PLoS ONE: Мутация в интронных повторами Атаксия-Телеангиоэктазии Мутировавшая (ATM) генов и белков Потеря ATM в первичной рака желудка с микросателлитных Нестабильность

Абстрактный
<р> атаксия-телеангиэктазия мутировал (ATM) является протеинкиназа Ser /Thr, который играет важную роль в ДНК сигнализации и инициирования контрольной точки клеточного цикла повреждения индуцированной сигнализации в ответ на повреждения ДНК агенты, такие как ионизирующее излучение. Ранее мы уже сообщали о потере белка ATM с помощью иммуногистохимии (IHC) в 16% человеческого рака желудка (GC) ткани. Мы предположили, что ATM
ген интронов мутации мишенью микросателлитных нестабильности (MSI) приводит к потере белка ATM в подгруппе GC. Мы изучали мононуклеотидных мутации в интроне ATM
ген, ATM IHC и MSI в GC. Были изучены десять желудка линий раковых клеток человека для ATM
мутации гена в интронов, ОТ-ПЦР, прямое секвенирование и иммуногистохимии. Были проанализированы GC ткани 839 пациентов для MSI и ATM IHC. Среди них, 604 случаев были проанализированы на ATM
мутации в интроны предыдущих экзоне 6, экзон 10 и экзона 20. Две линии клеток человека GC (СНУ-1 и -638) показал ATM
интронов мутации, делеции в оТ-ПЦР и прямой последовательности, а также потеря белка ATM с помощью IHC. Частоты ATM
мутации, потери белка MSI, и ATM были 12,9% (78/604), 9,2% (81/882) и 15,2% (134/839), соответственно. Анализ ассоциаций между MSI, мутации гена ATM, и потери белка ATM выявили высоко сосуществующих ATM
генных изменений и MSI. ATM
были обнаружены мутации интрон и потеря белка ATM в 69,3% (52/75) и 53,3% (40/75) от MSI положительной GC. MSI положительность и потеря белка ATM присутствовали в 68,4% (52/76) и 48,7% (37/76) ГХ с мутацией интрона ATM. Банкомат
мутации и белка ATM потери имели характеристики старости, дистального расположения опухоли, большого размера опухоли и гистологического кишечного типа. Наше исследование может быть истолковано как ATM
мутации гена в интрона может быть мишенью MSI и привести к потере белка АТМ в выбранной группе GC.
<р> Образец цитирования: Ким HS, Choi SI, Мин HL, Ким М.А., Ким WH (2013) Мутация в интронных повторами Атаксия-Телеангиоэктазии Мутировавшая (ATM) генов и белков Потеря ATM в первичной рака желудка с микросателлитных Нестабильность , PLoS ONE 8 (12): e82769. DOI: 10.1371 /journal.pone.0082769
<р> Редактор: Hoguen Ким, Йонсей колледж медицины, Республика Корея
<р> Поступило: 21 июля 2013; Принято: 27 октября, 2013 года; Опубликовано: 6 декабря 2013
<р> Copyright: © 2013 Ким и др. Это статья с открытым доступом распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются

Финансирование:. Это исследование была поддержана базовой программой исследования науки через Национальный исследовательский фонд Кореи (NRF), финансируемой Министерством науки, ICT &Amp; Будущее планирование (СРН-2012R1A1A2004648). Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов

Введение
<р> атаксия-телеангиэктазия мутировал (ATM) ген является компонентом ответа на повреждения ДНК (РДР) и активируется двунитевых разрывов ДНК (DSBs), и сигналы контрольной точки клеточного цикла, чтобы замедлить прохождение клеток через цикл, чтобы облегчить восстановление ДНК. Ген локализован на хромосоме 11q22-23. ATM
ген очень велик, охватывая геномную область 150 кб, состоящий из 66 экзонов с кодирующей последовательностью из 91668 пар оснований.
<р> ATM участвует в ответах на DSBs, которые происходят физиологически в специализированных типах клеток, таких как зародышевых клеток и лимфоцитов. Белок ATM помогает клеткам в распознавании испорченном или поврежденном нити ДНК. Белок ATM координирует восстановление ДНК путем активации ферментов, которые фиксируют разорванные нити. Эффективный ремонт поврежденных нитей ДНК помогает поддерживать стабильность генетической информации клетки [1].
потеря <р> ATM наблюдалось у 16% ткани GC человека в большом когортном исследовании [2]. Инактивация <ЕМ> Банкомат
ген может быть частым явлением в развитии рака желудка человека (GC); Тем не менее, события, связанные с потерей ATM
выражение в GC не может быть объяснено низкой распространенностью ATM
мутации. Большая часть <ЕМ> Банкомат
мутаций, определенных в первичных клеточных линий ГХ и ГХ тканей были точечные мутации [3].
<р> Несовпадение ДНК ремонт (MMR) система исправляет ошибки, которые могут возникнуть во время репликации ДНК, тогда как гомологичная рекомбинация и негомологичный конец присоединения участвуют в ремонте ДНК DSB. Мутации в генах репарации ДНК DSB, таких как ATM, MRE11, Rad50, NBS1
и ATR
, постулируется играть определенную роль в развитии злокачественных опухолей желудочно-кишечного тракта с нарушением функции MMR. В колоректального опухолей с нарушенной системой MMR, мутации интронных мононуклеотидных повторов в ATM
и MRE11
были найдены привести к аномальным сплайсинга, с последующим снижением экспрессии белка дикого типа [4 ].
<р> Приблизительно 10% GC связан с нестабильностью микросателлитных (MSI). MSI относится к изменениям в количестве нуклеотидных повторов в микросателлитных областей, расположенных в пределах кодирующих областей генов и приводит к мутации со сдвигом рамки. MSI была определена в кодирующей белок области известных генов-мишеней, в том числе TGF-βRII, IGFIIR, БАКСА
[5-7], и hRAD50
генов [8]. <ЕМ> hRAD50, BLM
, и BRACA1
гены имеют поли (А) мононуклеотид повторяющий в пределах кодирующих областей, <ЕМ> hMSH6
имеет (C) 8-кишечного тракта, NBS1
имеет (а) 7-кишечного тракта, и ATM
имеет (Т) 7-кишечного тракта. Мутации сдвига рамки этих генов с переменными числа случаев сообщалось ранее [9-11].
<р> В дополнение к множеству мутаций, накопленных в нейтральных микросателлитных последовательностей, а также от MSI создает мутации в генах рака, то есть в тех генах, которые играют активную роль в многоступенчатом процессе онкогенеза. Несмотря на то, повторяющиеся последовательности в кодирующей области генов, короче, чем типичный микросателлитных локусов, используемых для картирования генов, их склонность к спонтанно-ошибки смещения при репликации все еще выше, чем у бесповторных последовательностей. Мутации в интронной повторе было сообщено вызвать нарушение экспрессии MRE11
гена [12,13]. Полипиримидиновых повторные мутации в ATM
ген может нарушить правильную сплайсинг мРНК [14]. Тем не менее, нет никаких доказательств того, что вставка /удаление происходит в этих некодирующих последовательностей мононуклеотидных влияет на нормальную ATM функция белка в MSI, связанной с GC. В GC ткани человека с MSI, частота ATM
мутация и объединение с потерей функции белка не ясно понимал. Мы предположили, что изменения мононуклеотид путей у интрона ATM
ген связан с потерей функции белка АТМ в GC с MSI.
<р> Мы исследовали мутации в интронных (Т) 15 в пределах гена ATM
интрон (МСО), предшествующий экзоне 6, которые приводят к 22 п.н. делеции экзона 6 в желудочном линиях раковых клеток человека , В настоящем исследовании, мутации ATM
гена вместе с наличием MSI были рассмотрены в линии ГХ клеток человека и первичных тканей GC. Наши результаты показали, что ATM
ген интрон мутация часто в GC с MSI и был в значительной степени связано с потерей функции белка ATM.

Материалы и методы

Этика Заявление
<р> Это ретроспективное исследование проводилось с использованием образцов над полками после патологической диагностики, и все образцы были анонимными до исследования. Это ретроспективное исследование было одобрено Институциональным наблюдательным советом Сеульского национального Больнице Университета (H-1010-065-336) с отказом от информированного согласия при условии обезличивания.

Клеточные линии и образцы ткани
<р> Десять человек клетку рака желудка линии- СНУ-1, СНУ-5, СНУ-16, СНУ-216, СНУ-484, СНУ-601, SNU- 620, СНУ-638, СНУ-668 и СНУ-719 были получены от корейской клеточной линии Bank (Сеул, Корея). Все клеточные линии выращивали в RPMI 1640, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS; Hyclone, Лорган, UT, США) и антибиотиков (100 ед /мл пенициллина G и 100 мкг /мл стрептомицина) при 37 ° C в увлажненной 5% CO <югу> 2-инкубатор. Клетка-линейный массив ткани слайд из добываемых и фиксированных линий человеческого GC клеток был получен для иммуногистохимии (Superbiochips, Корея).
<Р> фиксированные формалином, парафином образцы ткани GC из 839 пациентов, перенесших целебное гастрэктомию для первичного лечения рака желудка в период с 1 ^{го января 2004 года и 31 го декабря 2005 года в Сеульском национальном университете больницы были собраны. Пациенты, включенные 577 мужчин и 262 женщин со средним возрастом 57,6 лет (диапазон: от 4 до 87 лет). Информация о местоположении опухоли была получена из 835 случаев: в верхней трети 109, средней трети в 323, нижняя треть в 383, а всего желудка в 20 случаях. На основе классификации Lauren, раки были классифицированы как гистологическое кишечного типа в 381, диффузный типа в 327, смешанного типа в 123 и неопределенными в 8 случаях. Из 839 случаев 165 были рано GC и 674 были выдвинуты GC. узел метастаз лимфа присутствовал в 531 случаях и отсутствует в 308 случаях. Двести сорок пять пациентов были диагностированы как стадия I, 254, как 291 стадии II, как стадия III, и 85 в стадии IV. Адъювантной химиотерапии после операции проводили на 533 больных, которая включает в себя 32 больных в стадии I, 153 в стадии II, 260 в стадии III и 82 в стадии IV. Средний период наблюдения был 49,3 месяцев (диапазон: 0-85 месяцев). Местные рецидивы было отмечено в 185 (21,0%), отдаленные метастазы в 85 (9,6%), и смерть от любой причины в 289 выхода из 882 пациентов (32,8%). Пациент данные по выживаемости, включая даты и причины смерти, были получены из корейского Центрального онкологического регистра, Министерства здравоохранения и социального обеспечения, Кореи. Стандартный гистопатологические обследование включало оценку типа рака и патологической стадии опухоли, в соответствии с критериями, установленными 7-м издании AJCC STAGING Manual [15].}

экстракции ДНК и определение MSI

опухолевой ткани образцы на предметные стекла исследовали под световым микроскопом. Области опухоли, в которых процент опухолевых клеток превысило как минимум 50% от всех клеток в этой области и парный область нормальной ткани слизистой оболочки, не содержащих опухолевые клетки были отмечены и соскабливают с лезвием ножа. Соскабливают ткани собирали в 1,5 мл микропробирки, содержащие 50 мкл тканевой буфера для лизиса (0,5% Tween 20 [Sigma, Сент-Луис, Миссури], 100 мМ трис-буфера HCl [pH 7,6], 1 мМ ЭДТА, и 20 мкг протеиназы К [ ,,,0],Сигма]). Пробирки инкубировали в течение 24 до 48 часов при температуре 55 ° С, пока ткань, содержащей буфер для лизиса не стало ясно. Протеиназы К инактивировали путем инкубирования при 95 ° С в течение 10 минут, и извлеченную ДНК хранили при -20 ° С до использования. MSI оценивали по локусам BAT25, BAT26, D2S123, D5S346 и D17S250. Опухоли были классифицированы как MSI +, когда по крайней мере, 2 (40%) из маркеров 5 микросателлитных были связаны с аллелями измененном размером в опухолевой ДНК по сравнению с ДНК из неопухолевой ткани.

Обнаружение мутаций ATM
на интрона мононуклеотид повторяющей
<р> ПЦР-амплификации проводили в 10 мкл объема, содержащего 1 мкл геномной ДНК, 5 пмоль каждого из прямого и обратного праймеров, и 5 мкл премикса. Тридцать три циклов ПЦР проводили с параметром цикла 95 ° C в течение 30 сек, 30 сек при температуре отжига подходит для каждой пары праймеров и 65 ° С в течение 1 мин, а затем 10 расширения мин при 72 ° C.
<р> Изменение мононуклеотида повтора в ATM
ген был обнаружен с помощью анализа на основе ПЦР. Геномную ДНК амплифицировали с primers- F-CCTTTTTCTGTATGGGATTATGG, R-TGAACATCTTGTGAAGGTTTCAG для exon6 (T) 15 (155 пар оснований), F-TCCTTTTAGTTTGTTAATGTGATGGA, R-GCTGTTGGGGTAGAAGCTGA для exon10 (T) 15 (165 пар оснований), и F-GCCAATGGAAGATGTTCTTGA, R- CATCTTGGTCACGACGATACA для exon20 (T) 15 (178 б.п.).

Обнаружение аномальным сплайсинга ATM

<р> Общую РНК (2,5 мкг) из желудка линий раковых клеток человека, подготовленных реагентом TRIzol (Gibco-BRL) использовали для синтеза первой цепи кДНК синтеза с индек- II обратной транскриптазы (Gibco-BRL) и олиго-D (Т) <суб> 12-18 праймера. Аликвоту реакционной смеси, амплифицировали с помощью ПЦР, чтобы синтезировать различные сегменты ATM кДНК
. <Р> ПЦР-амплификацию проводили в объеме 20 мкл, содержащем 1 мкл обратной транскрипции кДНК, 5 пмоль каждого из прямого и обратного праймеров, и 10 мкл премикс. Тридцать пять циклов ПЦР проводили с параметром цикла 95 ° C в течение 30 сек, 30 сек при температуре отжига для каждой соответствующей пары праймеров и 72 ° С в течение 1 мин, а затем 10 мин при расширении 72 ° C. Полученные ПЦР-продукты подвергали электрофорезу в 2% агарозном геле, содержащем бромид этидия и визуализировали в УФ-свете. β-актин был использован в качестве внутреннего стандарта.
<р> Три пары праймеров для ОТ-ПЦР, полученные из ATM
последовательности (GenBank NM_000051) Используемые F-TGGTGCTATTTACGGAGCTG и R-TTCGAAAGTTGACAGCCAAA для обнаружения транскриптов экзона 5-7 (размер продукта: 347 пар оснований), F-TCCCTTGCAAAAGGAAGAAA и R-TACTGGTGGTCAGTGCCAAA для экзона (размер продукта: 504 пар оснований) 9-11, и F-TGGAGAAGAGTACCCCTTGC и R-GATTGACTCTGCAGCCAACA для экзона 19-22 (размер продукта: 415 п.н. ).

анализ Секвенирование
<р> Секвенирование проводили с помощью метода дидезокси-цепи терминации с использованием набора для секвенирования ДНК (Applied Biosystems) и генетического анализатора ABI PRISM 310. Усиленные продукты ПЦР очищали ферментативно с использованием набора presequencing (Amersham Life Science, Кливленд, Огайо, США), в соответствии с инструкциями изготовителя, а затем непосредственно секвенировали с использованием метода терминации BigDye (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Последовательные реакции проводились на ABI 3100 автоматизированных секвенсор (Applied Biosystems, Biosystems, Foster City, CA, USA) и данные, полученные были проанализированы с помощью анализа ДНК секвенирования 3.7 программного обеспечения (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Новые данные были депонированы в GenBank (инвентарный номер: KF704396)

Immunohistochemistry
<р> Типичные участки опухоли блоков и секций массив ячеек линии толщиной 4 мкм были депарафинировали и регидратации в сортовой. алкоголь. Антиген поиска было достигнуто за счет давления -cooking образцов в 0,01 моль /л буфер цитрат в течение 5 мин. Кролика моноклональные антитела (клон Y170, полученный из Epitomics, Burlingame, CA, USA) использовали для иммуногистохимического анализа. Банкомат окрашивали в ядре нормальной слизистой оболочки желудка, стромальные клетки и лимфоциты. Интенсивность классифицировалось как 0 (полностью отрицательный), ± (сомнительными окрашивание, сигнал наблюдается только при высокой мощности микроскопии с × 40 окуляра), + /3 (слабый положительный), ++ /3 (умеренно позитивный) и +++ /3 (сильно положительным, почти равно лимфоцитов и нейтрофилов). Критерии для отрицательных случаев были установлены менее чем 10% клеток, окрашенных в слабый положительный (+ /3) или более высокой интенсивности, то есть более чем на 90% клеток с полностью отрицательный (0) или двусмысленную окрашивание (±) [2 ].

Статистический анализ
<р> пакет SPSS 15.0 был использован для статистического анализа. использовались критерий хи-квадрат и Кокс модели пропорциональных рисков. Все P-значения являются две односторонние и Р значения &л;. 0,05 рассматривались как значимые для статистических методов в данном исследовании

Результаты

Мутация в интронных мононуклеотидных повторов гена АТМ в желудка человека клеточные линии рака
<р> Среди 10 желудочных линий раковых клеток человека, СНУ-1 и СНУ-638 были охарактеризованы как MSI положительным, ATM
генные мутации положительной и ATM потерей IHC. В СНУ-1 и SNU-638, 22 пар оснований удаление экзоне 6 была обнаружена RT-PCR, и это было подтверждено в последующем анализе последовательности (рисунок 1). СНУ-5, СНУ-16, СНУ-484, СНУ-601, СНУ-620, СНУ-668, и СНУ-719 были отрицательными MSI и имели дикого типа ATM
ген. Несмотря на то, СНУ-216 был MSI отрицательный, он таил мутации в ATM
гена, и имел сильную экспрессию ATM, обнаруженную IHC (таблица 1).

MSI

ATM
ген мутации интронной мононуклеотида повторяет
ATM
секвенирование

Банкомат
RT-PCR

ATM IHC

Bat 26
Bat 25
МСО 6
IVS 10
IVS 20
Экзон 6
Экзон 10
Экзон 20
Экзон 6
Экзон 10
Экзон 20

СНУ-1 +++++ 22 п.н. delnono22 п.н. delnonoNegativeSNU-5 ----- nonononononoPositiveSNU-16 ----- ndndndnononoPositiveSNU-216 - +++ nononono nonoPositiveSNU-484-----ndndndnononoPositiveSNU-601-----ndndndnononoPositiveSNU-620-----ndndndnononoPositiveSNU-638+++++22-bp delnono22 п.н. дель nonoNegativeSNU-668 ----- ndndndnononoPositiveSNU-719 ----- ndndndnononoPositiveTable 1. Микроспутниковая состояние нестабильности и ATM
генные профили желудочных линий раковых клеток человека.
МСО, интрон; IHC, иммуногистохимии. CSV Загрузить CSV

мутацию в интрон мононуклеотидных повторами ATM
генов и микросателлитных нестабильности в желудочном ткани рака
<р> Частота интронной мутации в ATM
ген был определен в 12,9% (78/604). Частота ATM
мутации гена составила 9,3% (50/540) в интроне предыдущем МСО 6; 11,0% (59/534) в интроне предыдущем СПВ 10 и 8,8% (46/523) в интроне предыдущем IVS 20; среди них, МСО 6 и МСО 10 перекрывается в 39, 10 и IVS IVS 20 в 35, 10 и IVS IVS 20 в 34, МСО 6, МСО 10 и МСО 20 в 31 случаях (таблица 2). Частоты MSI позитивности составила 9,2% (81/882) и потеря белка ATM составила 15,2% (134/839) в нашем исследовании GC. В 596 случаях были проанализированы ассоциации между MSI (Рисунок 2A), мутации гена ATM (рис 2В), и потери белка ATM (рисунок 3). ATM
были обнаружены мутации интрон и потеря белка ATM в 69,3% (52/75) и 53,3% (40/75) от MSI положительной GC. MSI положительность и потеря белка ATM присутствовали в 68,4% (52/76) и 48,7% (37/76) ГХ с мутацией интрона ATM. MSI положительность и мутация интрона АТМ были обнаружены в 35,7% (40/112) и 33,0% (37/112) ГХ с потерей белка ATM (таблица 3). Частота результатов ATM IHC показали значительно более высокие потери банкоматов в подгруппе MSI положительной и ATM
мутации положительный GC (Рисунок 4A). Тридцать три из 596 случаев (5,5%) имеют все три молекулярные характеристики (рис. 4В)
Расположение
Повторы (дикий тип)
мутации Интрон в GC
Интрон мутация в MSI положительной GC
Интрон мутация в ATM IHC отрицательной GC
ATM
МСО 6 (T) <суб> 1550/540 (9,3%) 42/50 (84,0%) 29/111 (26,1%) ATM
IVS 10 (Т) <югу> 1559/534 (11,0%) 47/59 (78,7%) 29/111 (26,1%) ATM
IVS 20 (Т) <суб> 1546 /523 (8,8%) 34/46 (73,9%) 22/107 (20,6%) ATM
МСО 6 или МСО 10 или МСО 20 (Т) <югу> 1578/604 (12,9%) 53/76 (69,7%) 37/112 (33,0%) Таблица 2. Incidencies о ATM
ген интрон мутации в рака желудка (GC)
МСО, вмешиваясь последовательность. MSI, микросателлитная нестабильность; IHC, иммуногистохимии. CSV Загрузить CSV


ATM IHC

MSI
ATM
мутация
N
Отрицательный
Положительный
NegativeNegative49768 (13,7 %) 429 (86,3%) Positive244 (16,7%) 20 (83,3%) Subtotal52172 (13,8%) 449 (86,2%) PositiveNegative237 (30,4%) 16 (69,6%) Positive5233 (63,5%) 19 (36,5%) Subtotal7540 (53,3 %) 35 (46,7%) Negative52075 (14,4%) 445 (85,6%) Positive7637 (48,7%) 39 (51,3%) Total596112 (18,8%) 484 (81,2%) Таблица 3. Частота экспрессии белка АТМ в подгруппы в соответствии с микроспутника нестабильность (MSI) статус и ATM
интрон мутации.
CSV Загрузить CSV

клиникопатологическими корреляции ATM
мутации гена в GC

GC больных с Банкомат
мутации гена были связаны с возрастом, большой размер опухоли, дистальной местоположение, кишечного типа, более глубокого вторжения, и более низкой частоте рецидивов. GC пациентов с отрицательным ATM IHC были связаны с возрастом, большой размер опухоли, а умеренно дифференцированной типа и кишечного типа классификации Lauren (таблица S1). Хи-квадрат тест проводили ATM
статус мутации гена в ATM IHC отрицательных и положительных групп с клиникопатологическими переменными. В отрицательной группе ATM IHC, ATM
мутации положительный GC были связаны с возрастом (р = 0,032) и дистальной месте (P = 0,045). В положительной группе ATM IHC, ATM
мутации гена был связан с хорошо или умеренно дифференцированной типа GC (P = 0,022) (таблица S1).

Выживание анализ
<р> модели пропорциональных рисков Кокса была использована в обоих одномерных и многомерных тестов. Одномерный регрессионный анализ Кокса для общей выживаемости и выживаемости без признаков заболевания показало значительную прогностическую ценность некоторых установленных прогностических факторов, таких как метастазов в лимфатических узлах, глубина опухоли и классификации Лорен гистологического типа. Группа пациентов, которые получили адъювантной chemotherpy имели значительно высокий относительный риск в целом (ОС) и болезни свободной выживаемости (БРВ) (P < 0,001, относительный риск = 3,82 [95,0% CI, 2.81-5.18] для OS и P < 0,001, относительный риск = 5,63 [95.0% ДИ 3.69-8.58] для DFS). Тем не менее, не было обнаружено каких-либо существенных тенденций относительного риска (ОР) для ATM
интрон мутации, потери MSI или ATM IHC. Многофакторный анализ с использованием переменных глубины опухоли, состояние лимфатических узлов, классификация Лорен гистологического типа, адъювантной химиотерапии, ATM
была выполнена интрон мутация, и экспрессия белка ATM. интрон мутации ATM имеет более низкий относительный риск с пограничное значение для общей выживаемости (р = 0,05, относительный риск = 0,60, [95.0% ДИ 0.36-1.00]) (Таблица 4).

Общая выживаемость



безрецидивной выживаемости:

Относительный риск
95,0% CI
значение P
N

Относительный риск
95,0% ДИ
P значение
N
Расширенный Желудочный Cancer8.263.00-22.750.005965.051.81-14.130.00544Lymph тип узла positive6.663.47-12.770.005963.201.58-6.480.00544Diffuse histology1.431.06 -1.940.025961.611.09-2.360.02544Adjuvant chemotherapy0.990.57-1.730.985962.171.00-4.720.05544 ATM
интрон mutation0.600.36-1.000.055960.560.29-1.080.08544ATM белок loss1.190.82-1.730 .355961.100.67-1.810.70544Table 4. Многофакторный регрессионный анализ Кокса.
CSV Загрузить CSV

Обсуждение

Наши результаты показали, что мутации интрона повторения в ATM
гена приводят к аномальным сплайсинга, что приводит к удалению 22 п.н. и ATM потери экспрессии белка в GC клеточных линиях. Эти результаты согласуются с данными предыдущего доклада [13] относительно идентификации сплайсинга дефекта в MRE11
предшественника транскрипт связаны с мутациями с помощью поли (Т) 11 повтор в интрон 4 (МСО-4), исключительно в MMR-дефицитных раковых клеточных линий и первичных опухолей. Наши результаты показали, что ATM потеря белка в GC значительно коррелирует с наличием мутации гена интронной в ATM
.
<р> У больных атаксия-телеангиэктазия, 70% -90% от ATM
мутации нонсенс, сдвиг кадра, или сплайсинга мутации, которые усечь белок [16]. Согласно КОСМИЧЕСКИХ баз данных (http://www.sanger.ac.uk/cosmic), мутации в кодирующих области ATM
гена были обнаружены в 5% (433 из 9249) различных видов рака. Среди них рак желудка показал мутацию только в 1,35% (1 из 74). Несмотря на то, ATM
мутации гена в GC сообщалось ранее [3,9], исчерпывающие пояснения было ограничено низкой частотой мутаций и относительно высокой заболеваемости функциональной потери ATM [2]. В нашем исследовании, около 70% от MSI положительного ГХ показал значительное ATM
гена интронных мутации, связанной с потерей белка ATM. Наши результаты решительно поддерживают эту интронных мутации ATM с услугой базовой MSI является одним из основных механизмов потерь ATM в человеческом GC. ATM потеря объясняется аномальным сплайсинга, связанного с интронной укорочения в MSI положительных линий двоеточиями раковых клеток. Эджима и др. поиск <ЕМ> Банкомат
генные мутации с использованием 62 пар олигонуклеотидных праймеров, соответствующих области, начиная от экзона 4 через экзоне 65 ATM
и фланкирующих его интронов. Укорачивание мононуклеотидных участков Банкомат
интронов приходится 34 (87%) из 39 интронных изменений. Тридцать один из них были найдены в 5 линий двоеточием опухолевых клеток, имеющих от MSI (LS180, HCT15, НСТ116, SW48 и Лово). Они также показали низкую экспрессию белка АТМ в MSI положительных колоректального линий раковых клеток [14]. Выражение ATM значительно снижается во многих карцином молочной железы, и не нашел ATM
мутации в этой клеточной линии [17]. Это указывает на то различные функции Банкомат
генные изменения между желудочно-кишечного тракта и молочной железы.
<Р> В дополнение к мутации, гены-супрессоры опухолей может быть инактивирован путем метилирования остатков цитозина внутри CpG островков, которые расположены в промотор многих генов. Банкомат
ген является мишенью новым для эпигенетическому глушителей через несоответствующего метилирование его проксимальной области промотора коррелирует с повышенной радиочувствительности и низким уровнем экспрессии белка в организме человека колоректального линии опухолевых клеток [18] и линии человеческого глиома клеток [18]. без каких-либо Банкомат
генных мутаций.
<р> MSI адресности ATM
гена представляют собой связь между MSI и репарации ДНК в GC. Некоторые исследования показывают, что функциональная потеря ATM увеличивается в MSI и человек ATM
ген является главной мишенью для инактивации в клеточных линиях MSI положительным GC и тканей [19,20]. Причиной поразительно высокой частотой ATM
гена интрон мутации в MSI положительной GC может быть связано с мононуклеотидных повторами (Т) 15 и длиной 13 нуклеотидов или более были особенно восприимчивы к этому целевой укорочения [14 ]. Частота <ЕМ> сообщалось ATM
ген мутация со сдвигом рамки (Т) 7 в экзоне 6 кодирующей последовательности в MSI положительной GC быть только 6% (2/36) [8], что значительно ниже, чем наше наблюдение.
<р> Сообщается, что дефицит ATM сенсибилизирует клетки к росту ингибирующих эффектов ингибитора PARP, olaparib, в раковых клетках желудка с пониженной ATM
выражения [21]. Поли (АДФ-рибоза) ингибиторы полимеразы в настоящее время в клинических испытаниях против различных видов рака, в том числе в карциномы толстой кишки [22]. В GC, дефицит АТМ, как известно, является предиктором ответа на ингибитор PARP [23-25]. Маркер гомологичной рекомбинации, Rad 51, как известно, является прогностическим маркером неоадъювантной anthracylcine химиотерапии на основе препаратов при раке молочной железы [26], а также ингибитора PARP в GC [24].
<Р> Наши результаты показали, что ATM потеря белка не является агрессивным фактором GC, хотя он в значительной степени связано с неблагоприятной тенденцией HR в MSI отрицательной GC. Это сопоставимо с результатами других исследований, которые сообщают о потере белка АТМ в качестве неблагоприятного прогностического фактора [20]. В наших исследованиях, Банкомат
мутации и ATM отрицательный GC имели различные характеристики клинико; Тем не менее, эта группа не показала никакой разницы выживание с другими. В MSI отрицательной группы, HR ГК с потерей белка ATM была значительно выше, однако в MSI положительной группе, HR в GC с потерей белка ATM не было статистически значимым. Это указывает на то, что MSI является потенциальным молекулярным фактором, влияющим на биологическое поведение GC. Таким образом, наше исследование подтверждает, что статус MSI может влиять на чувствительность к ингибитором PARP, воздействуя на состояние экспрессии белка ответ на повреждения ДНК через мононуклеотида повторяет изменения.

Таким образом, ATM
мутации гена в GC составляет 12,9%, и 33,0% ГХ с ATM
мутации гена связана с потерей белка ATM. MSI показала положительный GC ATM
мутацию в 69,7%. Наши результаты свидетельствуют о том, что результат потери ATM и чувствительность к химиотерапевтическим соединением, olaparib, можно лучше понять, если случаи расслаивается на основе ATM
статус мутации гена или MSI.

Выводы
<р> Наше исследование показало, ATM
ген интрон мутация присутствует в 69% от MSI положительного GC и 49% ATM
интрон мутация ассоциируется с потерей белка ATM. Они предполагают, что ATM
ген интрон мутации мишенью микросателлитных нестабильности связан с потерей белка ATM в подгруппе рака желудка человека.

Поддержка Информация
таблице S1.
клиникопатологическими корреляции карциномы желудка с мутацией гена ATM и экспрессии белка ATM.
DOI: 10.1371 /journal.pone.0082769.s001
(DOCX)

• PLoS ONE: Заболеваемость, прогностические факторы и клинические исходы острого повреждения почек после желудочн…
• PLoS ONE: Преобразование Microarray Подпись в диагностический тест: судебный процесс над 74 пользовательских Гена масс…