PLoS ONE: MicroRNA-149 Estää leviämisen ja solusyklin etenemisen kautta kohdentaminen ZBTB2 Human mahasyövän

tiivistelmä

Yhä useammat todisteet osoittavat, että miR-149 voi sekä estää ja edistää kasvaimen kasvua riippuen kasvaimen tyypistä. Kuitenkin rooli miR-149 etenemisessä mahasyövän (GC) on edelleen tuntematon. Me raportoimme tässä, että miR-149 on tuumorisuppressori ihmisen syöpään. miR-149 ilmentyminen on vähentynyt GC-solulinjoissa ja kliinisissä näytteissä verrattuna normaaleihin mahalaukun epiteelisolujen ja kudoksissa, vastaavasti. Ilmentymistasojen miR-149 korreloi myös erilaistumisen astetta GC soluja ja kudoksia. Lisäksi ektooppinen ilmentyminen miR-149 mahalaukun syöpäsoluissa estää proliferaation ja solusyklin etenemisen alaspäin säätäminen ZBTB2
, voimakas repressori ARF-HDM2-p53-p21-reitin, jolla on potentiaalia sitoutumiskohdan miR-149 sen mRNA: n 3'UTR. On myös todettu, että ZBTB2 ilmentyminen lisääntyy GC soluissa ja kudoksissa verrattuna normaaliin mahalaukun epiteelisolujen ja kudoksissa, vastaavasti. Hiljentäminen ZBTB2
johtaa suppression solujen kasvun ja solukierron pysähtymisen G0 /G1 vaiheeseen, mikä osoittaa, että ZBTB2 voi toimia onkogeenin GC. Lisäksi transfektointi miR-149 jäljittelee mahalaukun syöpäsoluihin indusoi alas-säätely ZBTB2 ja HDM2, ja ajan säätely ARF, p53 ja p21 verrattuna kontrolleihin. Yhteenvetona tietomme viittaavat siihen, että miR-149 toimii tuumorisuppressorina ihmisen mahalaukun syövän, ainakin osittain läpi, kohdistaminen ZBTB2
.

Citation: Wang Y, Zheng X, Zhang Z, Zhou J, Zhao G, Yang J, et al. (2012) MicroRNA-149 Estää leviämisen ja solusyklin etenemisen kautta kohdentaminen ZBTB2
Human syöpään. PLoS ONE 7 (10): e41693. doi: 10,1371 /journal.pone.0041693

Editor: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 13 maaliskuu 2012; Hyväksytty: 25 Kesäkuu 2012; Julkaistu: 29 lokakuu 2012

Copyright: © 2012 Wang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia National Natural Science Foundation of China (no. 30872966 ja no. 31071135), National Natural Science Foundation of China (no. 81000864, ​​no. 81172290, no. 91129723, no. 81090270, ja no. 81090273) , ja Kiinan tutkijatohtori Science Foundation (no. 20100471776). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mahasyöpää (GC) on yksi yleisimmistä syövistä ja tärkeimpiä syitä syövän kuoleman maailmanlaajuisesti, erityisesti Itä-Aasiassa, mukaan uusin maailmanlaajuinen arviointi julkaistiin vuonna 2011 [1]. Huolimatta merkittävä lasku GC esiintyvyys useimmissa osissa maailmaa, on edelleen suuri taakka suuri määrä GC tapausten ja kuolemantapausten maailmanlaajuisesti. Karsinogeneesi GC on hyvin monimutkainen prosessi, [2] - [5], joihin dysregulaatio useiden geenien [6] - [8], mukaan lukien onkogeenien [9] - [14] ja tuumorisuppressoreita [15] - [18]. Kuitenkin molekyylimekanismeja tarvitaan GC kehittymistä ja etenemistä on tutkittava tarkemmin.

MikroRNA (miRNA) ovat ryhmä endogeenisesti ilmaistu, ei-koodaavat pieniä RNA: iden (20-25 nukleotidin pituinen) tiedetään negatiivisesti säädellä geeniekspressiota vaimentava käännös tai vähentämällä vakautta mRNA: iden suoraan sitovia 3'-transloimaton alue (3'-UTR) ja kohde-mRNA: iden [19], [20]. Kertyvät todisteet osoittavat, että miRNA tärkeä rooli kehityksen, aineenvaihdunnan, lisääntymistä, erilaistumista ja apoptoosia. Lisäksi poikkeava posttranskriptionaalisen sääntely mRNA: iden miRNA liittyy kasvaimien syntyyn [21]. Epänormaali ilmentyminen profiilit miRNA on havaittu erilaisissa ihmisen kasvaimissa, mukaan lukien keuhkojen [22], rintojen [23], eturauhassyöpä [24], maksan [25], paksusuolen [26], ja mahasyövän [27]. Lisäksi jotkut miRNA voi toimia onkogeenien tai tuumorisuppressorit, jonka ekspressiota säätelevät kohdegeenien joka tärkeitä rooleja solusyklin etenemistä, apoptoosin, tai proliferaatiota. miR-22 [28], miR-101 [29], ja miR-7 [30] on kaikki osoitettu vaimentua kasvaimen yksilöiden ja toimivat tuumorisuppressoreilla; miR-17 [31], ja miR-21 [32], on osoitettu olevan yliaktiivista Tuumorinäytteet ja toimivat onkogeenejä. Nämä tutkimukset osoittavat, että dysregulaatio miRNA on usein mukana karsinogeneesissä ja syövän etenemisessä.

Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että miR-149 voi olla tärkeä rooli erilaisten sairauksien, kuten etenemistä pahanlaatuisia kasvaimia. miR-149: n on osoitettu toimivan sekä tuumorisuppressorina [33] ja onkogeenin [34] kehittämiseen useita erityyppisiä kiinteitä kasvaimia. Esimerkiksi menetys miR-149 johtaa saada toimimasta joidenkin onkogeenien ja korreloivat kasvaimen munuaissolukarsinoomassa [35], astrocytomas [36], ja eturauhasen syöpä [37]. Kohdunulkoinen ilmentyminen miR-149 indusoi apoptoosia neuroblastooma ja HeLa-solujen [33]. Kohonnut ilmentyminen miR-149 on raportoitu olevan tärkeä etenemistä nenänielun karsinooman [38] ja -melanoomaetäpesäkemallilla [34]. Lisäksi häiriöstä miR-149 on myös liitetty joitakin ei-neoplastisia sairauksia. Esimerkiksi, downregulation miR-149 ilmentyminen on mukana kehittämässä ensisijaisen myelofibroosin, polysytemia vera, ja olennaista trombosytemiassa [39], ja menetys miR-149 voi estää hepatiitti C-viruksen (HCV) RNA: n runsaus [40]. Ilmaisulla kuvio ja rooli miR-149 kehittämisessä GC jää epäselväksi.

Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että miR-149 on merkittävästi vaimentua GC solulinjoissa ja kliinisissä näytteissä verrattuna normaali mahan epiteelisolujen ja viereisen ei-kasvain kudosten, vastaavasti. Kohdunulkoinen ilmentyminen miR-149 estää proliferaatiota ja indusoi G0 /G1 pidätyksen AGS ja SGC7901 solujen in vitro
kohdentamalla ZBTB2
. Lisäksi ehtyminen ZBTB2
siRNA johtaa lisäkasvun estäminen ja solusyklin pysähtymisen. Ekspressiokuviota miR-149 ja ZBTB2 GC solulinjoissa ja kliiniset näytteet korreloi käänteisesti, edelleen viittaa siihen, että ZBTB2
on kohdegeeni miR-149. Esittely miR-149 johtaa muutoksiin ilmaisussa p53, p21, ARF, ja HDM2 jäsenet ARF-HDM2-p53-p21-reitin, joka sääntelee ZBTB2. Yhteenvetona, nämä tulokset vahvistavat, että miR-149 on vaimentua GC-soluissa ja kliinisissä näytteissä, ja viittaavat siihen, että miR-149 toimii vaimentimen mahalaukun syövän solujen kasvua estämällä proliferaation ja solusyklin etenemisen.

Tulokset

Expression of miR-149 on vaimentua GC solulinjoissa ja kliinisissä näytteissä

roolin arvioimiseksi miR-149 on karsinogeneesi GC, ensin käytetty kvantitatiivinen RT-PCR mitata ilmaus miR-149 ihmisen GC solulinjoissa (MKN45, GC9811, AGS, SGC7901, ja MKN28) ja totesi, että miR-149 säädeltiin vähentävästi GC solulinjoissa verrattuna normaaliin mahalaukun epiteelisolujen linja, GES-1 (Fig. 1A). Erityisesti, ilmentymisen taso miR-149 korreloi positiivisesti erilaistumisen astetta GC soluja. Nimittäin ekspressiotaso miR-149 huonosti eriytetty solulinjoissa, kuten MKN45, GC9811, ja AGS, on huomattavasti pienempi kuin kohtalaisen ja hyvin erilaistunut solulinjoissa. Ilmaisu Mir-149 kohtalaisen erilaistuneita soluja, SGC7901, on alhaisempi kuin hyvin erilaistunut solulinja, MKN28 (Fig. 1A).

Sen määrittämiseksi, jos tasot miR-149 myös korreloivat erilaistumisen kanssa asteen kasvainten tarkastelimme ilmaus miR-149 44 ihmisen GC kliinisistä näytteistä, joista 13 huonosti, 16 kohtalaisen, ja 15 hyvin eriytetty näytteitä. Olemme havainneet, että ilmentyminen miR-149 mahalaukun kasvaimet on huomattavasti pienempi kuin täsmäsi viereisistä normaaleista kudoksista (Fig. 1 B). Lisäksi ilmaus miR-149 in eriytetympää kasvaimissa oli suurempi kuin vähemmän eriytetty kasvaimia (Fig. 1 C, F = 65,391, p
< 0,001). Lisäksi, vähentynyt ilmentyminen miR-149 korreloi imusolmuke etäpesäke (* p
= 0,046) ja TNM-luokitus (** p
= 0,0011) (taulukko 1).

ektooppinen ilmentyminen miR-149 estää proliferaatiota ja indusoi G0 /G1 pidätys AGS ja SGC7901 solujen

roolin tutkimiseksi miR-149 GC soluissa, käytimme huonosti ja kohtuullisesti erilaistunut GC solulinjat, AGS ja SGC7901, vastaavasti. AGS ja SGC7901 soluja transfektoitiin ohimenevästi eithermature miR-149 jäljittelee, estäjä, valetransfektoidut tai miR-NC. Kuten kuviossa 2A, 2D, kvantitatiivinen RT-PCR-tulokset osoittavat, että ekspressio miR-149 jäljittelee tai inhibiittorit merkittävästi ylössäätää tai downregulate ilmentymisen miR-149, vastaavasti, AGS ja SGC7901 solut ensimmäinen-viides päivänä transfektion jälkeen (kuvio . 2A, F = 8,429, p
= 0,003; kuva 2D, F = 8,595, p
= 0,003) verrattuna NC ja mock valvontaa.

AGS ja SGC7901 transfektoiduissa soluissa miR-149 matkii ja estäjät osoittivat huomattavasti alhaisemmat ja korkeammat solujen lisääntymistä vastaavasti kuin NC tai mock ryhmiä määritettynä MTT: llä (Fig. 2B, F = 27,47, p < 0,001; Kuva. 2E, F = 44,061, p < 0,001). Transfektio AGS ja SGC7901 solujen miR-149 jäljittelee aiheuttaa huomattavia G1 vaiheessa pidätyksen verrattuna NC ja mock tarkastukset ( p
< 0,05). Lisäksi hoito miR-149 estäjät johti vähemmän AGS ja SGC7901 soluja G1 pidätys verrattuna NC ja mock tarkastukset ( p
< 0,05) (Fig. 2C, F = 134,177, p
< 0,001; Kuva. 2F, F = 58,792, p
= 0,003).

ZBTB2
on tavoite miR-149

Aikaisemmat tiedot viittaavat siihen, että miR-149 voi olla suppressori GC solujen kasvua kohdistamalla geenejä, jotka ohjaavat proliferaation ja solusyklin etenemisen (33-34) (38). Niinpä etsimme uusia mahdollisia kohteita miR-149 TargetScanHuman tietokannasta. Havaitsimme lukuisia mahdollisia miR-149 kohdegeenien, kuten ZBTB2
, joka on POK perheen transkriptiotekijän ja tehokas repressori ARF-HDM2-p53-p21-reitin (41). ZBTB2
havaittiin oletetun miR-149 sitoutumiskohtien sen 3'UTR (Fig. 3A). Lusiferaasireportteri- kokeet suoritettiin sen varmistamiseksi, onko ZBTB2
on välittömänä kohteena miR-149 käyttämällä AGS ja SGC7901 soluja. Me kotransfektoidaan AGS ja SGC7901 soluissa kanssa psiCHECK-2 vektori sisälsi joko 3'UTR varten ZBTB2 tai mutantit 3'UTR varten ZBTB2, ja jäljittelee Mir-149 tai inhibiittorit miR-149. Villityypin ja mutantti-ZBTB2-3'UTR sisältävät oletetun sitoutumiskohdan miR-149 kloonattiin psiCHECK-2 vektori alavirtaan lusiferaasigeeniin (kuvio. S1). Käyttöönotto miR-149 vähensi merkittävästi lusiferaasin aktiivisuutta ZBTB2 3'UTR reportteri-vektoriin (Fig. 3B-3C, p
< 0,001), mutta ei vaikuta lusiferaasi-aktiivisuutta mutantti ZBTB2-3 'UTR reportterivektoria. Nämä tiedot viittaavat siihen, että miR-149 suoraan säätelee ZBTB2
ekspressiotasoja. Lisäksi, ei ole merkittävää laskua suhteellisen lusiferaasiaktiivisuus soluissa ko-transfektoitiin miR-149-estäjän tai 3'-UTR-ZBTB2 /psiCHECK-2-vektoriin (Fig. 3B-3C). Se on ehkä siksi, että ei ole vuorovaikutusta 3'UTR ZBTB2 ja endogeenisen miR-149, siten, vähentynyt miR-149 ilmaisu ei lisätä lusiferaasin aktiivisuutta ZBTB2-3'UTR reportterivektoria. Nämä tulokset vahvistavat edelleen, että miR-149 estää ZBTB2 ilmaisun kohdistamalla 3'-UTR ZBTB2
mRNA.

miR-149 ja ZBTB2 ilmentyminen korreloi negatiivisesti GC soluissa ja kliinisistä näytteistä

Jotta voitaisiin edelleen tutkia suhdetta miR-149 ja ZBTB2 selvitimme ilmentymistä ZBTB2 GC soluissa käyttäen western blotting ja GC kudoksissa käyttäen immunohistokemiallista määritystä. Todettiin, että GC-soluissa on huomattavasti korkeampi ilmentymistaso ZBTB2 kuin normaali mahan epiteelisolujen, GES-1 (Fig. 4A a-b F = 167,843, p
< 0,001). ZBTB2 ilmentyminen korreloi negatiivisesti erilaistumisen astetta GC solut; huonosti eriytetty GC kudosten osoitti merkittävää korkeamman ZBTB2 ekspressiotaso kuin hyvin eriytetty GC kudoksia ja vastaaviin normaaleihin maha- kudoksissa (Kuva. S2A-B, F = 117,280, p
< 0,001). ZBTB2
mRNA: n ilmentymisen tasot ovat yhtenevät proteiinin tasot (Fig. 4B, F = 283,355, p
< 0,001). Lisäksi ilmaus miR-149 ja ZBTB2 korreloi käänteisesti (Fig. 4B b, p
= 0,033, R = -0,908). Sitten mitattiin ekspressiotasot miR-149 ja ZBTB2
käyttämällä kvantitatiivista RT-PCR: llä 5 GC solulinjoissa (MKN45, GC9811, AGS, SGC7901, ja MKN28) (Fig. 4C a) ja 18 GC kliinisiä näytteet (6 huonosti, 6 kohtalaisen, ja 6 hyvin eriytetty näytettä) (Fig. 4C b). Tulokset vahvistavat, että mRNA taso ZBTB2
negatiivisesti korreloi miR-149 lauseke (Fig. 4C a, p
= 0,033, R = -0,847, Fig. 4C b, p
< 0,001, R = -0,908). Lisäksi AGS (Fig. 4D) ja SGC7901 soluja (Kuva. 4E) transfektoitu miR-149 matkii on vähentynyt merkittävästi ilmaus ZBTB2 at proteiinin tasot (paneelit a-b) ja mRNA-tasot (paneeli c) verrattuna mock tai NC solut ( p
< 0,001). Tuloksemme osoittavat, että miR-149 voi suoraan säätelemään ZBTB2
.

miR-149 tukahduttaa GC solujen lisääntymisen ja solusyklin etenemisen kohdistamalla ZBTB2

Seuraavaksi vahvisti, että miR-149-välitteisen proliferaation eston ja solusyklin pidätyksen GC soluissa edellyttää kohdentamista ZBTB2
. ZBTB2
ilmentyminen tippuu alas käyttämällä siRNA: t in AGS ja SGC7901 soluja. Western-blottauksella (kuvio. 5A, a-c) ja kvantitatiivinen PCR-analyysi osoitti, että ehtyminen ZBTB2
siRNA transfektio voitaisiin korvata merkittävästi miR-149-inhibiittorin ja merkittävä lisääntyminen on ZBTB2 havaittiin soluissa, jotka on transfektoitu miR-149 estäjien (Fig. 5B, p
< 0,001). MTT-analyysi osoittaa, että solujen lisääntymistä transfektoitiin siRNA-ZBTB2 tukahdutettiin ja solujen lisääntymisen, jotka oli transfektoitu miR-149-inhibiittorit kasvoi merkittävästi verrattuna soluihin, jotka on transfektoitu siRNA-NC (kontrolli) ja siRNA-ZBTB2 + miR-149 (Fig. 5C ). Lisäksi esto ZBTB2
ilmaisun edistää G0 /G1 pidätyksen ja tukahduttaa G0 /G1 solusyklin pysähtymiseen aiheuttama miR-149-estäjä hoitoa AGS ja SGC7901 soluja verrattuna NC ohjaus soluja (Kuva. 5D-5E, p
< 0,001). Tulosten perusteella näyttää, että miR-149 inhiboi GC soluproliferaatiota ja solusyklin etenemisen estämällä ZBTB2
ilme.

käyttöönotto miR-149 muuttunut ilmentyminen ZBTB2 ja solusyklin liittyviä proteiineja

ZBTB2 on raportoitu olevan tehokas repressori ARF-HDM2-p53-p21-reitin, mikä on tärkeää solusyklin säätelyssä (41). Tutkitaan sääntely näiden proteiinien miR-149 GC soluissa, me transfektoitu AGS ja SGC7901 solujen miR-149 jäljittelee tai miR-NC ja suoritettiin RT-PCR ja Western blotting-analyysi ZBTB2 kohdegeenien. Kuten on esitetty kuvassa 6A-6B, ektooppinen ilmentyminen miR-149 downregulates ilmentymistä ZBTB ja HDM2, ja ylössäätelee ilmentymistä ARF, p53, ja p21 ( p
< 0,001). Nämä tiedot ovat sopusoinnussa funktio ZBTB2 on tukahduttaa transkription ARF, p53 ja p21, ja aktivoimalla ilmentymistä HDM2 (41). Lisäksi ektooppinen ilmentyminen ZBTB2 transfektoimalla päinvastaiseksi miR-149-välitteinen väheneminen HDM2 ilmaisun ja kasvu ARF, p53 ja p21 ilmaisun AGS ja SGC7901 soluja (Kuva. 6A-B). Kohdunulkoinen ZBTB2 ilmentyminen vahvistettiin transfektoiduissa AGS ja SGC7901 soluja (kuvio. S3, SGC7901 solut, F = 806,365, p
< 0,001; AGS soluihin, F = 1436,300, p
< 0,001). ARF, p53 ja p21 edistää solusyklin etenemisen vuoksi, niiden downregulation ekspressoimalla miR-149 jäljittelee selittää G0 /G1 vaihe pidätys AGS ja SGC7901 soluja.

Keskustelu

Lisääntyvä todistusaineisto viittaa siihen, että miRNA on kriittinen rooli syövän synnyssä ja syövän etenemistä [21]. Altered miRNA ekspressiotasot ovat sekaantuneet aloittamisen ja kehittämisen kasvaimia; modulaatio miRNA jotka toimivat alipaineensäätöventtiileillä onkogeenien tai tuumorisuppressoreilla johtaa edistämisessä syöpäsolujen lisääntymistä ja kasvua [28] - [32]. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että rooli miR-149 etenemisen eri tyyppisten kasvainten on kiistanalainen [33] - [36], [38]. Ilmaisu kuvio ja tavoitteet miR-149 vaihtelevat eri tyyppisiä kasvaimia. miR-149 ilmentyminen säädeltiin joidenkin kasvainten, joka toimii tuumorisuppressori kohdistamalla onkogeenien joidenkin syöpien. Esimerkiksi kirkas cell munuaissolusyövässä miR-149 on vaimentua ja sen todennäköinen tavoitteet tunnistettiin KCNMA1 ja LOX (35). Lisäksi miR-149 on myös vaimentua glioblastoomasoluissa ja on ehdotettu toimivan tuumorisuppressorina kohdistamalla RAP1B, CD47, CCN1, ja NXF1 [36]. Sen sijaan, miR-149 voi toimia myös tuumorisuppressorina kohdistamalla tiettyjen onkogeenien. Havaitseminen miRNA ekspressioprofiileja eri kliinisissä vaiheissa nenänielusyöpä (NPC) ja NPC imusolmuke etäpesäke osoittaa, että ilmaus miR-149 on yliaktiivista NPC ja ilmentyminen sen kohdegeenin, Smad2
, on vähentynyt kanssa etenemisen NPC [38]. Samanlainen onkogeeniset rooli miR-149 nähtiin myös melanooma, jossa ylösajon miR-149 aiheuttaa downregulation GSK3-α ja ylössäätely Mcl-1, mikä johtaa apoptoottisten resistenssin [34]. Toistaiseksi tiedetään vähän roolista miR-149 mahasyövän. Tässä me raportoimme, että miR-149 ilmentyminen on huomattavasti vähennetty useita mahasyövän solulinjojen ja kliinisissä näytteissä verrattuna normaaliin mahalaukun epiteelisolujen ja sovitettu viereisten normaaleissa kudoksissa, vastaavasti. Tärkeää on, että taso miR-149: n ilmentyminen liittyy erilaistumiseen asteen GC-solujen ja näytteet; huonosti eriytetty GC solut tai yksilöt ovat pienemmät miR-149 ilmentymisen verrattuna hyvin eriytetty näytteitä. Kohdunulkoinen ilmentyminen miR-149 estää solujen lisääntymistä ja solusyklin etenemisen kohdistamalla ZBTB2
vuonna AGS ja SGC7901 soluja. miR-149 ja ZBTB2 ilmaisun korreloivat negatiivisesti GC soluissa ja kliinisissä näytteissä, ja yli-ilmentyminen miR-149 aiheuttaa downregulation ZBTB2
. Köyhtyminen ZBTB2 johtaa inhibitioon AGS ja SGC7901 solujen lisääntymistä ja solusyklin etenemisen. Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että ensimmäistä kertaa, että ZBTB2 voi toimia onkogeenin on tuumorigeneesiin mahasyövän.

tiedot osoittavat, että käyttöönotto miR-149 osaksi GC soluihin indusoi solusyklin pysähtymiseen, mikä viittaa siihen, että miR-149 tavoitteita voidaan osallisena solusyklin säätelyssä. ZBTB2 on POK perhe transkriptiotekijä, joka voi estää ARF-HDM2-p53-p21-reitin [41]. ARF, kasvain vaimennin [42], voidaan saada aikaan kestävä mitogeenisesta stimulaation ja avainasemassa aktivoinnissa p53 itsenäisesti ohjaamalla vakauteen p53 vuorovaikutuksessa HDM2 [43], tärkeä säätelijä p53. Kasvain p53 on keskeisessä asemassa ylläpidossa solun homeostaasin läpi asiakkuutta solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin kun soluja altistetaan stressitekijöitä, kuten hypoksia, DNA-vaurioita, ja telomeerivasta toimintahäiriö [44]. p21, p53 kohdegeenin välittää solusyklin G1-vaiheen pysähtymisen sitoutumisen kautta, ja inhiboimaan sykliini-CDK2 tai CDK1 kompleksit [45]. ZBTB2 voi tukahduttaa transkriptio ARF, p53 ja p21, ja aiheuttavat HDM2 ilmaisun [41]. Kun haluat varmistaa, solusyklin aiheuttamia vaikutuksia miR-149 ilmentyminen välittyy ZBTB2 menetys, tutkimme ilmaus HDM2, ARF, p53 ja p21 AGS ja SGC7901 transfektoitujen solujen miR-149 jäljittelee. Huomasimme, että ektooppinen ilmentyminen miR-149 johtaa lisääntyneeseen ilmentymä ARF, p53 ja p21 ja laski ilmentymä HDM2 ja ZBTB2. Nämä tulokset tukevat sitä ajatusta, että miR-149 kykenee sen asemaa estämällä GC solujen proliferaation ja solusyklin etenemisen kohdistamalla ZBTB2
siten ilmentymisen moduloimiseksi loppupään säätelijöitä solusyklin etenemisen.

Yhteenvetona , meidän tiedot osoittavat, että miR-149 voi toimia tuumorisuppressori mahalaukun syövän soluissa, ja sillä on tärkeä rooli estämällä ZBTB2
. Siksi downregulation miR-149 tukee GC solujen lisääntymisen ja solusyklin etenemisen. Lisäksi tuloksemme osoittavat, että ZBTB2 voi toimia onkogeenin kehittämiseen mahasyövän. Kun kuitenkin otetaan huomioon se, että kukin miRNA voi säädellä monia kohdegeenien jotka voivat vaikuttaa syövän syntymistä eri tavoin, lisää tutkimuksia tarvitaan selvittämään muita miR-149 tavoitteita, jotka voivat olla kriittisiä rooleja GC kasvainten synnyssä. Tämä tutkimus antaa myös uusia käsityksen rooliin miR-149 ihmisen mahasyövän etenemistä ja osoittaa, että miR-149 voi toimia terapeuttisena kohteena mahasyövän hoitoon.

Materiaalit ja menetelmät

etiikka lausunto

kudosnäytteitä, kirjallinen suostumus saatiin potilailta. Menettelyt Tässä tutkimuksessa käytetyt hyväksyi Institutional Review Board neljännen Military Medical University, ja oli sopeutui Helsingin julistuksen ja paikallisen lainsäädännön.

Solulinjat ja viljelyolosuhteet

Mahalaukun syöpälinjojen AGS, MKN28, MKN45 ostettiin AGCC ja, GC9811 ja SGC7901 solulinjat saatiin Beijing Institute of Oncology. Kaikki solulinjat pidettiin meidän instituutti mukaan suositellaan protokollia. Soluja viljeltiin RPMI-1640-alustassa (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 37 ° C: ssa, 5% CO _{2-inkubaattorissa .}

Human yksilöitä

Kaikki koetoimenpiteet hyväksyi Institutional Review Board neljännen Military Medical University. Kirjallinen suostumus saatiin kaikkien potilaiden samples.Human mahasyövän näytteitä (n = 44) ja sovitettu viereisen ei-kasvain näytteet saatiin potilailta Xijing sairaalan Digestive Diseases, neljäs Military Medical University, jossa tietoisen suostumuksen kustakin potilaasta.

RNA puhdistus, cDNA-synteesi ja kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR: n (qRT-PCR) B

Yhteensä RNA viljellyistä soluista uutettiin TRIzol reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) mukaisesti valmistajan protokollan ja RNA: t säilytettiin -80 ° C: ssa, ennen kuin qRT-PCR-analyysi. Aikuinen miR-149 ekspressiota havaittiin käyttämällä Mirvana TM qRT-PCR miRNA Detection Kit (Ambion Inc. Austin, Texas), jossa U6 sisäisenä kontrollina. ZBTB2 ekspressio havaittiin alukkeilla, F: 5'ACTCGGGCGAGATCCACGGC 3 ', R: 5' ACGCAGGCTGCTCATCGGAG 3 ', ja GAPDH käytettiin sisäisenä kontrollina. PCR-tuotteet erotettiin etidiumbromidilla värjätty 1,5% agaroosigeelillä ja visualisoitiin UV.

Solun transfektio

Ihmisen miR-149 duplex matkivat ja estäjä (miR-149) ja negatiivinen kontrolli Oligonukleotididupleksi matkivat (miR-NC) on suunniteltu ja toimittanut Ribobio (Guangzhou, Guangdong, Kiina). Pieni häiritsevä RNA (siRNA) varten ZBTB2 ja negatiivisen kontrollin RNA (siRNA-NC) syntetisoitiin ja puhdistettiin Genepharma (Shanghai, Kiina). miRNA, siRNA: t ja ZBTB2 cDNA-plasmidia (FulenGen Co Kiina) transfektoitiin LipofectamineTM 2000 reagenssia (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) valmistajan protokollan. ZBTB2 siRNA sekvenssi: F: 5'-GCUGGCUUCUUUCCAAGUU dTdT 3 ', R: 5' AACUUGGAAAGAAGCCAGC 3 '; NC siRNA järjestyksessä: F: 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT -3 ', R: 5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT -3 ".

miRNA tavoite ennustus

löytää mahdollisia miRNA kohdegeenien, TargetScanHuman verkkosivuilla ( http://www.targetscan.org/) käytettiin, sitova vapaa energia on laskettu ja biding sivustot analysoitiin käyttämällä http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid verkkosivuilla.

vektori konstruktit ja lusiferaasireportterigeenin määritys

rakentamiseksi ZBTB2-3'UTR plasmidi, villityypin 3'-UTR-fragmenttia ihmisen ZBTB2 mRNA (1238-1244 nt, Genbank-no. NM_020861.1), joka sisältää otaksutun miR-7 sitova sekvenssi monistettiin RT-PCR: llä ja kloonattiin n välissä Xho I: n ja Not I alavirtaan lusiferaasireportterigeenillä on psiCHECK ™ -vektoriin (Promega, USA). Mutantti yksittäisen miR-7 sitoutumiskohta (5'GAGCCAG-3 '5'-ACCGCGC-3') 3'-UTR ZBTB2 sisällytti Site-Directed Mutagenesis Kit (SBS Genetech, Peking, Kiina ). Villi ja mutantti tyyppisiä pmirGLO-ZBTB2-UTR vektorit validoitu DNA-sekvensoinnilla.

nukleotidisekvenssit alukkeiden ZBTB2-3'UTR (MT) klooni: mutZBTB2F: 5'GGCCTCACAAGACAAAACAGACCGCGCAAGTAAGGACTGAAGGAGAA 3 'mutZBTB2R: 5' TTCTCCTTCAGTCCTTACTTGCGCGGTCTGTTTTGTCTTGTGAGGCC 3 '

nukleotidisekvenssit alukkeiden ZBTB2-3'UTR (WT) klooni: ZBTB2XhoIF: 5'CCGCTCGAG ATGTCACTTATCTTTTTAAAAAACTCTCA 3' ZBTB2NotIR: 5'ATAAGAATGCGGCCGC TACTCATTTAATTAAACGTTTATTC 3 'ZBTB2XhoIF2: 5'CCGCTCGAGATGTCACTTATCTTTTTAAAAAACTCTCATTTTTACAAAGACTATC 3' ZBTB2F3: 5'CCGCTCGAG CTGTAGTTCTCCATGGCATGATAC 3 '.

Solut transfektoitiin miR-149 jäljittelee, NC ja pmirGLO plasmidi 24-kuoppaisilla levyillä käyttäen lipofektamiinia ™ 2000 (Invitrogen) ohjeiden mukaisesti. 48 tuntia myöhemmin, solut kerättiin ja analysoitiin lusiferaasiaktiivisuus käyttäen Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega, USA) ja havaita GloMaxTM 20/20 tunnistusjärjestelmä (E5331, Promega).

Western blotting

Yhteensä proteiinin viljellyistä soluista lyysattiin Lysis Buffer, joka sisältää PMSF: ää jäällä. Sitten proteiini ajettiin elektroforeesilla 12% SDS-polyakryyliamidigeeleillä ja siirrettiin sitten PVDF-kalvolle (Millipore). Membraanit blokattiin 5% rasvatonta maitojauhetta huoneenlämpötilassa 1 tunnin ajan ja inkuboitiin yön yli primaarisilla vasta-aineilla. Membraanit inkuboitiin toissijaisen vasta-aineilla leimattu HRP 1 h jälkeen huoneenlämpötilassa kolme 10 minuutin pesua TBS-T: n (triethanolaminebuffered suolaliuos Tween). Lopuksi, signaalit havaittiin käyttämällä ECL (Pierce Biotech., Rockford, IL, USA) ja kalvot skannattiin ja analysoitiin käyttäen Bio-Rad ChemiDoc XRS + kuvantamisjärjestelmä kuvankäsittely (versio määrä 1). Proteiini ilmentyminen normalisoitu endogeenistä viite (aktiini) ja suhteessa kontrolliin. Spectra monivärinen laaja kantaman proteiini tikapuut (Fermentas) käytettiin molekyyli- merkki. Kaikki käytetyt vasta-aineet western blot -määritys on lueteltu taulukossa S1.

Immunohistokemia ja immunohistokemiallinen pisteytys

Parafiinisektioista, 4 um paksu, paistettiin 2 h 65 ° C: ssa ja parafiini . Antigeeni haku suoritettiin käyttäen sitraatti- natrium-puskuria (pH 7,2) 95 ° C: ssa 15 minuuttia ja sitten liukuu jäähdytettiin huoneen lämpötilassa 30 minuuttia. Sen jälkeen, kun käsiteltiin 3% vetyperoksidia 15 minuutin estää endogeenisen peroksidaasin, leikkeet käsiteltiin normaalilla vuohen seerumilla rajoittamalla nesteen 30 minuuttia vähentää ei-spesifisen sitoutumisen ja sitten kanin polyklonaalista anti-ZBTB2 (1:500, BIOSs Co . Kiina) inkuboitiin osat 12 h 4 ° C.After rewarming 1 h ja pesemällä 5 kertaa, leikkeitä inkuboitiin sekundäärisen vasta-aineen kanssa 30 minuuttia huoneen lämpötilassa. Diaminobentsidiiniä (DAB) käytettiin värireaktiot. Myöhemmät immunohistokemiallinen värjäys pisteytettiin kuten aiemmin on kuvattu [46].

MTT-määritys

transfektoitiin 100 nM miR-149 estäjä (Genepharma, Shanghai, Kiina), jäljittelee (Ribobio, Guangzhou, Guangdong, Kiina) tai 100 nM siRNA-ZBTB2 (Genepharma) .Twenty neljä myöhemmin solut siemennettiin 96-kuoppalevyillä (2 x 103 /kuoppa). Solujen elinkelpoisuus tutkittiin MTT: tä (3-2, 5-difenyylitetratsoliumbromidi) määritystä (Sigma, USA) päivittäin 6 päivää.

Cell cycle määritys virtaussytometrillä

Mahasyöpää solulinjoja, AGS ja SGC7901 kasvatettiin RPMI-1640-alustassa (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), jota oli täydennetty 10% FBS: ää 6-kuoppaisille levyille. Transfektio suoritettiin kun solut saavuttivat 80 %% - 90% konfluenssiin. Sen jälkeen solut otettiin talteen, pestiin kaksi kertaa käyttäen PBS: llä ja kiinnitetään 70% etanolilla 4 ° C: ssa yön yli. Sitten soluja inkuboitiin propidiumjodidilla huoneenlämpötilassa 1 h ja analysoitiin virtaussytometrialla käyttämällä FACScan-virtaussytometrillä (BD Biosciences, Mountain View, CA). Nämä tiedot analysoitiin käyttämällä Flowjo (Flowjo).

Tilastollinen analyysi

Data ilmaistiin keskiarvona ± SEM kolmesta itsenäisestä kokeesta. Tilastollista testeissä, SPSS-ohjelmisto, version17.0 (SPSS, Chicago, IL, USA) käytettiin. Opiskelijan t-testiä, yksisuuntaista ANOVA ja kaksisuuntainen ANOVA testi tehtiin MTT määrityksissä, kvantitatiivinen PCR ja kasvaimen kasvukäyrä. Korrelaatio miR-149 ja ZBTB2 analysoitiin Spearmanin. P-arvot < 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

tukeminen Information
Kuva S1.
Villityypin ja mutantti ZBTB2
-3'UTR joka sisältää oletetun sitoutumiskohdan miR-149 kloonattiin psiCHECK-2-vektoriin. A. ZBTB2
-3'UTR monistettiin genomisesta DNA: sta AGS. B. Lane 1,3, 5: Rekombinanttiplasmidit on ZBTB2-1, ZBTB2-2, ZBTB2-3
vastaavasti; kaista 2,4,6: Tulokset entsyymidigestiolla rekombinanttiplasmidien on ZBTB2-1, ZBTB2-2, ZBTB2-3
vastaavasti. Tulokset osoittivat, että ZBTB2
-1/2/3 on onnistuneesti insertoida vektoreihin. (M1: DL2000 DNA Marker, M2: DL1 kb: n DNA Marker; ZTBT2-1 /2/3 bändejä: 1406 bp; vektorit bändit: 6,1 Kb). C. M1: 1 kb DNA Ladder Marker. Kaista 1: vahvistus mut ZBTB2
F1 /R1 (negatiivinen kontrolli ilman Taq entsyymiä); Kaista 2: monistamiseen mut ZBTB2
F1 /R1. Yksi kaista mut ZBTB2
(7,6 Kb) osoitti onnistuneen PCR mutanttien vahvistusta. D. sekven- WT- ZBTB2
ja MT - ZBTB2
.
Doi: 10,1371 /journal.pone.0041693.s001
(TIF) B Kuva S2 .
ZBTB2 ilmentymistä ihmisen mahasyövän yksilöitä ja sovitettu viereisten normaaleissa kudoksissa. A. Kuvat ovat osoittaneet positiivisia immunohistokemiallisella värjäyksellä ZBTB2 ihmisen mahasyövän yksilöt (b-c) ja sovitettu viereisten normaaleissa kudoksissa (a) (suurennos 200 x). B. Immunohistokemiallinen värjäys pisteytettiin kuten aiemmin on kuvattu [46]; tilastollinen analyysi tietojen ZBTB2 ilmaisun ero ihmisen mahasyövän yksilöitä ja sovitettu viereisen ei-syöpä kudoksiin (One-Way ANOVA, F = 117,280, *** p
< 0,001).

• PLoS ONE: CYP2E1 RsaUlä /PstI polymorfismi ja mahasyövän Herkkyys: Meta-analyysit Perustuen 24 tapausverrokkitutkimukset
• PLoS ONE: geneettinen alttius tekijät Geenit Osallisena Steroidihormonin biosynteesipolun ja progesteronireseptori mahasyövän Risk