Abstrakt
Ataxie-Teleangiektasie mutiert (ATM) ist eine Ser /Thr Proteinkinase, die eine kritische Rolle bei der DNA-Schädigung induzierte Signalgebung und Initiierung der Zellzyklus-Checkpoint-Signalisierung in Reaktion auf DNA-schädigende Mittel, wie ionisierende Strahlung spielt. Wir haben bereits berichtet, die ATM-Proteinverlust durch Immunhistochemie (IHC) in 16% der menschlichen Magenkrebs (GC) Gewebe. Wir vermuten, dass ATM Citation: Kim HS, Choi SI, Min HL, Kim MA, Kim WH (2013) Mutation bei Intronic Repeats der Ataxia-Telangiectasia Mutierte (ATM) Gene und ATM-Protein-Verlust in Primärmagenkrebs mit Mikrosatelliten-Instabilität . PLoS ONE 8 (12): e82769. doi: 10.1371 /journal.pone.0082769 Editor: Hoguen Kim, Yonsei University College of Medicine, der Republik Korea Empfangen: 21. Juli 2013; Akzeptiert: 27. Oktober 2013 beginnen; Veröffentlicht: 6. Dezember 2013 Copyright: © 2013 Kim et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden Finanzierung:. Diese Forschung wurde durch das Ministerium für Wissenschaft, ICT &finanziert von Basic Science Research Program durch die National Research Foundation of Korea (NRF) unterstützt; Zukunftsplanung (NRF-2012R1A1A2004648). Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen Einführung Ataxia-telangiectasia mutiert (ATM) -Gen ist ein Bestandteil der DNA-Schadensantwort (DDR) und wird von DNA-Doppelstrangbrüche (DSBs) aktiviert und signalisiert den Zellzyklus-Kontrollpunkt den Durchgang von Zellen zu verlangsamen durch den Zyklus der DNA-Reparatur zu erleichtern. Das Gen ist lokalisiert auf dem Chromosom 11q22-23. Die ATM ATM wird in Reaktion auf DSBs verwickelt, die physiologisch in spezialisierten Zelltypen wie Keimzellen und Lymphozyten auftreten. Das ATM-Protein hilft Zellen in beschädigten oder gebrochenen DNA-Stränge zu erkennen. Die ATM-Protein-Koordinaten der DNA-Reparatur durch Enzyme aktiviert, die die gebrochenen Stränge zu beheben. Effiziente Reparatur beschädigter DNA-Stränge hilft, die Stabilität der genetischen Information der Zelle aufrechterhalten [1]. ATM Verlust wurde in 16% der menschlichen GC Gewebe in einer großen Kohortenstudie [2] beobachtet. Die Inaktivierung des ATM Die DNA-Mismatch-Reparatur (MMR) System korrigiert die Fehler, die während der DNA-Replikation, während die homologe Rekombination und nicht-homologe Endverbindung beteiligt sind, bei der Reparatur von DNA-DSB auftreten könnten. Mutationen in der DNA-DSB-Reparatur-Gene wie ATM, MRE11, RAD50, NBS1 Etwa 10% der GC ist mit Mikrosatelliteninstabilität (MSI) zugeordnet ist. MSI bezieht sich in der Anzahl von Nucleotid-Repeats in Mikroregionen zu Veränderungen innerhalb der kodierenden Regionen der Gene und führt zu Rasterverschiebungsmutationen. MSI hat in dem Protein identifiziert worden Regionen von bekannten Zielgene codierende einschließlich TGF-βRII, IGFIIR, BAX Neben der Vielzahl von in neutralen Mikro Sequenzen akkumulierte Mutationen, die MSI erzeugt auch Mutationen in Krebsgenen, das heißt in den Genen, die eine aktive Rolle in der mehrstufiger Prozess der Karzinogenese spielen. Obwohl wiederholten Sequenzen in der kodierenden Region von Genen, die kürzer als die typische Mikrosatelliten-Loci für die Gen-Kartierung verwendet sind, ist ihre Neigung zu unterziehen spontanen Schlupf Fehler während der Replikation ist immer noch höher als die der nichtrepetitiven Sequenzen. Mutationen einer Intron-Wiederholung wurde berichtet, dass induzieren beeinträchtigte Expression von MRE11 Wir untersuchten Mutationen im Intron (T) 15 innerhalb der ATM Materialien und Methoden Ethik Statement Diese retrospektive Studie wurde durchgeführt, um die Proben in den Regalen nach der pathologischen Diagnose verwenden, und alle Proben wurden vor der Studie anonymisiert. Diese retrospektive Studie wurde von der Institutional Review Board von Seoul National University Hospital (H-1010-065-336) mit Verzicht auf informierte Zustimmung unter der Bedingung des Anonymisierungs genehmigt. Die Zelllinien und Gewebeproben Zehn menschliche Zelle Magenkrebs Lines- SNU-1, SNU-5, SNU-16, SNU-216, SNU-484, SNU-601, SNU- 620, SNU-638, SNU-668 und SNU-719 wurden von der koreanischen Zelllinie Bank (Seoul, Korea) erhalten. (; Hyclone, Lorgan, UT, USA FBS) und Antibiotika (100 U /ml Penicillin G und 100 ug /ml Streptomycin) bei 37 ° C in einer befeuchteten 5% Alle Zelllinien wurden in RPMI 1640 mit 10% fötalem Rinderserum gezüchtet CO 2 Inkubator. Eine Zelllinie Dia Gewebearray aus geerntet und menschlichen GC-Zelllinien festgelegt wurde für die Immunhistochemie erhalten (Superbiochips, Korea). Formalin-fixierte, in Paraffin eingebettete Gewebeproben GC von 839 Patienten, die für eine kurative gastrectomy unterzog primären Magenkrebs Behandlung zwischen 1 st Januar 2004 und dem 31. st Dezember 2005 an der Seoul National University Hospital wurden gesammelt. Die eingeschlossenen Patienten 577 Männer und 262 Frauen mit einem mittleren Alter von 57,6 Jahren (Bereich: 4 bis 87 Jahre). in 109, mittleren Drittel in 323, untere Drittel in 383, und der gesamte Magen in 20 Fällen oberen Drittel: Informationen auf Tumorlokalisation wurde von 835 Fällen erhalten. histologisch klassifiziert als intestinalen Typ Basierend auf der Lauren Klassifikation waren die Krebse in 381, diffuse Art in 327, Mischtyp in 123 und unbestimmt in 8 Fällen. Von den 839 Fällen waren 165 früh GC und 674 wurden GC fortgeschritten. Lymphknotenmetastasen war in 531 Fällen und abwesend in 308 Fällen. Zweihundert und fünfundvierzig Patienten wurden als Stufe I, 254 als Stufe II, 291 als Stadium III und 85 als Stadium IV diagnostiziert. Die adjuvante Chemotherapie nach der Operation wurde auf 533 Patienten durchgeführt, die 32 Patienten in Stufe I umfasst, 153 in Stufe II, 260 in Stufe III und 82 in der Stufe IV. Die mittlere Nachbeobachtungszeit betrug 49,3 Monate (Bereich: 0-85 Monate). Lokalrezidiv wurde in 185 (21,0%), Fernmetastasen in 85 (9,6%), und der Tod durch jede Ursache in 289 von 882 Patienten (32,8%) festgestellt. Patienten-Überlebensdaten, einschließlich Daten und Todesursachen wurden von der Korean Central Cancer Registry, Ministerium für Gesundheit und Soziales, Korea erhalten. Standard histopathologischen Untersuchung eingeschlossen Beurteilung der Krebsart und pathologischen Tumorstadium, die nach den Kriterien der 7. Auflage des AJCC etabliert Staging Manual [15]. Tumorgewebe Proben auf Glasobjektträger wurden unter einem Lichtmikroskop untersucht. Ein Bereich des Tumors, in der der Anteil der Tumorzellen mit mindestens 50% aller Zellen in diesen Bereich überschritten hat und ein gekoppeltes Bereich der normalen Schleimhautgewebe keine Tumorzellen enthielten, wurden markiert und abgeschabt mit einer Messerklinge. Die abgeschabt Gewebe wurde in 1,5 ml Mikroröhrchen, das 50 &mgr; l Gewebe Lysepuffer (0,5% Tween 20 gesammelt [Sigma, St Louis, MO], 100 mM Tris-HCl-Puffer [pH 7,6], 1 mM EDTA und 20 &mgr; g Proteinase K [ ,,,0],Sigma]). Die Röhrchen wurden bei 55 ° C für 24 bis 48 Stunden inkubiert, bis das Gewebe enthaltenden Lysepuffer klar wurde. Proteinase K wurde für 10 Minuten durch Inkubation bei 95 ° C inaktiviert und die extrahierte DNA wurde bei -20 ° C bis zur Verwendung gelagert. MSI wurde an den Loci BAT25, BAT26, D2S123, D5S346 und D17S250 bewertet. Tumore wurden als MSI + klassifiziert, wenn mindestens 2 (40%) der 5 Mikrosatelliten-Marker mit Allele veränderter Größe in Tumor-DNA, verglichen mit DNA aus Nicht-Tumorgewebe verbunden waren. Der Nachweis von Mutationen von ATM bei Intron Die PCR-Amplifikation wurde in 10 &mgr; l Volumen, das 1 &mgr; l genomische DNA, 5 pmol jeweils von Vorwärts- und Rückwärts-Primern durchgeführt, und 5 &mgr; l Premix. Dreiunddreißig PCR-Zyklen wurden für 30 sec mit Zyklusparameter von 95 ° C, 30 sec bei einer Glühtemperatur geeignet für jedes Primerpaar und 65 ° C für 1 min, gefolgt von 10 min Verlängerung bei 72 ° C. Variation von Mononukleotid Repeats in der ATM Erkennung von anomalen Spleißen in ATM Die Gesamt-RNA (2,5 ug) von menschlichen Magenkrebszelllinien hergestellt, indem man Trizol-Reagens (GIBCO-BRL) wurde für die Erststrang-cDNA-Synthese mit Superscript II Reverse Transcriptase (GIBCO-BRL) und Oligo-d (T) 12-18 Primer verwendet. Ein Aliquot des Reaktionsgemisches wurde mittels PCR verschiedene Segmente des ATM cDNA zu synthetisieren. PCR-Amplifikation in 20 &mgr; l Volumen durchgeführt, die 1 &mgr; l revers transkribiert cDNA, 5 pmol jeweils von Vorwärts- und Rückwärts-Primer und 10 &mgr; l Premix. Fünfunddreißig Zyklen der PCR wurden für 30 sec mit Zyklusparameter von 95 ° C, 30 sec bei einer Glühtemperatur geeignet für jedes Primerpaar und 72 ° C für 1 min, gefolgt von 10 min Verlängerung bei 72 ° C. PCR-Produkte wurden in 2% Agarose-Gel mit Ethidiumbromid sichtbar gemacht und unter UV-Licht elektrophoresiert. β-Actin wurde als interner Standard verwendet. Drei RT-PCR-Primerpaare, die aus ATM Sequenzanalyse Die Sequenzierung wurde durch das Didesoxy-Kettenabbruchverfahren unter Verwendung von DNA-Sequenzierungs-Kit (Applied Biosystems) und des ABI PRISM 310 Genetic Analyzer durchgeführt. Amplifizierte PCR-Produkte wurden gereinigt enzymatisch eine presequencing Kit (Amersham Life Science, Cleveland, OH, USA) nach den Anweisungen des Herstellers, und dann direkt sequenziert BigDye-Terminator-Methode (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) verwendet. Sequenzierungsreaktionen wurden auf einem ABI 3100 automatisierten Sequenzer laufen (Applied Biosystems, Biosystems, Foster City, CA, USA) und die erhaltenen Daten wurden unter Verwendung von DNA-Sequenzanalyse 3.7 Software analysiert (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Die neuen Daten in GenBank (Zugangsnummer: KF704396) hinterlegt worden Immunhistochemie Repräsentative Tumor-Blockabschnitte und Zell-Line-Array-Abschnitte von 4 um Dicke wurden entparaffiniert und rehydriert in benotet. Alkohol. Antigen Retrieval wurde durch Druck -cooking die Proben in 0,01 mol /L Citrat-Puffer für 5 min erreicht. Das Kaninchen monoklonale Antikörper (Klon Y170 erhalten von Epitomics, Burlingame, CA, USA) wurde für die Immunhistochemie eingesetzt. ATM wurde in den Zellkern der normalen Magenschleimhaut, Stromazellen und Lymphozyten gefärbt. Die Intensität wurde benotet als 0 (völlig negativ), ± (zweideutig Färbung beobachtete Signal nur bei High-Power-Mikroskopie mit × 40 Okular), + /3 (schwach positiv), ++ /3 (mäßig positiv) und +++ /3 (stark positiv, fast gleich Lymphozyten und Neutrophile). Die Kriterien für die negativen Fälle wurden als weniger als 10% der Zellen gefärbt als schwach positiv (+ /3) oder höhere Intensität eingestellt, das heißt, mehr als 90% der Zellen völlig negativ (0) oder mehrdeutig Färbung (±) zeigt [2 ]. Die statistische Analyse Die SPSS 15.0 Paket für statistische Auswertungen verwendet. Chi-Quadrat-Test und Modell wurden Proportional-Hazards Cox verwendet. Alle P-Werte sind doppelseitig und P-Werte. ≪ 0,05 als signifikant erachtet wurden für die statistische Methoden in dieser Studie Ergebnisse | Mutation in Intron-Mononukleotid-Repeats des ATM-Gens in menschlichen Magen Krebszelllinien Unter 10 menschlichen Magenkrebszelllinien, SNU-1 und SNU-638 wurden als MSI positiv, ATM Mutation im Intron Mononukleotid Wiederholungen des ATM Die Häufigkeit der Intron-Mutation in ATM herunterladen Clinicopathologic Korrelationen von ATM GC Patienten mit ATM assoziiert Die Cox-proportional-Hazards-Modell wurde in beiden univariate und multivariate Tests verwendet. Univariate Cox-Regressionsanalyse für das Gesamtüberleben und krankheitsfreie Überleben zeigten eine signifikante prognostischen Wert von einigen etablierten prognostischen Faktoren wie Lymphknotenmetastasen, die Tiefe des Tumors und Lauren-Klassifikation von histologischen Typ. Die Patientengruppe, die eine adjuvante chemotherpy erhielten, hatten eine signifikant hohe relative Risiko für die Gesamt (OS) und krankheitsfreie Überleben (DFS) (P < 0,001, relative Risiko = 3,82 [95,0% CI, 2,81-5,18] für OS und P < 0,001, relative Risiko = 5,63 [95,0% CI, 3,69-8,58] für DFS). Allerdings wurde für ATM Diskussion Unsere Ergebnisse zeigten, dass Mutationen eines Introns Wiederholung in der ATM In Ataxia-Telangiectasia Patienten, 70% -90% von ATM Zusätzlich zu Mutationen, Tumorsuppressorgene kann durch Methylierung von Cytosinresten in CpG islands inaktiviert werden, die in der Lage sind, Promotor vieler Gene. ATM Das MSI-Targeting der ATM Es wird berichtet, dass ATM-Mangel-Zellen auf die wachstumshemmende Wirkung von PARP-Inhibitor, olaparib, bei Magenkrebs-Zellen mit reduzierten ATM Unsere Ergebnisse zeigten, dass ATM Proteinverlust ist kein aggressiver Faktor von GC, obwohl sie deutlich mit ungünstigen Entwicklung von HR in MSI negativen GC verbunden ist. Dies ist vergleichbar mit anderen Studien, die ATM-Protein-Verlust als eine negative prognostischer Faktor berichten [20]. In unseren Studien, ATM Insgesamt ATM Schlussfolgerungen Unsere Studie hat gezeigt, ATM Hintergrundinformationen
Gen Introns Mutationen durch Mikrosatelliteninstabilität gezielte (MSI) verursachen ATM Proteinverlust in einer Untergruppe von GC. Wir untersuchten Mononukleotid Mutationen am Intron von ATM
Gen, ATM IHC und MSI in GC. Zehn menschlichen Magenkrebszelllinien wurden für die ATM
Genmutation bei Introns studierte, RT-PCR, direkte Sequenzierung und Immunhistochemie. GC Gewebe von 839 Patienten wurden für MSI und ATM IHC analysiert. Unter ihnen wurden 604 Fälle für die ATM
Mutationen an Introns vorhergehenden Exon 6, Exon 10 und Exon 20. Zwei menschliche GC-Zelllinien (SNU-1 und -638) zeigte ATM
analysiert Intron Mutationen, Deletion in RT-PCR und direkte Sequenzierung und ATM Proteinverlust durch IHC. Die Frequenzen von ATM
Mutation, MSI, und ATM-Protein-Verlust waren 12,9% (78/604), 9,2% (81/882) und 15,2% (134/839) sind. Analyse von Assoziationen zwischen MSI, ATM-Gen-Mutation und Verlust ATM Proteins zeigte sehr koexistierenden ATM
Genveränderungen und MSI. ATM
Intron Mutation und ATM-Proteinverlust in 69,3% festgestellt wurden (52/75) und 53,3% (40/75) von MSI positive GC. MSI Positivität und ATM-Protein-Verlust waren in 68,4% (52/76) und 48,7% (37/76) von GC mit ATM-Intron-Mutation vorliegt. ATM
Mutation und ATM-Protein-Verlust hatte Merkmale Alter, distale Lage des Tumors, große Tumorgröße und histologische Darm-Typ. Unsere Studie könnte als dass interpretiert werden ATM
Genmutation bei Intron könnte durch MSI gezielt und in einer ausgewählten Gruppe von GC zu ATM-Proteinverlust führen.
Gen ist sehr groß, um eine genomische Region von 150 kb überspannen, bestehend aus 66 Exons mit einer codierenden Sequenz von 91.668 bp.
Gen kann ein häufiges Ereignis in der Entwicklung der menschlichen Magenkrebs (GC) sein; jedoch im Zusammenhang mit den Ereignissen auf den Verlust von ATM
Expression in GC nicht durch die niedrige Prävalenz von ATM
Mutation erklärt werden. Die meisten der ATM
in primären GC-Zelllinien und GC Geweben identifiziert Mutationen waren Punktmutationen [3].
und ATR
, postuliert eine Rolle bei der Entwicklung von gastrointestinalen Tumoren mit einer beeinträchtigten MMR-Funktion zu spielen. In kolorektalen Tumoren mit einer beeinträchtigten MMR-System, Mutationen von Intron-Mononukleotid-Repeats in ATM
und MRE11
aberrante Spleißen zu führen, gefolgt von einer verminderten Expression des Wildtyp-Proteins gefunden wurden [4 ].
[5-7] und hRAD50
Gene [8]. Die hRAD50, BLM
und BRACA1
Gene haben Poly (A) Mononukleotid innerhalb der kodierenden Regionen wiederholt die hMSH6
hat (C) 8-Darm-Trakt, die NBS1
hat die (A) 7-Darm-Trakt und die ATM
die (T) 7-Darm-Trakt hat. Rasterschubmutagene Mutationen dieser Gene mit variablen Fälle wurden bisher [9-11] berichtet.
Gen [12,13]. Polypyrimidinsequenz wiederholen Mutationen im ATM
Gen kann die korrekte mRNA-Spleißen [14] stören. Es gibt jedoch keinen Beweis, dass Einfügen /Löschen bei diesen nicht-codierende Sequenzen Mononukleotid auftretenden affect normalen ATM-Proteinfunktion in MSI bezogenen GC. In menschlichen Gewebe GC mit MSI, die Häufigkeit von ATM
Mutation und die Verbindung mit dem Verlust der Proteinfunktion ist nicht klar verstanden. Wir haben gezeigt, dass Mononukleotid-Darm-Trakt Veränderungen in Intron Hypothese ATM
Gen mit dem Verlust von ATM-Protein-Funktion in GC mit MSI zugeordnet ist.
Gen intervenierende Sequenz (IVS) vor Exon 6, die 6 in menschlichen Zelllinien Magenkrebs bis 22 bp Deletion von Exon führen . In der vorliegenden Studie wurden Mutationen des ATM
Gen zusammen mit dem Vorhandensein von MSI wurden in der menschlichen GC Zelllinien und Primär GC Gewebe untersucht. Unsere Ergebnisse zeigten, dass ATM
Gen-Intron-Mutation in GC mit MSI häufig war und signifikant mit dem Verlust von ATM-Protein-Funktion verbunden war.
DNA-Extraktion und MSI Bestimmung
Mononukleotid wiederholt
Gen wurde unter Verwendung eines PCR-basierten Test nachgewiesen. Genomische DNA wurde mit primers- F-CCTTTTTCTGTATGGGATTATGG amplifiziert, R-TGAACATCTTGTGAAGGTTTCAG für exon6 (T) 15 (155 bp), F-TCCTTTTAGTTTGTTAATGTGATGGA, R-GCTGTTGGGGTAGAAGCTGA für exon10 (T) 15 (165 bp), und F-GCCAATGGAAGATGTTCTTGA, R- CATCTTGGTCACGACGATACA für exon20 (T) 15 (178 bp).
Sequenzen (GenBank NM_000051) wurden verwendet, um F-TGGTGCTATTTACGGAGCTG und R-TTCGAAAGTTGACAGCCAAA Transkripte von Exon nachzuweisen 5-7 (Produktgröße: 347 bp), F-TCCCTTGCAAAAGGAAGAAA und R-TACTGGTGGTCAGTGCCAAA für Exon 9-11 (Produktgröße: 504 bp), und F-TGGAGAAGAGTACCCCTTGC und R-GATTGACTCTGCAGCCAACA für Exon 19-22 (Produktgröße: 415 bp ).
Genmutationen positive und ATM-Verlust durch IHC gekennzeichnet. In SNU-1 und SNU-638, 22-Basenpaar-Deletion von Exon 6 wurde durch RT-PCR nachgewiesen, und es wurde in anschließenden Sequenzanalyse (Figur 1) bestätigt. SNU-5, SNU-16, SNU-484, SNU-601, SNU-620, SNU-668 und SNU-719 waren MSI negativ und hatte Wildtyp ATM
Gen. Obwohl SNU-216 MSI negativ war, beherbergte es Mutationen in der ATM
Gen, und hatte starke ATM-Expression durch IHC nachgewiesen werden (Tabelle 1).
MSI
ATM
Genmutation von Intron-Mononukleotid wiederholt
ATM
Sequenzierung
ATM
RT-PCR
ATM IHC
Bat 26
Bat 25
IVS 6
IVS 10
IVS 20
Exon 6
Exon 10
Exon 20
Exon 6
Exon 10
Exon 20
SNU-1 +++++ 22-bp delnono22-bp delnonoNegativeSNU-5 ----- nonononononoPositiveSNU-16 ----- ndndndnononoPositiveSNU-216 - +++ nononono nonoPositiveSNU-484-----ndndndnononoPositiveSNU-601-----ndndndnononoPositiveSNU-620-----ndndndnononoPositiveSNU-638+++++22-bp delnono22 bp del nonoNegativeSNU-668 ----- ndndndnononoPositiveSNU-719 ----- ndndndnononoPositiveTable 1. Mikrosatelliteninstabilität Status und ATM
Genprofile von menschlichen Magenkrebszelllinien.
IVS, Intron; IHC, Immunhistochemie. Download CSV CSV
Gen und Mikrosatelliteninstabilität in Gewebe Magenkrebs
Gen bestimmt wurde als 12,9% (78/604). Die Frequenz des ATM
Genmutation betrug 9,3% (50/540) in Intron vorhergehenden IVS 6; 11,0% (59/534) in Intron IVS vorangegangenen 10 und 8,8% (46/523) in Intron IVS vorangegangenen 20; Unter ihnen IVS 6 und IVS 10 überlappt in 39, 10 und 20 IVS IVS in 35, 10 und 20 IVS IVS in 34, IVS 6, IVS 10 und 20 IVS in 31 Fällen (Tabelle 2). Die Frequenzen von MSI Positivität betrug 9,2% (81/882) und ATM-Proteinverlust betrug 15,2% (134/839) in unserer Studie von GC. In 596 Fällen wurden die Assoziationen zwischen MSI (2A), ATM-Gen-Mutation (2B), und ATM-Proteinverlust (Abbildung 3) analysiert. ATM
Intron Mutation und ATM-Proteinverlust in 69,3% festgestellt wurden (52/75) und 53,3% (40/75) von MSI positive GC. MSI Positivität und ATM-Protein-Verlust waren in 68,4% (52/76) und 48,7% (37/76) von GC mit ATM-Intron-Mutation vorliegt. MSI Positivität und ATM-Intron-Mutation wurden in 35,7% (40/112) und 33,0% (37/112) der GC mit ATM-Proteinverlust (Tabelle 3) festgestellt. Die Häufigkeit der ATM IHC Ergebnisse zeigten eine signifikant höhere ATM Verlust in einer Subgruppe von MSI positiv und ATM
Mutation positive GC (4A). Dreißig drei von 596 Fällen (5,5%) haben die alle drei molekularen Eigenschaften (4B).
Lage
Repeats (Wildtyp)
Intron Mutation in GC
Intron Mutation in MSI positive GC
Intron Mutation in ATM IHC negativ GC
em <> ATM
IVS 6 (T) 1550/540 (9,3%) 42/50 (84,0%) 29/111 (26,1%) ATM
IVS 10 (T) 1559/534 (11,0%) 47/59 (78,7%) 29/111 (26,1%) ATM
IVS 20 (T) 1546 /523 (8,8%) 34/46 (73,9%) 22/107 (20,6%) ATM
IVS 6 oder IVS 10 oder IVS 20 (T) 1578/604 (12,9%) 53/76 (69,7%) 37/112 (33,0%) Tabelle 2. Incidencies von ATM
Gen-Intron-Mutation in den Magenkrebs (GC)
IVS, Sequenz dazwischen. MSI, Mikrosatelliteninstabilität; IHC, Immunhistochemie. Download CSV CSV
ATM IHC
MSI
ATM
Mutation
N
Negative
Positive
NegativeNegative49768 (13.7 %) 429 (86,3%) Positive244 (16,7%) 20 (83,3%) Subtotal52172 (13,8%) 449 (86,2%) PositiveNegative237 (30,4%) 16 (69,6%) Positive5233 (63,5%) 19 (36,5%) Subtotal7540 (53,3 %) 35 (46,7%) Negative52075 (14,4%) 445 (85,6%) Positive7637 (48,7%) 39 (51,3%) Total596112 (18,8%) 484 (81,2%) Tabelle 3. Häufigkeit der ATM-Proteinexpression in Untergruppen nach Mikro Instabilität (MSI) Status und ATM
Mutation Intron.
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Genmutation in GC
Gen-Mutation wurden mit dem Alter, große Größe des Tumors, distalen Stelle, Darm-Typ, tiefer Invasion und geringere Rezidivrate assoziiert. GC Patienten mit negativem ATM IHC wurden mit dem Alter, große Tumorgröße zugeordnet ist, gut mäßig differenzierten Art, und Darm-Typ von Lauren-Klassifikation (Tabelle S1). Chi-Quadrat-Test ATM
Status-Gen-Mutation in ATM IHC negative und positive Gruppen mit klinisch-pathologische Variablen durchgeführt wurde. In der ATM IHC negativen Gruppe, ATM
positive Mutation GC wurden mit dem Alter (p = 0,032) und distalen Stelle (P = 0,045) in Verbindung gebracht. In der ATM-IHC positive Gruppe, ATM
Gen-Mutation wurde mit gut oder mäßig differenzierten Art von GC (P = 0,022) (Tabelle S1).
Überlebensanalyse
Intron Mutation, MSI oder ATM IHC Verlust keine wesentlichen Trends für das relative Risiko (RR) beobachtet. Multivariate Analysevariablen der Tiefe des Tumors, Lymphknotenstatus, Lauren Klassifikation von histologischen Typ, eine adjuvante Chemotherapie mit, ATM
Intron Mutation und ATM-Protein-Expression durchgeführt wurde. ATM-Intron-Mutation hat eine geringere relative Risiko mit einer Borderline Bedeutung für das Gesamtüberleben (p = 0,05, relative Risiko = 0,60 [95,0% CI 0,36-1,00]) (Tabelle 4).
Gesamtüberlebenszeit
Krankheitsfreies Überleben
Relatives Risiko
95,0% CI
P-Wert
N
Relative Risiko
95,0% CI
P-Wert
N
fortgeschrittenen Magen Cancer8.263.00-22.750.005965.051.81-14.130.00544Lymph Knoten positive6.663.47-12.770.005963.201.58-6.480.00544Diffuse Typ histology1.431.06 -1.940.025961.611.09-2.360.02544Adjuvant chemotherapy0.990.57-1.730.985962.171.00-4.720.05544 ATM
Intron mutation0.600.36-1.000.055960.560.29-1.080.08544ATM Protein loss1.190.82-1.730 .355961.100.67-1.810.70544Table 4. Multivariate Cox-Regressionsanalyse.
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Gen führen zu abweichenden Spleißen, was zu einer 22 bp-Deletion und ATM-Protein-Expression Verlust in GC-Zelllinien. Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit dem vorherigen Bericht [13] in Bezug auf die Identifizierung eines Spleiß-Defekt in der MRE11
Vorläufer Transkript verknüpft Mutationen von einem Poly (T) 11 Wiederholung innerhalb dazwischenliegende Sequenz 4 (IVS-4), ausschließlich in MMR-defizienten Krebszelllinien und primären Tumoren. Unsere Ergebnisse zeigten, dass der Verlust ATM Protein in GC signifikant mit dem Vorliegen von Intron-Genmutation in ATM
korrelieren.
Mutationen sind Unsinn, Frameshift oder Splicing-Mutationen, die das Protein [16] gestutzt. Nach COSMIC-Datenbanken (http://www.sanger.ac.uk/cosmic), Mutationen in kodierenden Regionen von ATM
Gen in 5% (433 von 9249) entdeckt wurden von verschiedenen Krebsarten. Unter ihnen zeigten Magenkrebs Mutation nur in 1,35% (1 von 74). Obwohl ATM
Genmutation in GC bereits berichtet wurde [3,9], wurde umfassende Erklärung durch die niedrige Frequenz der Mutation beschränkt und relativ hohe Inzidenz von funktionellen Verlust von ATM [2]. In unserer Studie zeigte etwa 70% der MSI positive GC signifikante ATM
Gen Intron-Mutation mit ATM-Protein-Verlust verbunden. Unsere Ergebnisse unterstützen nachdrücklich, dass die Intron-Mutation des ATM
mit zugrunde liegenden MSI ist einer der wichtigsten Mechanismen der ATM-Verlust in der menschlichen GC. ATM Verlust wird in MSI positiven Kolon-Krebszelllinien mit Intron Verkürzung verbundenen anomale Splicing zurückzuführen. Ejima et al. gesucht ATM
Genmutationen 62 Paaren von Oligonukleotid-Primer verwendet werden, in die Region von Exon 4 bis Exon 65 von ATM
und seine flankierenden Introns Bereich entspricht. Kürzen von Mononukleotid Striche ATM
Introns entfielen 34 (87%) von 39 Intron-Änderungen. Einunddreißig von ihnen wurden in den 5 Kolon-Tumorzelllinien mit MSI (LS180, HCT15, HCT116, SW48 und LoVo) gefunden. Sie zeigten auch geringe Expression von ATM-Protein in MSI positiven kolorektalen Krebszelllinien [14]. Der ATM-Ausdruck wird in vielen Mammakarzinomen signifikant reduziert, und fand keine ATM
Mutation in dieser Zelllinie [17]. Dies zeigt verschiedene Merkmale von ATM
Genveränderungen zwischen Magen und Brustkrebs.
Gen ist ein neues Ziel für die epigenetische Silencing durch unangemessene Methylierung von seinem proximalen Promotorregion korreliert mit einer erhöhten Strahlenempfindlichkeit und niedrige Proteinexpression in einer menschlichen Linie kolorektalen Tumorzellen [18] und humanen Gliom-Zelllinie [18]. ohne ATM
Genmutationen.
Gen, das eine Verbindung zwischen MSI und DNA-Reparatur in GC darstellen. Mehrere Studien zeigen, dass funktionelle Verlust von ATM in MSI erhöht wird und die menschliche ATM
Gen ein Hauptziel für die Inaktivierung in MSI positive GC-Zelllinien und Geweben ist [19,20]. Der Grund für die auffallend hohe Inzidenz von ATM
Gen-Intron-Mutation in MSI positive GC könnte aufgrund der Mononukleotid-Repeats (T) 15 und einer Länge von 13 Nukleotiden oder mehr waren besonders anfällig für diese Verkürzung gezielte [14 ]. Die Häufigkeit von ATM
Gen Astermutation (T) 7 in Exon 6-codierende Sequenz in MSI positive GC wurde nur 6% (2/36) [8] angegeben werden, die viel niedriger ist als unsere Beobachtung.
Ausdruck sensibilisiert [21]. Poly (ADP-ribose) polymerase-Inhibitoren derzeit in klinischen Versuchen gegen eine Vielzahl von Krebsarten untersucht, einschließlich der in Kolonkarzinom [22]. Im GC wird ATM-Mangel ein Prädiktor des Ansprechens auf die PARP-Inhibitor [23-25] bekannt sein. Eine Markierung der homologen Rekombination, 51 Rad, prädiktiver Marker der neoadjuvanten anthracylcine-basierte Chemotherapie bei Brustkrebs [26] sowie von PARP-Inhibitor in GC bekannt ist [24].
Mutation und ATM negativen GC hatte verschiedene klinisch-pathologische Merkmale; Allerdings hat diese Gruppe keine Überleben Unterschied mit anderen zu zeigen. In MSI negativen Gruppe, HR von GC mit ATM-Proteinverlust war signifikant hoch, jedoch bei MSI positive Gruppe, HR in der GC mit ATM-Proteinverlust nicht signifikant war. Dies zeigt, dass MSI ein möglicher molekularer Faktor ist das biologische Verhalten von GC zu beeinflussen. Damit unsere Studie unterstützt die MSI-Status die Empfindlichkeit gegenüber PARP-Inhibitor beeinflussen könnte, indem der Status der DNA Schadensantwort Proteinexpression durch Mononukleotid beeinflussen Änderungen wiederholt.
Genmutation in GC beträgt 12,9% und 33,0% der GC mit ATM
Genmutation mit ATM-Proteinverlust verbunden ist. MSI positive GC zeigte ATM
Mutation in 69,7%. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass das Ergebnis der ATM-Verlust und die Empfindlichkeit gegenüber chemotherapeutischen Verbindung, olaparib könnte besser verstanden werden, wenn Fälle geschichtet basieren auf ATM
Genmutationen oder MSI.
Gen-Intron-Mutation in 69% der MSI positive GC vorhanden ist und 49% der ATM
Intron Mutation verbunden ist mit Verlust von ATM-Protein. Diese deuten darauf hin, die ATM
Gen-Intron-Mutation durch Mikrosatelliteninstabilität ausgerichtet ist, die mit ATM-Protein-Verlust in einer Untergruppe von menschlichen Magenkrebs.
Tabelle S1.
Clinicopathologic Korrelationen von Magenkarzinom mit dem ATM-Gen-Mutation und ATM-Protein-Expression.
doi: 10.1371 /journal.pone.0082769.s001
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