaitsevat koodaavan alueen geenien, ja tulokset lukukehysmutaatioita. MSI on havaittu proteiinia koodaavat alueet tunnettuja kohdegeenien, kuten TGF-pRII, IGFIIR, BAX
[5-7], ja hRAD50
geenit [8]. hRAD50, BLM
, ja BRACA1
geenit ovat poly (A) mononukleotidi toistuu sisällä koodausalueissa, hMSH6
on (C) 8-suolikanavan NBS1
on (A) 7-suolikanavan ja ATM
on (T) 7 ärsytystä. Lukukehysmutaatioita näistä geeneistä vaihtelevalla ilmaantuvuus on raportoitu aikaisemmin [9-11].

Lisäksi lukuisat mutaatiot kertynyt vapaalla microsatellite sekvenssit, MSI tuottaa myös mutaatioita syövän geenien, eli niissä geenien aktiivista roolia monivaiheisessa prosessissa syövän. Vaikka toistuva sekvenssien koodaavan alueen geenit ovat lyhyempiä kuin tyypilliset mikrosatelliitti loci käytetään geenin kartoitus, niiden taipumus olevien spontaanin liukumisen virheet replikaation aikana on edelleen suurempi kuin toistuvajaksoinen sekvenssejä. Mutaatiot introni- toista raportoitu aiheuttavan heikentynyt ilmentymisen MRE11
geeni [12,13]. Polypyrimidiinijuosteen toista mutaatiot ATM
geeni voi häiritä oikean mRNA [14]. Ei ole kuitenkaan mitään todisteita siitä, että lisäys /poisto tapahtumisen näissä ei-koodaavat mononukleotidi sekvenssit vaikuttaa normaalia ATM-proteiinin funktion MSI liittyviä GC. Ihmisen GC kudoksen MSI, taajuus ATM
mutaatio ja yhdessä menetys proteiinin toimintaa ei ymmärretä selvästi. Olemme arveltu, että mononukleotidi suolikanavan muutokset intronin ATM
geeni liittyy menetys ATM-proteiinin funktion GC MSI.

Tässä tutkimuksessa mutaatiot introni (t) 15 sisällä ATM
geenin välissä sekvenssi (IVS) edeltävän eksonin 6, joka johtaa 22 bp: n poistuman eksonin 6 ihmisen mahasyövän solulinjoissa . Esillä olevassa tutkimuksessa mutaatiot ATM
geeni yhdessä läsnäolo MSI tutkittiin ihmisen GC solulinjoissa ja ensisijainen GC kudoksiin. Tuloksemme osoittivat, että ATM
geenin introni mutaatio oli yleisempää GC MSI ja merkitsevästi liittyy menetys ATM proteiinin toiminnan.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Tämä retrospektiivinen tutkimus tehtiin käyttämällä näytteitä yli hyllyt jälkeen patologisen diagnoosin, ja kaikki näytteet anonymisoidaan ennen tutkimusta. Tämä retrospektiivinen tutkimus hyväksyi Institutional Review Board of Seoul National University Hospital (H-1010-065-336) kanssa luopuminen tietoisen suostumuksen edellyttäen että nimettömäksi.

Solulinjat ja kudosnäytteiden

Kymmenen ihmisen mahalaukun syöpäsolu lines- SNU-1, SNU-5, SNU-16, SNU-216, SNU-484, SNU-601, SNU- 620, SNU-638, SNU-668 ja SNU-719 saatiin Korean Cell Line Bank (Seoul, Korea). Kaikki solulinjat kasvatettiin RPMI1640 täydennettynä 10% naudan sikiön seerumia (FBS; Hyclone, Lorgan, UT, USA) ja antibiootteja (100 U /ml penisilliini G ja 100 ug /ml streptomysiiniä), 37 ° C: ssa kostutetussa 5% CO _{2-inkubaattorissa. Solu-line kudoksen array slide valmistettu korjattu ja kiinteän ihmisen GC solulinjat saatiin immunohistokemiallinen (Superbiochips, Korea).}

Formaliinifiksoidusta, parafinoidut GC kudosnäytteiden 839 potilasta joille tehtiin parantava gastrectomy varten ensisijainen mahasyöpä kohtelu 1 ^{tammikuuta 2004 ja 31 st joulukuussa 2005 Seoul National University Hospital kerättiin. Potilaat mukana 577 miestä ja 262 naista, joiden keski-ikä oli 57,6 vuotta (vaihteluväli: 4-87 vuotta). Tiedot kasvaimen sijainti saatiin 835 tapauksista: ylempi kolmas 109, keskimmäinen kolmas 323, alempi kolmas 383, ja koko mahassa 20 tapauksessa. Perustuu Lauren luokittelun syövät olivat histologisesti luokiteltu suoliston kirjoita 381, diffuusi tyyppi 327, sekamuotoinen vuonna 123, ja määrittelemätön 8 tapauksissa. Niistä 839 tapauksessa oli 165 varhainen GC ja 674 oli kehittynyt GC. Imusolmuke etäpesäke oli läsnä 531 tapauksissa ja poissa 308 tapauksissa. Kaksisataa ja neljäkymmentäviisi potilasta diagnosoitu vaiheessa I, 254 kuten vaiheessa II, 291 kuten vaiheessa III, ja 85 kuten vaihe IV. Adjuvanttihoitoa leikkauksen jälkeen suoritettiin 533 potilaalla, joka sisältää 32 potilasta vaiheessa I, 153 vaiheessa II, 260 vaiheessa III, ja 82 vaiheen IV. Keskimääräinen seuranta-aika oli 49,3 kuukautta (vaihteluväli 0-85 kuukautta). Paikalliset toistumisen todettiin 185 (21,0%), kaukainen etäpesäke 85 (9,6%), ja kuolema tahansa syy 289 ulos 882 potilasta (32,8%). Potilaan selviytyminen tiedot, mukaan lukien päivämäärät ja kuolinsyitä, saatiin Korean Central Syöpärekisteri, terveys- ja hyvinvointi, Koreassa. Standard histopatologinen tutkimus sisältyy arvio syöpätyypin ja patologinen kasvain vaiheessa perusteiden mukaisesti perustetun 7. Edition AJCC Välivarastointi Manual [15].}

DNA: n eristämistä ja MSI määritys

Tuumorikudos näytteet lasilevyille tutkittiin valomikroskoopilla. Alueen kasvaimen, jossa prosenttiosuus kasvainsolujen ylitti vähintään 50% kaikista soluista, jotka alue ja pariksi alueen normaalin limakalvon, jossa ei ole kasvainsoluja merkitty ja kaavitaan veitsen terä. Kaavinlämmönvaihdinta kudos kerättiin 1,5 ml: n mikroputkiin, jotka sisälsivät 50 ui kudosta lyysipuskuria (0,5% Tween 20 [Sigma, St. Louis, MO], 100 mM Tris-HCl-puskuria [pH 7,6], 1 mM EDTA: ta, ja 20 ug proteinaasi K [ ,,,0],Sigma]). Putkia inkuboitiin 24-48 tuntia 55 ° C: ssa, kunnes kudos sisältävää hajotuspuskuria tuli selväksi. Proteinaasi K inaktivoitiin inkuboimalla 95 ° C: ssa 10 minuuttia, ja uutettiin DNA säilytettiin -20 ° C: ssa käyttöön asti. MSI on arvostettu loci BAT25, BAT26, D2S123, D5S346, ja D17S250. Kasvaimet luokitellaan MSI +, kun vähintään 2 (40%) ja 5 mikrosatelliittimarkkerin liittyi alleelien muuttunut koko kasvaimen DNA verrattuna DNA: n kanssa ei-kasvainkudoksessa.

havaitseminen mutaatioiden ATM
on intronin mononukleotidi toistaa

PCR-monistus suoritettiin 10 ul: n tilavuudessa, joka sisälsi 1 ui genomista DNA: ta, 5 pmol kutakin eteenpäin ja taaksepäin-alukkeita, ja 5 ui Premix. Kolmekymmentä kolme PCR-sykliä suoritettiin työkiertoparametrin 95 ° C 30 sekuntia, 30 sekuntia lämpökäsittelylämpötilaan sopivat kullekin alukeparia ja 65 ° C 1 min, jota seurasi 10 min pidennys 72 ° C: ssa.

vaihtelu mononukleotidi toista ATM
geeni havaittiin käyttäen PCR-pohjainen määritys. Perimän DNA monistettiin primers- F-CCTTTTTCTGTATGGGATTATGG, R-TGAACATCTTGTGAAGGTTTCAG varten exon6 (T) 15 (155 emäsparia), F-TCCTTTTAGTTTGTTAATGTGATGGA, R-GCTGTTGGGGTAGAAGCTGA varten exon10 (T) 15 (165 emäsparia), ja F-GCCAATGGAAGATGTTCTTGA, R- CATCTTGGTCACGACGATACA for exon20 (T) 15 (178 emäsparia).

Detection poikkeavan silmukoinnin ATM

Kokonais-RNA (2,5 ug) ihmisen mahasyöpä solulinjoissa valmistettiin Trizol-reagenssia (GIBCO-BRL) käytettiin ensimmäisen juosteen cDNA-synteesi Superscript II Reverse Transcriptase (GIBCO-BRL) ja oligo-d (T) _{12-18-aluketta. Alikvootti reaktioseos monistettiin PCR: llä syntetisoimaan eri segmenttejä ATM cDNA.}

PCR-monistus suoritettiin 20 ul: n tilavuudessa, joka sisälsi 1 ui käänteistranskriptoidaan cDNA, 5 pmol kutakin eteenpäin ja taaksepäin-alukkeita, ja 10 ui Premix. Kolmekymmentäviisi sykliä PCR: ää suoritettiin työkiertoparametrin 95 ° C 30 sekuntia, 30 sekuntia lämpökäsittelylämpötilaan sopivat kullekin alukeparia ja 72 ° C 1 min, jota seurasi 10 min pidennys 72 ° C: ssa. PCR-tuotteet ajettiin elektroforeesilla 2% agaroosigeelillä, joka sisälsi etidiumbromidia ja visualisoitiin UV-valon alla. β-aktiini on käytetty sisäisenä standardina.

kolme RT-PCR-alukeparia, jotka ovat peräisin ATM
sekvenssejä (GenBank NM_000051), jota käytetään oli F-TGGTGCTATTTACGGAGCTG ja R-TTCGAAAGTTGACAGCCAAA havaita selostukset eksonin 5-7 (tuote koko: 347 bp), F-TCCCTTGCAAAAGGAAGAAA ja R-TACTGGTGGTCAGTGCCAAA eksonille 9-11 (tuote koko: 504 emäsparia), ja F-TGGAGAAGAGTACCCCTTGC ja R-GATTGACTCTGCAGCCAACA eksonille 19-22 (tuote koko: 415 emäsparia ).

Sekvensointianalyyysi

Sekvensointi suoritettiin dideoksi-ketjun päättymisen menetelmällä käyttämällä DNA-sekvensoinnin kittiä (Applied Biosystems) ja ABI PRISM 310 Genetic Analyzer. Monistetut PCR-tuotteet puhdistettiin entsymaattisesti käyttämällä presequencing (Amersham Life Science, Cleveland, OH, USA), mukaisesti valmistajan ohjeiden, ja sitten sekvensoitiin suoraan käyttäen BigDye Terminator menetelmää (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Sekvensointireaktiot ajettiin ABI 3100 automaattisen sekvensserin (Applied Biosystems, Biosystems, Foster City, CA, USA), ja saadut tiedot analysoitiin käyttämällä DNA-sekvenssianalyysi, 3,7-ohjelmisto (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Uudet tiedot on talletettu GenBank (hakunumero: KF704396).

immunohistokemia

edustaja kasvain-lohko-ja solu-linjajärjestelmä osat 4 um paksuus poistettiin parafiini ja niihin lisätään arvostellaan alkoholia. Antigeeni haku saavutettiin paine -cooking näytteet 0,01 mol /l sitraatti- puskurissa 5 min. Kani monoklonaalinen vasta-aine (klooni Y170 saatu Epitomics, Burlingame, CA, USA) käytettiin immunohistokemiaa. ATM värjättiin tumassa normaalin mahan limakalvon, stroomasolut, ja lymfosyytit. Intensiteetti luokiteltiin 0 (täysin negatiivinen), ± (epäselvä värjäytyminen, signaali havaitaan vain suuritehoisia mikroskopiaan × 40 okulaari), + /3 (heikko positiivinen), ++ /3 (kohtalaisen positiivinen) ja +++ /3 (voimakkaasti positiivinen, lähes yhtä lymfosyyttien ja neutrofiilien). Kriteerit negatiivista tapausta asetettiin alle 10% soluista värjättiin heikko positiivinen (+ /3) tai suurempi intensiteetti, joka on yli 90% soluista osoittaa täysin kielteisesti (0) tai epäselviksi värjäys (±) [2 ].

tilastollinen

SPSS 15.0 paketti käytettiin tilastollisia analyysejä. Chi-square testi ja Coxin suhteellisten riskien mallia käytettiin. Kaikki P-arvot ovat kaksipuolisia ja P-arvot < 0,05 pidettiin merkittävinä, että tilastollisia menetelmiä tässä tutkimuksessa.

Tulokset

Mutaatio introni mononukleotidi toistoa ATM geenin ihmisen mahalaukun syöpäsolulinjoja

Niistä 10 ihmisen mahasyövän solulinjoissa, SNU-1 ja SNU-638 luonnehdittiin MSI positiivinen, ATM
geenimutaatioita positiivinen ja ATM menetystä IHC. In SNU-1 ja SNU-638, 22 emäsparin deleetio eksonista 6 havaittiin RT-PCR: llä, ja se vahvistettiin myöhemmin sekvenssianalyysillä (kuvio 1). SNU-5, SNU-16, SNU-484, SNU-601, SNU-620, SNU-668, ja SNU-719 olivat MSI negatiivisia ja oli villityypin ATM
geeni. Vaikka SNU-216 oli MSI negatiivinen, se kanna mutaatiot ATM
geeni, ja oli vahva ATM ilmaisun havaita IHC (taulukko 1).
MSI
ATM
geenimutaatio introni mononukleotidi toistuu
ATM
sekvensointi
ATM
RT-PCR
ATM IHC
Bat 26
Bat 25
IVS 6
IVS 10
IVS 20
eksoni 6
Exon 10
eksoni 20
eksoni 6
eksoni 10
eksoni 20
SNU-1 +++++ 22-bp delnono22-emäsparin delnonoNegativeSNU-5 ----- nonononononoPositiveSNU-16 ----- ndndndnononoPositiveSNU-216 - +++ nononono nonoPositiveSNU-484-----ndndndnononoPositiveSNU-601-----ndndndnononoPositiveSNU-620-----ndndndnononoPositiveSNU-638+++++22-bp delnono22-emäsparin del nonoNegativeSNU-668 ----- ndndndnononoPositiveSNU-719 ----- ndndndnononoPositiveTable 1. mikrosatelliittien epävakautta tila ja ATM
geeni profiilit ihmisen mahasyövän solulinjoissa.
IVS, välisekvenssin; IHC, immunohistokemia. CSV Lataa CSV

Mutaatio intronin mononukleotidi toistoa ATM
geeni ja mikrosatelliittien epävakautta mahasyövässä kudoksessa

taajuus introni mutaation ATM
geenin määritettiin kuten 12,9% (78/604). Taajuus ATM
geenimutaatio oli 9,3% (50/540) intronissa edeltävän IVS 6; 11,0% (59/534) intronissa edellisessä IVS 10 ja 8,8% (46/523) intronissa edeltävän IVS 20; niiden joukossa, IVS 6 ja IVS 10 päällekkäin 39, IVS 10 ja IVS 20 35, IVS 10 ja IVS 20 34, IVS 6, IVS 10 ja IVS 20 31 tapauksessa (taulukko 2). Taajuudet MSI positiivisuus oli 9,2% (81/882) ja ATM-proteiini tappio oli 15,2% (134/839) Tutkimuksessamme GC. Vuonna 596 tapauksissa yhdistysten keskuudessa MSI (kuvio 2A), ATM geenimutaatio (kuva 2B), ja ATM-proteiinin menetys (kuva 3) analysoitiin. ATM
intronin mutaatio ja ATM-proteiinia tappio havaittiin 69,3% (52/75) ja 53,3% (40/75) MSI positiivisia GC. MSI positiivisuus ja ATM-proteiinin menetys oli läsnä 68,4% (52/76) ja 48,7% (37/76) GC ATM introni mutaatio. MSI positiivisuus ja ATM introni mutaatio havaittiin 35,7% (40/112) ja 33,0% (37/112) GC ATM-proteiinin menetys (taulukko 3). Taajuus ATM IHC tulokset osoittivat merkittävästi suuremman ATM menetys alaryhmässä MSI positiivinen ja ATM
mutaatio positiivinen GC (kuvio 4A). Kolmekymmentä kolme 596 tapausta (5,5%) on kaikki kolme molekyyli- ominaisuudet (kuva 4B).
Sijainti
Toistot (villityyppi) B Intron mutaatio GC
Intron mutaatio MSI positiivinen GC
Intron mutaatio ATM IHC negatiivinen GC
ATM
IVS 6 (T) _{1550/540 (9,3%) 42/50 (84,0%) 29/111 (26,1%) ATM
IVS 10 (T) 1559/534 (11,0%) 47/59 (78,7%) 29/111 (26,1%) ATM
IVS 20 (T) 1546 /523 (8,8%) 34/46 (73,9%) 22/107 (20,6%) ATM
IVS 6 tai IVS 10 tai IVS 20 (T) 1578/604 (12,9%) 53/76 (69,7%) 37/112 (33,0%) Taulukko 2. Incidencies on ATM
geenin introni mutaatio syöpien (GC).
IVS, välissä sekvenssi; MSI, mikrosatelliitti epävakautta; IHC, immunohistokemia. CSV Lataa CSV
ATM IHC
MSI
ATM
mutaatio
N
Negative
Positiivinen
NegativeNegative49768 (13,7 %) 429 (86,3%) Positive244 (16,7%) 20 (83,3%) Subtotal52172 (13,8%) 449 (86,2%) PositiveNegative237 (30,4%) 16 (69,6%) Positive5233 (63,5%) 19 (36,5%) Subtotal7540 (53,3 %) 35 (46,7%) Negative52075 (14,4%) 445 (85,6%) Positive7637 (48,7%) 39 (51,3%) Total596112 (18,8%) 484 (81,2%) Taulukko 3. Taajuus ATM-proteiinin ilmentymistä alaryhmiin microsatellite epävakaus (MSI) asema ja ATM
intronin mutaatio.
CSV Lataa CSV}

ennusteeseen viittaavia korrelaatiot ATM
geenimutaatiokoe GC

GC potilaalla on ATM
geenimutaatio liittyi vanhuuteen, suuri kasvain koon, distaalinen sijainnin, suoliston tyyppi, syvempi invaasio, ja pienempi toistumisen korko. GC potilaalla on negatiivinen ATM IHC liittyi vanhuuteen, suuri kasvain koon, hyvin kohtalaisen eriytetty tyyppi, ja suoliston tyyppi Laurenin luokittelun (taulukko S1). Chi-neliö testi ATM
geenimutaatio tilaansa ATM IHC negatiivisten ja positiivisten ryhmien ennusteeseen viittaavia muuttujia suoritettiin. ATM IHC negatiivinen ryhmä, ATM
mutaatio positiivinen GC liittyivät vanhuuteen (P = 0,032) ja distaalisen sijainti (P ​​= 0,045). ATM IHC positiivinen ryhmä, ATM
geenimutaatio liittyi hyvin tai kohtalaisesti eriytetty tyyppi GC (P = 0,022) (taulukko S1).

Survival analyysi

Coxin suhteellisten riskien mallia käytettiin sekä yhden ja usean testejä. Univariate Coxin regressioanalyysi varten eloonjäämiseen ja taudista vapaan eloonjäämisen osoitti merkittäviä ennustearvo joidenkin vakiintuneiden ennustetekijöiden kuten imusolmuke etäpesäke, syvyys kasvain, ja Lauren n luokittelu histologisen tyypin. Potilas ryhmä, joka sai adjuvanttia chemotherpy oli merkitsevästi korkea suhteellinen riski kokonaisuudessaan (OS) ja sairauksien elinaika (DFS) (P < 0,001, suhteellinen riski = 3,82 [95,0% CI, 2,81-5,18] OS ja P < 0,001, suhteellinen riski = 5,63 [95,0% CI, 3,69-8,58] DFS). Ei kuitenkaan ole merkittäviä suuntauksia suhteellisen riskin (RR) havaittiin ATM
introni mutaatio, MSI, tai ATM IHC menetys. Monimuuttujamenetelmin muuttujia syvyyttä kasvaimen, imusolmuke tila, Lauren: n luokittelu histologisen tyypin, adjuvanttihoitoa, ATM
intronin mutaatio, ja ATM-proteiinin ilmentyminen suoritettiin. ATM introni mutaatio on alhaisempi suhteellinen riski rajatapaus merkitystä kokonaiselinaikaa (P = 0,05, suhteellinen riski = 0,60, [95,0% CI 0,36-1,00]) (taulukko 4).
Overall Survival

Tautivapaa elossaolo
Suhteellinen riski
95,0% CI
P arvo
N
Suhteellinen riski
95,0% CI
P arvo
N
Advanced Mahalaukun Cancer8.263.00-22.750.005965.051.81-14.130.00544Lymph solmun positive6.663.47-12.770.005963.201.58-6.480.00544Diffuse tyyppi histology1.431.06 -1.940.025961.611.09-2.360.02544Adjuvant chemotherapy0.990.57-1.730.985962.171.00-4.720.05544 ATM
intronin mutation0.600.36-1.000.055960.560.29-1.080.08544ATM proteiinia loss1.190.82-1.730 .355961.100.67-1.810.70544Table 4. Monimuuttuja Coxin regressioanalyysiä.
CSV Lataa CSV

keskustelu

Tuloksemme osoittivat, että mutaatiot introni toista ATM
geeni johtaa poikkeava liittämiseen, mikä 22 emäsparin poistamisen ja ATM-proteiinin ilmentymisen menetyksen GC solulinjoissa. Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia ​​edellisen raportin [13] perusteella, joka liittyy silmukointioperaation vika MRE11
edeltäjä transkriptio liittyy mutaatioita poly (T) 11 toista kuluessa välisekvenssin 4 (IVS-4), yksinomaan MMR-puutosta syöpäsolulinjoista ja ensisijainen kasvaimia. Tuloksemme paljasti, että ATM-proteiini tappio GC merkittävästi korreloi läsnä introni geenin mutaation ATM
.

ataksia-verisuoniluomen potilaista, 70% -90% ja ATM
mutaatiot ovat hölynpölyä, runko muutos, tai pleissauksia mutaatioita, jotka katkaista proteiini [16]. Mukaan COSMIC tietokantoihin (http://www.sanger.ac.uk/cosmic), mutaatiot koodaavat alueet ATM
geenin havaittiin 5% (433 9249) erilaisten syöpien. Joukossa mahasyöpä osoitti mutaation ainoastaan ​​1,35% (1 74). Vaikka ATM
geenimutaatiokoe GC ilmoitettiin aiemmin [3,9], tyhjentävä selitys rajoitti matalataajuista mutaation ja suhteellisen korkea esiintyvyys menettänyt ATM [2]. Tutkimuksessamme noin 70% MSI positiivisia GC osoitti merkittäviä ATM
geenin introni mutaatio liittyy ATM-proteiinin menetys. Tuloksemme tukevat vahvasti, että introni-mutaatio ATM
perussairaus MSI on yksi tärkeimmistä mekanismeista ATM menetyksen ihmisen GC. ATM menetys johtuu poikkeavasta liittämiseen liittyy introni lyhentäminen MSI positiivinen paksusuolen syövän solulinjoissa. Ejima et ai. etsinyt ATM
geenimutaatioita käyttäen 62 oligonukleotidialukeparia, joka vastaa aluetta vaihtelevat eksoni 4 kautta eksonissa 65 ATM
ja sitä reunustavat intronit. Lyhentäminen mononukleotidi kirjoitusten ATM
intronit osuus oli 34 (87%) 39 introni muutoksia. Kolmekymmentä-yksi heistä löydettiin 5 paksusuolen kasvainten solulinjoissa ottaa MSI (LS180, HCT15, HCT116, SW48, ja LoVo). He osoittivat myös alhainen ilmentyminen ATM proteiinin MSI positiivinen peräsuolen syövän solulinjoissa [14]. ATM ilmentyminen vähenee merkittävästi monissa rintakarsinoomissa, eikä löytänyt ATM
mutaatio että solulinjassa [17]. Tämä osoittaa eri ominaisuuksia ATM
geenin muutokset välillä maha ja rintasyöpiä.

lisäksi mutaatioita, tuumorisuppressorigeeneille voidaan inaktivoida metyloimalla sytosiinitähteiden sisällä CpG-saarekkeita, jotka sijaitsevat promoottori monia geenejä. ATM
geeni on uusi kohde epigeneettiset hiljentäminen sopimattoman metyloinnin proksimaalisesta promoottorialueen korreloi lisääntynyt säteilyherkkyyttä ja alhainen proteiinin ilmentymistä paksu- tuumorisolulinja [18] ja ihmisen glioomasolulinjaa [18]. ilman ATM
geenimutaatioita.

MSI kohdentamista ATM
geeni edustaa yhteyden MSI ja DNA: n korjautumista GC. Useat tutkimukset osoittavat, että toiminnallinen menetys ATM lisääntyy MSI ja ihmisen ATM
geeni on tärkeä tavoite inaktivaatiomenetelmät MSI positiivinen GC solulinjoissa ja kudoksissa [19,20]. Syynä silmiinpistävän korkea esiintyvyys ATM
geenin introni mutaatio MSI positiivinen GC saattaa johtua mononukleotidi toistoja (T) 15, ja pituus 13 nukleotidia tai enemmän olivat erityisen herkkiä tälle kohdennettua lyhentämiseksi [14 ]. Taajuus ATM
geenin lukukehyksen (T) 7 eksonissa 6 koodaavan sekvenssin MSI positiivinen GC ilmoitettiin olevan vain 6% (2/36) [8], joka on paljon alhaisempi kuin meidän havainto.

On todettu, että ATM puute herkistää solut kasvua estäviä vaikutuksia PARP estäjä, olaparib, mahasyövän solujen alennetaan ATM
ilmaisun [21]. Poly (ADP-riboosi) polymeraasin estäjät ovat tällä hetkellä arvioitu kliinisissä kokeissa vastaan ​​erilaisia ​​syöpiä, mukaan lukien paksusuolen syöpä [22]. GC, ATM puute tiedetään olevan ennustaja vastaus PARP inhibiittori [23-25]. Merkkiaine homologisen rekombinaation, Rad 51, tiedetään ennustavan merkkiaine neoadjuvant anthracylcine kemoterapian rintasyövässä [26] sekä PARP inhibiittorina GC [24].

Tuloksemme osoittivat, että ATM proteiini menetys ei ole aggressiivinen tekijä GC, vaikka se liittyy merkittävästi epäsuotuisa kehitys HR MSI negatiivinen GC. Tämä on verrattavissa muihin tutkimuksiin, jotka raportoivat ATM proteiinihäviöön haittavaikutuksena ennustetekijä [20]. Meidän tutkimuksissa ATM
mutaatio ja ATM negatiivinen GC oli selvä ennusteeseen viittaavia ominaisuuksia; kuitenkin, tämä ryhmä ei osoittanut eroa eloonjäämisessä muiden kanssa. Vuonna MSI negatiivinen ryhmä, HR GC ATM-proteiinin menetys oli huomattavan suuri, kuitenkin MSI positiivinen ryhmässä, HR GC ATM-proteiinin menetys ei ollut merkittävä. Tämä osoittaa, että MSI on mahdollinen molekyyli vaikuttava tekijä biologista käyttäytymistä GC. Siten Tutkimuksemme tukee että MSI tila voi vaikuttaa herkkyyttä PARP estäjä vaikuttamalla asemaa DNA-vaurioita vastaus proteiinin ilmentymisen kautta mononukleotidi toistuu muutoksia.

Yhteenvetona ATM
geenimutaatiokoe GC on 12,9%, ja 33,0% GC kanssa ATM
geenimutaatio liittyy ATM-proteiinin menetys. MSI positiivinen GC osoitti ATM
mutaatio 69,7%. Tuloksemme viittaavat siihen, että tulos ATM menetyksen ja herkkyyttä kemoterapeuttisten yhdiste, olaparib, voidaan ymmärtää paremmin, jos tapaukset ovat kerrostunut perustuvat ATM
geenimutaatio tila tai MSI.

Johtopäätökset

Tutkimus osoitti ATM
geeni introni mutaatio on läsnä 69% MSI positiivisia GC ja 49% ATM
introni mutaatio liittyy menetys ATM proteiinia. Nämä viittaavat siihen, ATM
geenin intronin mutaatio kohteena mikrosatelliittien epävakaus liittyy ATM-proteiinin menetys osajoukko ihmisen mahasyöpä.

tukeminen Information
Taulukko S1.
ennusteeseen viittaavia korrelaatiot mahalaukun karsinooma kanssa ATM geenimutaatio ja ATM proteiinin ilmentymiseen.
doi: 10,1371 /journal.pone.0082769.s001
(DOCX) B

• PLoS ONE: Incidence, Ennakoiva tekijät, ja kliiniset tulokset akuutti Munuaisvaurioita jälkeen Mahalaukun Leikkaus Mahalaukun Cancer
• PLoS ONE: muuntaminen Microarray allekirjoitus osaksi Diagnostiikkasivun A Trial of Custom 74 Gene Array selvennystä ja ennustaminen ennuste Mahalaukun Cancer