Plos ONE: Mutacija na intronskih ponavlja v Ataksijo-telangiektazije mutiral (ATM), Gene in ATM Protein Izguba v primarnem Rak želodca z mikrosatelitska nestabilnost

Povzetek

Ataksijo-telangiectasia mutiral (ATM) je Ser /CX protein kinaze, ki ima ključno vlogo pri DNA-poškodbe povzročene signalizacijo in uvedbo kontrolne točke celičnega ciklusa signalizacijo v odgovor agentov DNK poškodovali takšnih kot ionizirajočega sevanja. prej smo poročali izgubo ATM beljakovin z imunohistokemijo (IHC) v 16% človeškega raka želodca (GC) tkiva. Domnevali smo, da je ATM
gen intronskih mutacije, ki jih obravnava mikrosatelitnih nestabilnost (MSI) povzroči ATM izgubo beljakovin v podskupini GC. Raziskali smo mononukleotida mutacije na introna bankomati
gen, ATM IHC in MSI v GC. Deset človeških želodca rakave celične linije so preučevali za bankomati
genske mutacije pri intronov, RT-PCR, neposredno sekvenciranje in imunohistokemijo. GC tkiva 839 bolnikov, so bili analizirani za MSI in ATM IHC. Med njimi je bilo analiziranih 604 primerov za ATM
mutacije na intronov prejšnjih eksonu 6, EXON 10 in EXON 20. Dve linije človeških GC celic (snu-1 in -638) je pokazala, ATM
intronskih mutacije, izbris v RT-PCR in neposredno sekvenciranje in ATM izgube beljakovin z imunohistokemijo. Pogostnost bankomati
mutacije, MSI in ATM izgube beljakovin je bilo 12,9% (78/604), 9,2% (81/882) in 15,2% (134/839), oz. Analiza združenja med MSI, ATM genske mutacije in ATM izgube beljakovin pokazala visoko co-obstoječe ATM
genskih sprememb in MSI. ATM
so intron mutacija in ATM izguba beljakovin odkrili pri 69,3% (52/75) in 53,3% (40/75) z dne MSI pozitivne GC. MSI pozitivnost in ATM izguba beljakovin so bili prisotni pri 68,4% (52/76) in 48,7% (37/76) GC z ATM intron mutacije. bankomati
mutacija in ATM protein izguba imel značilnosti starosti, distalnem lokacijo tumorja, velikosti tumorja in histološko črevesno vrste. Naša raziskava je mogoče razlagati tako, da je bi bankomati
genske mutacije pri intronu se tarča MSI in vodijo do ATM izgubo beljakovin v izbrano skupino GC.

Navedba: Kim HS, Choi SI, Min HL, Kim MA, Kim WH (2013) Mutacija na intronskih ponavlja v Ataksijo-telangiektazije mutiral (ATM), Gene in ATM Protein Izguba v primarnem Rak želodca z mikrosatelitska nestabilnost . PLoS ONE 8 (12): e82769. doi: 10,1371 /journal.pone.0082769

Urednik: Hoguen Kim, Yonsei University College of Medicine, Republika Koreja

Prejeto: 21. julij 2013; Sprejeto: 27. oktober 2013; Objavljeno: 6. december 2013

Copyright: © 2013 Kim et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. Ta raziskave je bil podprt Basic Science raziskovalnega programa, ki ga prek nacionalnega Research Foundation Koreji (NRF), ki ga je ministrstvo za znanost, IKT &financira; Prihodnje načrtovanje (NRF-2012R1A1A2004648). Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

ataksija-teleangiektazija mutiran (ATM) gen je sestavni del DNK škode odziv (DDR) in se aktivira z DNA dvojne prelomov verige (DSBs) in označuje kontrolno točko v celični cikel, da upočasni prehod celic skozi cikel omogoča popravilo DNA. Gen je lokalizirana na kromosomu 11q22-23. bankomati
gen je zelo velika, zajema genomske regije 150 kb, ki obsega 66 eksonov z kodirne sekvence 91668 bp.

ATM je vpletena v odgovorih na DSBs, ki se pojavljajo fiziološko specializirane tipe celic kot zarodnih celic in limfocitov. Protein ATM pomaga celice pri prepoznavanju poškodovanih ali pokvarjenih pramenov DNK. Protein ATM koordinira popravljanje DNA, ki ga aktivira encime, ki popraviti zdrobljen pramene. Učinkovito popravilo poškodovanih DNK verig pomaga ohranjati stabilnost genetske informacije v celice [1]. Opazili
izguba

ATM pri 16% ljudi GC tkiva v veliki študiji kohorte [2]. Inaktivacija na bankomati
gena je lahko pogost dogodek pri razvoju raka človeške želodčne (GC); Vendar so dogodki, povezani z izgubo bankomati
izraz v GC ni bilo mogoče razložiti z nizko razširjenostjo bankomati
mutacije. Večina ATM
mutacij, opredeljenih v primarnih celičnih linijah GC in GC tkiv so točkovne mutacije [3].

popravilo DNA neusklajenost (MMR) sistem popravlja napake, ki se lahko pojavijo med replikacijo DNA, medtem ko so homologna rekombinacija in nehomolognih konec pridružili vključeni v popravilo DNA DSB. Mutacije DNA DSB popravila genov, kot so ATM, MRE11, RAD50, NBS1
in ATR
, se domneva, da igrajo pomembno vlogo pri razvoju gastrointestinalnih malignih bolezni z okvarjenim MMR funkcijo. V tumorjev debelega z oslabljenim sistemom MMR, mutacije intronskih mononukleotida ponovitev v ATM
in MRE11
je bilo ugotovljeno, da pride do odklonskega spajanja, sledi zmanjšana ekspresija divjega tipa beljakovine [4 ].

Približno 10% GC je povezana z mikrosatelitno nestabilnost (MSI). MSI nanaša na spremembe v številu nukleotidnih ponovitev v mikrosatelitni regijah, ki se nahajajo v kodirnih regij genov, in rezultate premikom bralnega okvirja. MSI je bila ugotovljena v proteinu kodiranje regije znanih ciljnih genov, vključno s TGF-βRII, IGFIIR, BAX
[7/5] in hRAD50
geni [8]. hRAD50, BLM
in BRACA1
genov imajo poli (A) mononukleotida ponavlja v kodirnih regijah, hMSH6
ima (C) 8 trakta je NBS1
ima (A) 7 trakt in ATM
ima (T) 7 trakt. Premika bralnega okvira mutacije teh genov s spremenljivimi primerov so bili prej [9-11] poročali.

Poleg številnih mutacij, zbranih v nevtralnih mikrosatelitnih zaporedij, MSI ustvarja tudi mutacije v rakavih genov, se pravi, v teh genov, ki igrajo aktivno vlogo pri večstopenjski proces rakotvornosti. Čeprav so ponavljajoče sekvence v kodirni regiji gena krajše od tipičnih mikrosatelitnih lokusov za gensko kartiranje njihovo nagnjenost za doživlja spontanih napak Odstopanje med replikacijo je še vedno višja od nonrepetitive sekvenc. so poročali mutacije za intronskih ponovitev, da povzroči poslabšano izražanje MRE11
gene [12,13]. Polypyrimidine ponovite mutacije v bankomati
gena lahko motijo ​​pravilno mRNA spleti [14]. Vendar pa ni nobenega dokaza, da je vstavljanje /brisanje, ki se pojavljajo na teh-kodiranje niso mononukleotida sekvenc motijo ​​normalno ATM funkcija beljakovin v povezano-MSI GC. V človeški GC tkiva z MSI, pogostost bankomati
mutacija in združenje z izgubo funkcije beljakovin ni jasno razumljen. Smo predpostavili, da so spremembe mononukleotida trakta v introna bankomati
gen je povezana z izgubo funkcije ATM beljakovin v PK z MSI.

Raziskovali smo mutacije na intronskih (T) 15 v bankomati
gen intervenira zaporedje (MSOV) pred eksonu 6, ki vodi do 22 bp izbrisa eksonu 6 v človeških želodčnega raka celičnih linijah . V tej raziskavi, so bili pregledani mutacije bankomati
gena skupaj s prisotnostjo MSI človeških GC celičnih linij in primarnih GC tkiv. Naši rezultati so pokazali, da je bankomati
gen intron mutacija je bila pogosta v GC z MSI je značilno povezana z izgubo funkcije ATM beljakovin.

Materiali in metode

Etika Izjava

V retrospektivno raziskavo smo izvedli s pomočjo vzorcev po policah po patološke diagnoze, in vsi vzorci so bili anonimizirani pred obravnavo. V retrospektivno raziskavo je odobril revizijski odbor institucionalne National Hospital Seul University (H-1010-065-336) z odvzem zavestne privolitve pod pogojem anonimnosti.

Celične linije in vzorce tkiva

Deset človeških želodčni rak celic lines- snu-1, snu-5, snu-16, snu-216, snu-484, snu-601, SNU- 620, snu-638, snu-668 in snu-719 so bili pridobljeni iz korejske Cell Line banke (Seoul, Koreja). Vse celične linije gojimo v RPMI1640 dopolnjenem z 10% fetalni goveji serum (FBS; Hycolne-a, Lorgan, UT, ZDA) in antibiotiki (100 U /ml penicilina G in 100 ug /ml streptomicina) pri 37 ° C v navlaženi 5% CO _{2 inkubator. Celična linija tkivo paleto slide iz pridelanega in stalnih celičnih linij človeških GC je bilo pridobljeno za imunohistokemijo (Superbiochips, Koreja).}

formalinu določen, GC vzorci tkiva, parafinske vgrajeni od 839 bolnikov, ki so imeli kurativno želodca za primarno želodca zdravljenje raka med 1 ^{januarjem 2004 in 31. st december 2005 ob Narodni in univerzitetni bolnišnici v Seulu so bili zbrani. Bolniki 577 moških in 262 žensk s povprečno starostjo 57,6 let (razpon: od 4 do 87 let). Informacije o lokaciji tumorja je bil pridobljen od 835 primerih: zgornjo tretjino 109, srednji tretjini v 323, spodnje tretjine v 383, in celotnega želodca v 20 primerih. Na podlagi razvrstitve Lauren, so rak histološko razvrščena kot črevesne vrste na 381, razpršenega tipa v 327, mešanega tipa v 123, in določen v 8 primerih. Od 839 primerov je bilo 165 zgodaj GC in 674 so napredne GC. Bezgavka metastaze je bil prisoten v 531 primerih in ni v 308 primerih. Dvesto štirideset pet bolnikov so ugotovili fazi I, 254 v fazi II, 291 v fazi III, in 85 kot odrska IV. Adjuvantno kemoterapijo po operaciji je bila opravljena na 533 bolnikih, ki vključuje 32 bolnikov v fazi I, 153 v fazi II, 260 v fazi III, in 82 pri stopnji IV. Povprečni nadaljnje obdobje je bilo 49,3 mesecev (razpon: 0-85 mesecev). Lokalni ponovitve so opazili pri 185 (21,0%), oddaljenih metastaz v 85 (9,6%), in smrti zaradi kateregakoli vzroka pri 289 od 882 bolnikov (32,8%). Bolnikov podatkov za preživetje, vključno z datumi in vzrokih smrti, so bili pridobljeni iz Korejski centralne Registra raka, Ministrstvo za zdravje in dobro počutje, v Koreji. Standardna histopatološki pregled vključenih oceno vrste raka in patološke fazi tumorja, v skladu z merili, ki jih določa 7. izdaja v AJCC počivališču Manual [15].}

ekstrakcije DNK in MSI določitev

tumorsko tkivo vzorci na steklenih ploščicah so pregledali pod svetlobnim mikroskopom. Območje tumorja, v kateri je odstotek tumorskih celic presegla najmanj 50% vseh celic v tem območju in združeno področje normalne sluznice tkiva, ki ne vsebuje tumorske celice so bili označeni in postrga z rezilom noža. Struganega tkivo zberemo v 1,5 ml mikrocevke vsebujejo 50 xl tkiva liznega pufra (0,5% Tween 20 [Sigma, St. Louis, MO], 100 mM Tris HCl pufru [pH 7,6], 1 mM EDTA in 20 ug proteinaza K [ ,,,0],sigma]). Epruvete inkubiramo 24 do 48 ur pri 55 ° C, dokler ne vsebujejo tkivo liza varovalni postalo jasno. Proteinaza K deaktivirali z inkubacijo pri 95 ° C za 10 minut in ekstrahirali DNA smo shranili pri -20 ° C do uporabe. MSI je bila ocenjena na loci BAT25, BAT26, D2S123, D5S346 in D17S250. Tumorji so razvrščene kot MSI +, ko je bilo vsaj 2 (40%) od 5 mikrosatelitskih markerjev, povezanih z alelov spremenjene velikosti v tumorja DNA v primerjavi z DNK, ki niso tumorsko tkivo.

Odkrivanje mutacij ATM
na intronu mononukleotida ponavlja

PCR smo izvedli v 10 vol! Li vsebuje 1 p genomske DNA, 5 pmol vsakega od naprej in nazaj primerji in 5 xl krmil. Triintrideset cikli PCR smo izvedli s parametrom cikla 95 ° C za 30 sekund, 30 sekund pri temperaturi žarjenja primerna za vsak oligonukleotidni pobudnik par in 65 ° C 1 min, čemur sledi 10 razširitvijo min pri 72 ° C.

Spreminjanje mononukleotida ponovitev v em> bankomati
gena

Odkrivanje odklonskega spajanje v ATM

Total RNA (2,5 mikrogramov) iz človeških želodčnega raka celičnih linij, ki jih pripravljajo Trizol reagent (GIBCO-BRL) je uporabljen za prvo sklopa cDNA sintezo z Superscript II reverzne transkriptaze (GIBCO-BRL) in oligo-d (T) _{12-18 primer. Alikvot reakcijske zmesi smo pomnožili s PCR sintetizirati različne segmente cDNA ATM.}

PCR pomnoževanje smo izvedli v volumnu 20! Li vsebuje 1 xl obrnjenimi prepisano cDNA, 5 pmol vsakega naprej in nazaj primerjev in 10 ml krmil. Petintrideset cikli PCR smo izvedli s parametrom cikla 95 ° C za 30 sekund, 30 sekund pri temperaturi kaljenja primeren za vsako oligonukleotidni pobudnik par in 72 ° C 1 min, čemur sledi 10 razširitvijo min pri 72 ° C. PCR produkti so bili elektroforezo v 2% agaroznem gelu vsebovala etidijev bromid in vizualiziramo pod UV svetlobo. β-aktin uporabimo kot interni standard.

Tri RT-PCR primarni pari, izpeljani iz ATM
sekvenc (GenBank NM_000051) bilo uporabljeno F-TGGTGCTATTTACGGAGCTG in R-TTCGAAAGTTGACAGCCAAA za odkrivanje prepis eksonu 5-7 (velikost izdelka: 347 bp), F-TCCCTTGCAAAAGGAAGAAA in R-TACTGGTGGTCAGTGCCAAA za eXON (velikost stroja: 504 bp) 9-11, in F-TGGAGAAGAGTACCCCTTGC in R-GATTGACTCTGCAGCCAACA za eXON 19-22 (velikost izdelka: 415 bp ).

analiza zaporedja

Zaporedje je bila izvedena z metodo dideoksi verige zaključevanja uporabo DNA zaporedja komplet (Applied Biosystems) in ABI PRISM 310 Genetic Analyzer. Dopolnjena produktov PCR smo očistili encimsko uporabo presequencing komplet (Amersham Life Science, Cleveland, OH, ZDA), v skladu z navodili proizvajalca, nato pa neposredno zaporedje uporabo BigDye metodo Terminator (Applied Biosystems, Foster City, CA, ZDA). Zaporedja reakcije smo izvedli na ABI 3100 avtomatizirano sekvencer (Applied Biosystems, Biosystems, Foster City, CA, ZDA) in pridobljeni podatki so bili analizirani s pomočjo analize DNK sekvenciranja 3,7 programske opreme (Applied Biosystems, Foster City, CA, ZDA). Novi podatki bil deponiran v GenBank (število pristop: KF704396)

Imunohistokemija

Reprezentativni tumor-blok profili in celic vrstice matrike deli debeline 4-im so deparaffinized in rehidrirane v razvrščanjem. alkohol. Antigen Preiskovalna smo dosegli s pritiskom -cooking vzorcev v 0,01 mol /L citratnega pufra za 5 min. zajec monoklonsko protitelo (klon Y170 pridobljeni iz Epitomics, Burlingame, CA, ZDA) smo uporabili za imunohistokemijo. ATM smo obarvali v jedru normalne želodčne sluznice, stromalnih celic in limfociti. Intenzivnost je bila ocenjena kot 0 (popolnoma negativna) ± (dvoumen obarvanje, signal opazili le pri visokih moči mikroskopije z × 40 okular), + /3 (šibka pozitivna), ++ /3 (zmerno pozitivno) in +++ /3 (zelo pozitivno, kar je skoraj enako limfocitov in nevtrofilcev). Merila za negativne primere so bili postavljeni za manj kot 10% celic, obarvanih kot šibko pozitivni (+ /3) ali višje intenzivnosti, ki je več kot 90% celic, ki kažejo povsem negativno (0) ali sumljiv obarvanje (±) [2 ].

Statistična analiza

paket SPSS 15.0 smo uporabili za statistične analize. smo uporabili test hi-kvadrat in Cox sorazmernih tveganj modela. Vsi P-vrednosti so dvostranski in P vrednosti. ≪ 0,05 bile obravnavane kot pomemben statističnih metod v tej študiji

Rezultati

Mutacija na intronskih mononukleotida ponovitev gena ATM v človeškem želodcu rakave celične linije

Med 10 človeških želodca raka celičnih linijah, snu-1 in snu-638 so bili označeni kot MSI pozitiven, bankomati
genskih mutacij pozitivni in ATM izgube po IHC. V snu-1 in snu-638, je 22 baznih parov izbris eksona 6. zazna RT-PCR in je bil potrjen v poznejši analizi zaporedja (slika 1). Snu-5, snu-16, snu-484, snu-601, snu-620, snu-668, in snu-719 je bila MSI negativen in je divji tip ATM
gen. Čeprav je snu-216 MSI negativen, je gojila mutacije v bankomati
gena, in je imel močan izraz ATM z imunohistokemijo (tabela 1) odkriti.
MSI
bankomati
genska mutacija intronskih mononukleotida ponavlja
bankomati
zaporedja
ATM
RT-PCR
ATM IHC
Bat 26
Bat 25
IVS 6
IVS 10
IVS 20
Exon 6
Exon 10
Exon 20
Exon 6
Exon 10
Exon 20
snu-1 +++++ 22-bp delnono22-bp delnonoNegativeSNU-5 ----- nonononononoPositiveSNU-16 ----- ndndndnononoPositiveSNU-216 - +++ nononono nonoPositiveSNU-484-----ndndndnononoPositiveSNU-601-----ndndndnononoPositiveSNU-620-----ndndndnononoPositiveSNU-638+++++22-bp delnono22-bp del nonoNegativeSNU-668 ----- ndndndnononoPositiveSNU-719 ----- ndndndnononoPositiveTable status 1. mikrosatelitno nestabilnost in ATM
genov profili človekovih želodčnih raka celičnih linijah.
IVS, ki intervenira zaporedje; IHC, imunohistokemija. CSV prenos CSV

mutacijo na intron mononukleotida ponovitev v bankomati
genov in mikrosatelitne nestabilnosti v želodcu tkivu raka

Pogostost intronskih mutacije v bankomati
gen je bil določen kot 12,9% (78/604). Pogostost bankomati
genska mutacija je bila 9,3% (50/540) v intronu prejšnjega MSOV 6; 11,0% (59/534) v intronu prejšnjem MSOV 10 in 8,8% (46/523) v intronu prejšnjega IVS 20; med njimi, IVS 6 in IVS 10 prekrivale 39, MSOV 10 in MSOV 20, 35, IVS 10 in IVS 20 na 34, IVS 6, IVS 10 in IVS 20 v 31 primerih (tabela 2). Frekvence MSI pozitivnosti je bila 9,2% (81/882) in ATM izguba beljakovine je bila 15,2% (134/839) v naši raziskavi GC. V 596 primerih so bili analizirani zveze med MSI (slika 2A), ATM genskih mutacijah (slika 2B), in ATM izguba proteina (slika 3). ATM
so intron mutacija in ATM izguba beljakovin odkrili pri 69,3% (52/75) in 53,3% (40/75) z dne MSI pozitivne GC. MSI pozitivnost in ATM izguba beljakovin so bili prisotni pri 68,4% (52/76) in 48,7% (37/76) GC z ATM intron mutacije. MSI pozitivnost in ATM intron mutacija so odkrili pri 35,7% (40/112) in 33,0% (37/112) GC z ATM izgubo beljakovin (tabela 3). Pogostost rezultatov ATM IHC pokazala bistveno višjo izgubo ATM v podskupini MSI pozitivne in ATM
mutacijo pozitiven GC (slika 4A). Trideset tri od 596 primerov (5,5%) imajo vse tri molekularnih značilnosti (Slika 4b).
Lokacija
ponavlja (divji tip)
Intron mutacije v GC
Intron mutacija v MSI pozitivno GC
Intron mutacija v ATM IHC negativno GC
em <> ATM
IVS 6 (T) _{1550/540 (9,3%) 42/50 (84,0%) 29/111 (26,1%) ATM
IVS 10 (T) 1559/534 (11,0%) 47/59 (78,7%) 29/111 (26,1%) ATM
IVS 20 (T) 1546 /523 (8,8%) 34/46 (73,9%) 22/107 (20,6%) ATM
IVS 6 ali IVS 10 ali IVS 20 (T) 1578/604 (12,9%) 53/76 (69,7%) 37/112 (33,0%) Tabela 2. Incidencies za bankomati
gen intron mutacija v želodcu raka (PK)
MSOV, ki intervenira zaporedje.; MSI, mikrosatelitno nestabilnost; IHC, imunohistokemija. CSV Prenesi CSV
ATM IHC
MSI
ATM
mutacija
N
Negative
Pozitivni
NegativeNegative49768 (13,7 %) 429 (86,3%) Positive244 (16,7%) 20 (83,3%) Subtotal52172 (13,8%) 449 (86,2%) PositiveNegative237 (30,4%) 16 (69,6%) Positive5233 (63,5%) 19 (36,5%) Subtotal7540 (53,3 %) 35 (46,7%) Negative52075 (14,4%) 445 (85,6%) Positive7637 (48,7%) 39 (51,3%) Total596112 (18,8%) 484 (81,2%) Tabela 3. Pogostost ATM beljakovin izražanja v podskupine glede na mikrosatelita nestabilnost status in (MSI) ATM
intron mutacija.
CSV prenos CSV}

Clinicopathologic medsebojne povezave bankomati
genske mutacije v GC

GC bolnikih z bankomati
genske mutacije so bile povezane s starostjo, velikosti tumorja, oddaljenem kraju, črevesne vrste, globlje invazije, in nižje ponovitve stopnji. bolniki GC z negativnim ATM IHC so bile povezane s starostjo, velikosti tumorja, dobro do zmerno diferenciranega vrsto in črevesnih vrsti klasifikacije Lauren (tabela S1). Hi-kvadrat test bankomati
stanje genske mutacije v ATM IHC negativne in pozitivne skupine z clinicopathologic spremenljivk je bila izvedena. V negativnem skupini ATM IHC, bankomati
mutacijo pozitiven GC so bili povezani s starostjo (P = 0,032) in oddaljenem mestu (P = 0,045). V pozitivni skupini ATM IHC, bankomati
genska mutacija je bila povezana z dobro ali zmerno diferenciranega vrsto GC (P = 0,022) (tabela S1).

Survival analiza

Cox sorazmernih tveganj model je bil v obeh univariatne in multivariatne teste. Univariatna Cox regresijska analiza celokupnega preživetja in brez bolezni preživetje je pokazala pomembno napovedno vrednost nekaterih uveljavljenih prognostičnih dejavnikov, kot so na bezgavkah metastaze, globine tumorja in razvrstitve Lauren za histološki tip. Skupina bolnik, ki je prejel adjuvantno chemotherpy imel precej visoko relativno tveganje za splošno (OS) in brez bolezni (DFS) (P < 0,001, relativnega tveganja = 3,82 [95,0% IZ, 2,81-5,18] za OS in P < 0,001, Relativno tveganje = 5,63 [95,0% IZ, 3,69-8,58] za DFS). Vendar pa je bilo opaziti nobenih večjih trendi relativno tveganje (RR) za bankomati
intron mutacije, izgubo MSI, ali ATM IHC. Multivariatna analiza z uporabo spremenljivk globino tumorja, stanje bezgavko, klasifikacija Lauren je na histološki tip, adjuvantno kemoterapijo, ATM
je bila izvedena intron mutacija, in ATM protein izraz. ATM intron mutacija ima nižjo relativno tveganje z mejno pomena za celokupno preživetje (P = 0,05, relativna tveganja = 0,60, [95,0% CI 0,36-1,00]) (tabela 4).
Celokupno preživetje

bolezni preživetje brez

Relativno tveganje
95,0% CI
P vrednost
N
Relativna tveganja
95,0% CI
P vrednost
N
Napredno želodca Cancer8.263.00-22.750.005965.051.81-14.130.00544Lymph vozlišča tipa positive6.663.47-12.770.005963.201.58-6.480.00544Diffuse histology1.431.06 -1.940.025961.611.09-2.360.02544Adjuvant chemotherapy0.990.57-1.730.985962.171.00-4.720.05544 ATM
intron mutation0.600.36-1.000.055960.560.29-1.080.08544ATM protein loss1.190.82-1.730 .355961.100.67-1.810.70544Table 4. Multivariatno Cox regresijska analiza.
CSV prenos CSV

Pogovor

Naši rezultati so pokazali, da mutacije na intron ponovitev v bankomati
gena za posledico zmotno spajanje, ki vodi do 22 bp izbrisa in ATM beljakovin izgubo izražanja v GC celičnih linijah. Ti rezultati so v skladu s predhodnim poročilom [13] v zvezi z identifikacijo prepletene napake v MRE11
predhodnik prepis povezana z mutacijami s poli (T) 11 ponovitev v intervenira zaporedje 4 (IVS-4), izključno v MMR s pomanjkanjem raka celičnih linij in primarnih tumorjev. Naši rezultati so pokazali, da ATM izguba beljakovin v GC močno korelira s prisotnostjo intronskih genskih mutacij v ATM
.

Pri bolnikih, ataksija, telangiektazije, 70% -90% od ATM
mutacije so nesmisel, frame shift, ali spajanje mutacije, ki odreže protein [16]. Po COSMIC podatkovnih baz (http://www.sanger.ac.uk/cosmic), mutacije na kodiranje regije bankomati
gen so odkrili pri 5% (433 od 9249), različnih vrst raka. Med njimi rak želodca pokazala mutacijo samo 1,35% (1 74). Čeprav bankomati
genske mutacije v GC so že poročali [3,9], celovita razlaga je bila omejena zaradi nizke pogostosti mutacije in relativno visoko stopnjo funkcionalne izgube ATM [2]. V naši raziskavi, približno 70% MSI pozitivnega GC je pokazala pomemben ATM
genske intronskih mutacije, povezane z ATM izgubo beljakovin. Naši rezultati močno podpira to intronskih mutacijo ATM
z osnovnim MSI je eden od glavnih mehanizmov izgube ATM v človeški GC. ATM izgubo pripisujejo odklonskega preplete, povezane z intronskih skrajšanjem v MSI pozitivnih celičnih linijah debelega črevesa, raka. Ejima sod. Iskali ATM
genske mutacije, ki uporabljajo 62 parov oligonukleotidnih primerjev, ki ustrezajo območju, ki sega od eksonu 4 do eksonu 65 ATM
in njeni spremljevalni intronov. Skrajšanje mononukleotida predelov ATM
introni predstavljali 34 (87%) od 39 intronskih sprememb. Enaintrideset izmed njih so našli v 5 kolon-tumorskih celičnih linij, ki imajo MSI (LS180, HCT15, HCT116, SW48 in Lovo). Pokazali so tudi nizko izražanje ATM beljakovin v MSI pozitivnih kolorektalnega raka celičnih linij [14]. Izraz ATM je bistveno zmanjšala v mnogih karcinomov dojke, in ni našel ATM
mutacijo v tej celični liniji [17]. To kaže na različne značilnosti ATM
genske spremembe med raka prebavil in dojke.

Poleg mutacij, lahko zaviralnih genov se aktivira s metilacije ostankov citozina v CpG otokov, ki se nahajajo v promotor številnih genov. bankomati
gen nov cilj za epigenetske utišanje z neprimerno metilacije njegovega proksimalnega promotorja regiji povezana s povečanim radiosensitivity in nizko izražanje proteinov v človeškem debelem tumorske celične linije [18] in glioma človeške celične linije [18]. brez ATM
genskih mutacij.

MSI ciljanje na bankomati
gena predstavljajo vez med MSI in popravilo DNA v GC. Številne študije kažejo, da je funkcionalna izguba ATM povečal MSI in človeška bankomati
gen je glavni cilj za inaktivacijo v MSI celičnih linijah pozitiven GC in tkiv [19,20]. Razlog za izredno visoko incidenco bankomati
gen intron mutacija v MSI pozitivno GC morda zaradi mononukleotida ponovitev (T) 15, in dolžino 13 nukleotidov ali več so še posebej dovzetni za to ciljno skrajšanje [14 ]. Pogostost je poročal bankomati
gen premika bralnega okvira mutacija (T) 7 v eksonu 6 kodira v MSI pozitivno GC, da je le 6% (2/36) [8], ki je precej nižja od našega opazovanja.

se je poročalo, da pomanjkanje ATM sensitizes celice na učinke rasti zavira z PARP inhibitorja, olaparib, pri želodčnih rakavih celic z zmanjšano bankomati
izražanja [21]. Poli (ADP-riboza) inhibitorji polimeraze so trenutno v kliničnih preskušanjih pred različnimi vrstami raka, vključno z rakom debelega črevesa [22]. V GC, je pomanjkanje ATM znano, da je napovedovalec odgovor PARP zaviralec [23-25]. Marker za homologno rekombinacijo, Rad 51, je znano, da napovedni marker neadjuvantno kemoterapijo na osnovi anthracylcine pri raku dojke [26], kot tudi inhibitor PARP v GC [24].

Naši rezultati so pokazali, da ATM izguba beljakovin ni agresiven dejavnik GC, čeprav je močno povezana z neugodnim trendom VP v MSI negativno GC. To je primerljivo z drugimi študijami, ki poročajo ATM izgubo beljakovin kot neželenem prognostični dejavnik [20]. V naših raziskavah, bankomati
mutacija in ATM negativen GC imeli različne clinicopathologic značilnosti; Vendar pa ta skupina ni pokazala razlike pri preživetju z drugimi. V MSI negativni skupini, je HR GC z ATM izgubo beljakovin precej visoka, vendar pa se v MSI pozitivni skupini, VP v PK z ATM izgubo beljakovin ni bila pomembna. To pomeni, da je MSI potencialni molekularno dejavnik, ki vpliva na biološko obnašanje GC. Tako je v naši raziskavi podpira, da bi MSI stanje vpliva na občutljivost zaviralec PARP, ki vplivajo na stanje škode DNA izražanja odgovor beljakovin z mononukleotida ponavlja sprememb.

Če povzamemo, bankomati
genske mutacije v GC je 12,9% in 33,0% za GC s bankomati
genska mutacija povezana z ATM izgubo beljakovin. MSI pozitiven GC pokazala ATM
mutacijo v 69,7%. Naši rezultati kažejo, da lahko izid izgube ATM in občutljivost na kemoterapevtskih spojine, olaparib, bolje razumeti, če se zadeve stratificiran glede na bankomati
stanje genske mutacije ali MSI.

Sklepi

Naša raziskava je pokazala, bankomati
gen intron mutacija prisotna v 69% MSI pozitivne GC in 49% ATM
intron mutacija je povezan z izgubo ATM beljakovin. Ti predlagam bankomati
gen intron mutacija tarča mikrosatelitnih nestabilnosti je povezana z ATM izgubo beljakovin v podskupini raka človeškega želodca.

Podpora Informacije
Tabela S1.
Clinicopathologic medsebojne povezave želodčnega raka z ATM genske mutacije in ATM beljakovin izražanja.
doi: 10,1371 /journal.pone.0082769.s001
(DOCX)

• Plos ONE: Pogostnost, napovedno dejavniki, in Klinični izidi akutne ledvične poškodbe po želodca kirurgijo za želodca Cancer
• Plos ONE: Pretvorba mikromrež Podpis v Diagnostic Test: preskušanju meri 74 Gene Array za pojasnilo in Napoved Prognoza želodca Cancer