PLoS ONE: mikrornk-149 inhibira proliferaciju i progresiju staničnog ciklusa kroz usmjerenost ZBTB2 u ljudske želučane Cancer

Sažetak pregled

Sve veći broj dokaza ukazuje na to da Mir-149 može i potisnuti i promicati rast tumora, ovisno o vrsta tumora. Međutim, uloga Mir-149 u progresiji karcinoma želuca (GC) i dalje je nepoznat. Ovdje smo izvješće da je Mir-149 je tumor supresor u ljudskoj raka želuca. Mir-149 ekspresija smanjena je u staničnim linijama GC i kliničkih uzoraka u odnosu na normalnu želuca epitelnih stanica i tkiva, respektivno. Razina ekspresije Mir-149 i korelira sa stupnjem diferencijacije GC stanica i tkiva. Štoviše, ektopijska ekspresija Mir-149 u stanicama raka želuca inhibira proliferaciju, napredovanja staničnog ciklusa od podreguliranje ZBTB2 pregled, potentni represor iz ARF-HDM2-p53-p21 puta, s potencijalnim vezanja za mir-149, u svojoj mRNA 3'UTR. Također je utvrđeno da ZBTB2 izraz povećanja GC stanicama i tkivima u odnosu na normalne želuca epitelnih stanica i tkiva, respektivno. Odsutnost ZBTB2 pregled dovodi do supresije rasta stanica i zaustavljanje staničnog ciklusa u G0 /G1 fazi, što pokazuje da ZBTB2 može djelovati kao onkogena u GC. Nadalje, transfekcija Mir-149 oponaša u želučanu stanica raka izaziva-naniže ZBTB2 i HDM2, i up-regulaciji ARF, p53 i p21 u usporedbi s kontrolnom skupinom. Ukratko, naši rezultati pokazuju da Mir-149 djeluje kao supresor tumora u ljudskom raka želuca strane, barem djelomično, putem, ciljanje ZBTB2

Izvor:. Wang Y, Zheng X, Zhang Z, Zhou J, Zhao G, Yang J, et al. (2012) mikrornk-149 inhibira proliferaciju i progresiju staničnog ciklusa kroz usmjerenost na ZBTB2 pregled u ljudskoj raka želuca. PLoS ONE 7 (10): e41693. doi: 10,1371 /journal.pone.0041693 pregled

Urednik: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Sjedinjene Američke Države Netlogu

Primljeno: 13. ožujka 2012; Prihvaćeno: 25. lipanj 2012; Objavljeno: 29. listopad 2012 pregled

Copyright: © 2012 Wang et al. Ovo je otvorenog pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan

financiranja. Ovo djelo bio podržan od potpora iz Nacionalne zaklade prirodoslovni Kine (br. 30872966 i ne. 31071135), Nacionalni Natural Science Foundation of China (br. 81000864, ​​br. 81172290, br. 91129723, br. 81.090.270, i ne. 81090273) i kineski Postdoktorska Science Foundation (br. 20100471776). U financijeri nisu imali ulogu u studiju dizajna, prikupljanja i analize podataka, Odluka o objavi, ili pripremu rukopisa pregled

U konkurenciji interese.. Autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi pregled

Uvod pregled

rak želuca (GC) je jedan od najčešćih oblika raka i glavnih uzroka smrti od raka u svijetu, pogotovo u istočnoj Aziji, navodi se u najnovijem globalnom procjeni objavljenoj u 2011 [1]. Unatoč znatno smanjivanje incidencije GC u većini dijelova svijeta, još uvijek postoji veliki teret iz velikog broja GC slučajeva i smrtnih slučajeva u svijetu. Karcinogeneze GC je vrlo složen proces [2] - [5] koji uključuje deregulacija više gena [6] - [8], uključujući onkogena [9] - [14] i tumorske prigušivači [15] - [18]. Međutim, molekularni mehanizmi koji su potrebni za razvoj i napredovanje GC treba dodatno istražiti.

mikroRNA (miRNAs) su skupina endogeno izrazio, non-kodiranje male RNA (20-25 nukleotida) poznate negativno reguliraju ekspresiju gena potiskivanjem prijevoda ili smanjuje stabilnost mRNA izravno vezati na 3'-netranslatiranu regiju (3'-UTR) ciljne mRNA [19], [20]. Prikupljeni dokazi pokazuju da miRNAs igraju važne uloge u razvoju, metabolizam, staničnu proliferaciju, diferencijaciju i apoptozu. Dodatno, nenormalna nakon regulaciji transkripcije mRNA od miRNAs povezana s tumorogenezom [21]. Nenormalna ekspresija profili miRNAs nađene su u različitim vrstama humanih tumora, što uključuje karcinome pluća [22], dojke [23], prostate [24], jetra [25], kolona [26] i rak želuca [27]. Štoviše, neki miRNAs mogu funkcionirati kao onkogena ili tumorske potiskivača regulira ekspresiju ciljnih gena koji igraju važnu ulogu u napredovanju staničnog ciklusa, apoptoze i proliferacije. miR-22 [28], miR-101 [29] i miR-7 [30] su svi dokazano da downregulated tumorskih uzoraka i funkciji su tumorske potiskivača; miR-17 [31] i miR-21 [32] su pokazali da su doregulirane tumorskih uzoraka i funkciju kao onkogena. Ove studije ukazuju na to da deregulacija miRNAs često je uključen u karcinogeneze i progresiju raka. Pregled

Nedavna istraživanja pokazuju da je Mir-149 može igrati važnu ulogu u raznim bolestima, uključujući i progresiju zloćudnih tumora. Mir-149 pokazano je da djeluje i kao tumor supresor [33] i onkogen [34] u razvoju više vrsta solidnih tumora. Na primjer, gubitak Mir-149 vodi da se dobije funkcije nekih onkogena i korelira sa tumora razred u karcinomu bubrežnih stanica [35], astrocitomi [36], i karcinoma prostate [37]. Ektopično izraz Mir-149 izaziva apoptozu neuroblastoma i HeLa stanicama [33]. Povišena ekspresija Mir-149 je izvijestila da su važni u napredovanju nazofarinksa karcinom [38] i metastaziranje melanoma [34]. Nadalje, deregulacija Mir-149 također je povezana s nekim ne-neoplastičnih bolesti. Na primjer, regulacija Mir-149 izražavanja je uključen u razvoj primarne mijelofibrozom, policitemija vera, i esencijalne trombocitemije [39], te gubitkom Mir-149 može suzbiti virus hepatitisa C (HCV) RNA obilje [40]. Međutim, izraz uzorak i uloga Mir-149 u razvoju GC ostaje nejasno. Pregled

U ovom istraživanju, otkrili smo da Mir-149 je znatno regulirani u staničnim linijama GC i kliničkih uzoraka u odnosu na normalna želučanog epitela stanica i susjedna netumorskih tkiva, respektivno. Ektopično izraz Mir-149 inhibira proliferaciju i inducira G0 /G1 uhićenje AGS i SGC7901 stanice In vitro
ciljajući ZBTB2 pregled. Nadalje, iscrpljivanje ZBTB2 pregled od siRNA rezultira inhibicijom proliferacije i zatvaranje staničnog ciklusa. Način ekspresije Mir-149 i ZBTB2 u staničnim linijama GC i kliničkih uzoraka obrnuto koreliraju, dodatno ukazuje na to da ZBTB2 pregled je ciljni gen od Mir-149. Uvođenje Mir-149 rezultira promjenama u ekspresiji p53, p21, ARF i HDM2, članovi ARF-HDM2-p53-p21 puta što je regulirano ZBTB2. Ukratko, ovi rezultati potvrđuju da je Mir-149 je regulirani u GC stanicama i kliničkih uzoraka i sugeriraju da Mir-149 djeluje kao supresor rasta želučane stanica raka tako da inhibiraju proliferaciju i progresije staničnog ciklusa. Pregled

Rezultati

izražavanje Mir-149 je regulirani u GC stanicama i kliničkih uzoraka

kako procijeniti ulogu Mir-149 u karcinogeneze GC, prvo smo koristili kvantitativne RT-PCR za mjerenje ekspresije mir-149 u humanim GC stanicama (MKN45, GC9811, AGS, SGC7901 i MKN28), te su otkrili da miR-149 se regulirani u staničnim linijama GC usporedbi sa normalnom želučane epitelnih stanica linije, GES-1 (Sl. 1). Posebno, razina ekspresije Mir-149 pozitivno korelirane sa stupnjem diferencijacije GC stanicama. Naime, razina ekspresije Mir-149 u slabo diferencirani staničnih linija, kao što su MKN45, GC9811 i AGS, znatno je niža nego u umjereno i dobro diferencirane stanične linije. Izraz Mir-149 u umjereno diferenciranih stanica, SGC7901, je niža od one u dobro diferenciranih stanica linije, MKN28 (Sl. 1). Pregled

Kako bi se utvrdilo je li razina Mir-149 je također u korelaciji sa stupnjem diferencijacije tumora ispitali smo ekspresiju Mir-149 u 44 ljudskih GC kliničkih uzoraka, uključujući i 13 loše, 16 umjereno i 15 dobro diferencirani uzoraka. Otkrili smo da je ekspresija Mir-149 u želučanim tumora je značajno niža nego u podudarnih normalnih susjedna tkiva (Sl. 1b). Štoviše, izraz Mir-149 u više diferenciranim tumorima bila je veća nego u manje diferenciranim tumorima (slika 1C, F = 65,391, p pregled. ≪ 0,001). Osim toga, smanjena ekspresija Mir-149 korelira s limfnih čvorova metastaza (* p pregled = 0,046) i TNM stadij (** p pregled = 0.0011) (Tablica 1). Pregled

Ectopic izraz Mir-149 inhibira proliferaciju i inducira G0 /G1 uhićenje u AGS i SGC7901 stanice

Kako bi istražili ulogu Mir-149 u GC stanicama, smo iskoristili slabo i umjereno se razlikuju GC stanične linije, AGS i SGC7901, respektivno. AGS i SGC7901 stanice prolazno su transfecirane eithermature miR-149 oponaša, inhibitora lažno transfektirane ili Mir-NC. Kao što je prikazano na slici 2A, 2D, kvantitativni rezultati RT-PCR pokazuju da je ekspresija Mir-149 oponaša ili inhibitora značajno pojačanog ili dodatno regulira ekspresiju Mir-149, odnosno, u AGS i SGC7901 stanice od prvog do petog dana posttransfection (Sl . 2A, F = 8,429, p pregled = 0,003;. sl. 2D, F = 8,595, p pregled = 0,003) u odnosu na NC i lažno kontrola pregled

AGS i SGC7901 stanice transfecirane miR-149 imitatima i inhibitori su pokazali značajno niža i više razine proliferaciju, u odnosu na NC ili lažno skupina određen MTT analize (Slika 2B, F = 27.47, p. < 0,001; Sl. 2e, F = 44,061, p < 0,001). Transfekcija AGS i SGC7901 stanice sa Mir-149 oponaša rezultira značajnim G1 faze uhićenja u odnosu na NC i lažno kontrole ( p izvoznici < 0,05). Nadalje, liječenje Mir-149 inhibitori dovelo do smanjenja broja AGS i SGC7901 stanica u G1 zastoja u usporedbi s NC i lažno kontrole ( p pregled < 0,05). (Slika 2C, F = 134,177 p
< 0,001;. Sl. 2F, F = 58,792, p pregled = 0,003) pregled

ZBTB2 pregled meta Mir-149 Netlogu

Prethodni podaci ukazuju na to da mir-149 može biti supresor rasta GC stanica ciljajući gena koji kontroliraju širenje i napredovanje staničnog ciklusa (33-34) (38). Dakle, tražili smo dodatne potencijalne mete Mir-149 iz TargetScanHuman baze podataka. identificirali smo brojna potencijalne miR-149 ciljnih gena, uključujući ZBTB2 pregled, faktor nabadanje obitelj transkripcija i potentni represor iz ARF-HDM2-p53-p21 puta (41). ZBTB2 pregled je pokazao kako ima mjesta za spajanje navodni Mir-149 u okviru svoje 3'UTR (sl. 3a). Reporterski testovi su izvedeni kako bi provjerili je li ZBTB2 pregled je izravna meta Mir-149 koriste AGS i SGC7901 stanica. Mi kotransficirane AGS i SGC7901 stanice odnosno s psiCHECK-2 vektora koji sadrži bilo 3'UTR za ZBTB2 ili mutirani 3'UTR za ZBTB2 i oponaša Mir-149 ili inhibitora Mir-149. Divljeg tipa i mutanta ZBTB2-3'UTR sadrži pretpostavljenu vezno mjesto Mir-149 su bili klonirani u psiCHECK-2 vektor nizvodno od gena luciferaze (Sl. S1). Uvođenje Mir-149 je značajno smanjio aktivnosti luciferaze iz ZBTB2 3'UTR reporter vektor (Slika 3B-3C, p pregled. ≪ 0,001), ali ne utječe na aktivnost luciferaze iz mutanta ZBTB2-3 'UTR reporter vektor. Ovi podaci ukazuju na to da Mir-149 izravno regulira ZBTB2 pregled razine ekspresije. Nadalje, nema značajnog smanjenja relativne aktivnosti luciferaze u stanicama ko-transfektirane s miR-149 inhibitora ili 3'UTR-ZBTB2 /psiCHECK-2 vektor (Sl. 3B-3C). To je možda zbog nedostatka interakcije između 3'UTR ZBTB2 i endogenih Mir-149, dakle, smanjena Mir-149 ekspresija nije povećala aktivnost luciferaze iz ZBTB2-3'UTR reporter vektor. Ovi rezultati potvrđuju da Mir-149 potiskuje ZBTB2 izraz ciljajući 3'-UTR ZBTB2 pregled mRNA. Pregled

Mir-149 i ZBTB2 izraz negativno korelira u GC stanicama i kliničkim uzorcima

Kako bi se dodatno istražiti odnos između Mir-149 i ZBTB2, ispitali smo ekspresiju ZBTB2 u GC stanicama pomoću western upijanja i GC tkiva pomoću imunohistokemije. Nađeno je da GC stanice imaju znatno višu razinu ekspresije ZBTB2 od normalne želučane epitelnih stanica, GES-1 (Slika 4A a-b F = 167,843 p pregled. ≪ 0,001). ZBTB2 izraz negativnoj korelaciji sa stupnjem diferencijacije GC stanica; slabo diferencirani GC tkiva pokazali značajno višu razinu ekspresije ZBTB2 nego dobro diferenciranim GC tkiva i podudarnih normalnih želučanog tkiva (Slika S2A-B, F = 117,280, p pregled. < 0,001). ZBTB2 pregled razine ekspresije mRNA su podudara s udjelom proteina (slika 4B a, F = 283,355, p pregled. ≪ 0,001). Nadalje, izraz Mir-149 i ZBTB2 je obrnuto proporcionalna (Sl. 4B b, p pregled = 0,033, R = -0,908). Zatim smo mjerili razine ekspresije Mir-149 i ZBTB2 pregled korištenjem kvantitativne RT-PCR u 5 staničnim linijama GC (MKN45, GC9811, AGS, SGC7901 i MKN28) (Sl. 4C a) i 18 GC klinički uzorci (6 slabo, 6 umjereno, i 6 dobro diferencirani uzoraka) (Sl. 4C b). Rezultati potvrđuju da je razina mRNA u ZBTB2
negativno korelira s Mir-149 izražavanja (Sl 4C a, p pregled = 0,033, R = -0,847;. Sl. 4C b, p pregled i 0,001, R = -0,908). Štoviše, AGS (Sl. 4D) i SGC7901 stanica (sl. 4E), transficiranih miR-149 oponaša značajno se smanjio ekspresiju ZBTB2 na razini proteina (ploča a-b) i mRNA (ploča C) u odnosu na mock ili NC stanica ( p pregled < 0,001). Naši rezultati pokazuju da je Mir-149 može se izravno regulira ekspresiju ZBTB2 pregled. Pregled

Mir-149 potiskuje GC proliferaciju stanica i progresiju staničnog ciklusa ciljajući ZBTB2

Dalje smo potvrdili da je mir-149-posredovane inhibicije proliferacije i izazivanje staničnog ciklusa u GC stanicama zahtijeva ciljanje ZBTB2 pregled. ZBTB2 pregled, ekspresija je pokucao dolje pomoću siRNA u AGS i SGC7901 stanica. Western blot analizom (Sl. 5A, a-c) i kvantitativna analiza PCR je pokazala da iscrpljivanje ZBTB2 pregled od siRNA transfekcije mogu se znatno kompenzira miR-149 inhibitora i značajno povećanje ZBTB2 viđena u stanicama koje su transfektirane s mir-149 inhibitori (slika 5B, p pregled. < 0,001). MTT analiza pokazuje da je proliferacija stanica transficiranih siRNA-ZBTB2 je potisnuti i proliferaciju stanica transficiranih miR-149 inhibitori porastao značajno u usporedbi sa stanicama presječenim samo sa siRNA-NC (kontrola) i siRNA-ZBTB2 + Mir-149 (Sl. 5C ). Nadalje, inhibicija ZBTB2 pregled izraz potiče G0 /G1 uhićenje i potiskuje zaustavljanje staničnog ciklusa G0 /G1 izazvano Mir-149 liječenju inhibitora u AGS i SGC7901 stanica u usporedbi s kontrolnim stanicama NC (Sl. 5D-5E, p pregled < 0,001). Naši rezultati ukazuju na to da Mir-149 inhibira proliferaciju GC stanica i progresiju staničnog ciklusa inhibirajući ZBTB2 pregled izraz. Pregled

Uvođenje Mir-149 promijenio izraz ZBTB2 i stanični ciklus vezane proteine ​​

ZBTB2 je izvijestila da je potentni represor od ARF-HDM2-p53-p21 puta, što je važno u regulaciji staničnog ciklusa (41). Da bi istražili reguliranje ovih proteina po Mir-149 u GC stanice, transficirane smo AGS i SGC7901 stanice s Mir-149 oponaša ili Mir-NC i izvodi RT-PCR i Western blot-analize za ZBTB2 ciljnih gena. Kao što je prikazano na slikama 6A-6B, izvanmaternične izraz Mir-149 downregulates ekspresiju ZBTB i HDM2 i regulira povišenje ekspresije ARF, p53 i p21 ( p izvoznici < 0,001). Ovi podaci su u skladu s funkcijom ZBTB2 u suzbijanju transkripciju ARF, p53 i p21 i aktivira ekspresiju HDM2 (41). Štoviše, ektopijska ekspresija ZBTB2 transfekcijom obrnuo miR-149-posredovane smanjenje HDM2, naznačen time ekspresiju i rast ARF, p53 i p21 ekspresiju u AGS i SGC7901 stanice (Sl. 6A-B). . Ektopično ZBTB2 ekspresija je potvrđeno u transficiranim AGS i SGC7901 stanicama (Slika S3 SGC7901 stanice, F = 806,365 p pregled i 0,001; AGS stanica, F = 1436,300, p pregled < 0,001). ARF, p53 i p21 promovirati progresije staničnog ciklusa, dakle, njihov downregulation ekspresijom Mir-149 oponaša objašnjava faze uhićenja G0 /G1 u AGS i SGC7901 stanice. Pregled

Rasprava pregled

Sve više dokaza upućuje na to da miRNAs igraju ključnu ulogu u procesu karcinogeneze i raka progresije [21]. Promijenjene razine ekspresije Mirni su uključene u inicijaciju i razvoja tumora; modulacija miRNAs koji funkcioniraju kao negativni regulatori onkogena ili tumorskih prigušivači rezultate u promicanju proliferaciju stanica raka i rast [28] - [32]. Prethodna istraživanja su pokazala da je uloga Mir-149 u napredovanje različitih vrsta tumora kontroverzna [33] - [36], [38]. Način ekspresije i ciljevi Mir-149 variraju u različitim vrstama tumora. Mir-149 je izraz regulirani u nekim tumorima, koji funkcionira kao supresor tumora ciljajući onkogena u nekih vrsta raka. Na primjer, u čistom karcinom stanica bubrega miR-149 je podreguliran i njegovi vjerojatne mete su identificirani kao KCNMA1 i LOX (35). Nadalje, miR-149 također regulirani u stanica glioblastoma, te je predloženo da djeluje kao tumor-supresor ciljajući RAP1B, CD47, CCN1 i NXF1 [36]. Nasuprot tome, Mir-149 također može djelovati kao supresor tumora ciljajući određene onkogena. Otkrivanje Mirna profile ekspresije u različitim kliničkim fazama nazofarinksa karcinom (NPC) i NPC limfnih čvorova metastaze pokazuje da je izraz Mir-149 je reguliran u NPC-i izraz njegovog ciljanog gena, Smad2 pregled, se smanjuje s napredovanje NPC [38]. Sličan onkogeni uloga Mir-149 je također viđen u melanom u kojem uzlazni Mir-149 izaziva downregulation GSK3P-a i ranijim koracima MCL-1, što je rezultiralo u apoptoze otpora [34]. Do sada, malo se zna o ulozi Mir-149 kod raka želuca. Ovdje, izvješćuju smo da miR-149 ekspresija značajno smanjena u višestrukim želučanim staničnih linija raka i kliničkih uzoraka u usporedbi s normalnim želučanog epitelnih stanica i podudarne susjedna normalnog tkiva, respektivno. Važno je da se razina miR-149 ekspresija je povezana sa stupnjem diferencijacije GC stanica i uzoraka; slabo diferencirane GC stanice ili primjerci imaju niži Mir-149 izraza u odnosu na dobro diferenciranih uzoraka. Ektopično izraz Mir-149 inhibira proliferaciju stanica i progresiju staničnog ciklusa ciljajući ZBTB2 pregled u AGS i SGC7901 stanica. Mir-149 i ZBTB2 izraz u negativnoj korelaciji u GC stanicama i kliničkih uzoraka, te pojačanom ekspresijom Mir-149 izaziva downregulation ZBTB2 pregled. Iscrpljivanje ZBTB2 rezultira inhibicijom AGS i SGC7901 stanica proliferacije i napredovanja staničnog ciklusa. Zajedno, ovi rezultati pokazuju, po prvi put, da ZBTB2 mogu funkcionirati kao onkogena u nastanku tumora i raka želuca. Pregled

Naši podaci pokazuju da se uvođenje Mir-149 u GC stanicama inducira staničnog ciklusa, što upućuje kako mir-149 ciljevi mogle biti uključene u regulaciju staničnog ciklusa. ZBTB2 je Pok obitelji transkripcijski faktor koji može suzbiti ARF-HDM2-p53-P21 put [41]. ARF, tumor supresor [42] može se inducirati produljeno mitogene stimulacije i igra ključnu ulogu u aktiviranju p53 samostalno i kontrolu stabilnost p53 putem interakcije s HDM2 [43], što je važan regulator p53. Tumor supresor p53 igra kritičnu ulogu u održavanju homeostaze kroz stanične inducira staničnog ciklusa i apoptoze kada se stanice podvrgnute stresa, kao što su hipoksija, oštećenja DNA, te telomera disfunkcija [44]. p21, ciljani gen p53, posreduje staničnog ciklusa u fazi G1 zaustavljanje vezanjem i inhibirati djelovanje ciklin-CDK2 ili kompleksa CDK1 [45]. ZBTB2 može potisnuti transkripciju ARF, p53 i p21, i potiču hdm2 izraza [41]. Da biste provjerili jesu li učinci staničnog ciklusa potaknute Mir-149 izražavanja je posredovana ZBTB2 gubitka, ispitali smo ekspresiju HDM2, naznačen time, ARF, p53 i p21 u AGS i SGC7901 stanicama zaraženim s Mir-149 oponaša. otkrili smo da ektopijska ekspresija miR-149 rezultira u povećanom ekspresijom ARF, p53 i p21, a smanjena ekspresija HDM2 i ZBTB2. Ovi rezultati podupiru ideju da Mir-149 pokazuje svoju ulogu inhibiciju proliferacije GC stanica i progresiju staničnog ciklusa ciljajući ZBTB2 pregled time modulirati ekspresiju nizvodne regulatora progresije staničnog ciklusa. Pregled

U sažetku Naši podaci pokazuju da je mir-149 može funkcionirati kao supresor tumora kod želučanih stanica raka i igra važnu ulogu u inhibiciji ZBTB2 pregled. Stoga, regulacija od Mir-149 potiče proliferaciju GC stanica i progresije staničnog ciklusa. Osim toga, naši rezultati pokazuju da ZBTB2 može funkcionirati kao onkogena u razvoju raka želuca. Međutim, s obzirom na činjenicu da je svaka Mirna mogu regulirati mnoge ciljne gene koji mogu utjecati na karcinogeneze na različite načine, više studije su potrebne istražiti druge Mir-149 ciljeve koje mogu imati kritičnu ulogu u GC nastanku tumora. Ova studija također pruža novi uvid u ulogu Mir-149 u ljudskoj progresije raka želuca i ukazuje da je Mir-149 može poslužiti kao terapijski cilj za želučane liječenja raka. Pregled

Materijali i metode pregled

etika Izjava pregled

Za uzorke tkiva, pismeni informirani pristanak dobiven je od pacijenata. Postupci koji se koriste u ovom istraživanju su odobreni od strane Institutional Review Board of Vojnomedicinsku Sveučilišta Četvrte i bio je uskladiti s Helsinškom deklaracijom i lokalnim propisima. Pregled

Stanične linije i uvjeti uzgoja

želuca linije raka AGS, MKN28, MKN45 su kupili od AGCC i GC9811 i SGC7901 stanične linije dobivene su iz Beijing Institute of Oncology. Sve stanične linije su održavane u našem Institutu prema preporučenim protokolima. Stanice su kultivirane u RPMI-1640 mediju (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), uz dodatak 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS) (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) na 37 ° C u CO s 5% _{2 inkubatoru . pregled}

ljudskih jedinki

Svi eksperimentalni postupci su odobreni od strane Institutional Review Board of Vojnomedicinsku Sveučilišta Četvrte. Pismeni informirani pristanak dobiven je za sve pacijenta samples.Human uzoraka raka želuca (n = 44) i odgovarajuće susjedne ne-tumorske uzoraka dobiveni su od pacijenata na Xijing bolnici bolesti probavnog sustava, četvrti Military Medical University, uz informirani pristanak od svakog pacijenta.

pročišćavanje RNA, za sintezu cDNA, i kvantitativna real-time PCR (QRT-PCR) pregled

Ukupna RNA kultiviranim stanicama se ekstrahira Trizol reagensa (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) sukladno protokol i RNA proizvođača pohranjeni su na -80 ° C prije QRT-PCR analize. Zreli Mir-149 je detektirana pomoću mirVana TM QRT-PCR za detekciju Kit Mirna (Ambion Inc. Austin, Texas), s U6 kao interna kontrola. ZBTB2 je detektirana s prajmerima F: 5'ACTCGGGCGAGATCCACGGC 3 ', R: 5' 3 'ACGCAGGCTGCTCATCGGAG i GAPDH korištena je kao interna kontrola. PCR proizvodi su razdvojeni na etidij 1,5% agaroznom gelu bromid umrljan i prikazan s UV. Pregled

Cell transfekcija pregled

Ljudski Mir-149 duplex oponašati i inhibitor (Mir-149) i negativna kontrola oligonukleotid duplex mimic (mir-NC) su dizajnirani i daje Ribobio (Guangzhou, Guangdong, Kina). Mala interferirajuća RNA (siRNA) za ZBTB2 i negativna kontrola RNA (siRNA-NC) su sintetizirani i pročisti Genepharma (Shanghai, Kina). miRNAs, siRNA i ZBTB2 cDNA plazmid (FulenGen Co Kina) transfektirane su LipofectamineTM 2000 reagensa (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) u skladu s uputama proizvođača. ZBTB2 siRNA slijed: F: 5 'GCUGGCUUCUUUCCAAGUU dTdT 3', R: 5 'AACUUGGAAAGAAGCCAGC 3'; NC siRNA slijed: F: 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT -3 ', R: 5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT -3' pregled

Mirna meta predviđanje pregled

Da bi pronašli potencijalne Mirna ciljnih gena, TargetScanHuman web stranice (. http://www.targetscan.org/) se koristi, je izračunata vezanje slobodna energija i obvezujući stranice su analizirani pomoću http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid~~HEAD=dobj web stranice. pregled

Vektorski gradi i reporter luciferaze pregled

Da bi se stvorio ZBTB2-3'UTR plazmida, divljeg tipa 3'-UTR fragment ljudskog ZBTB2 mRNA (1238-1244 nt, pristupanje GenBank br. NM_020861.1) sadrži potencijalni miR-7 vezanja slijed umnožen je pomoću RT-PCR i kloniran u mjestu između Xho i i Not i nizvodno od reporterskog gena od psiCHECK ™ vektor (Promega, USA). Mutant jedinstvenog Mir-7 veznih mjesta (5'GAGCCAG-3 '5'ACCGCGC-3') u 3 'UTR od ZBTB2 je uključena po ciljanom mutagenezom Kit (SBS Genetech, Peking, Kina ). Divlji i mutirani vrste pmirGLO-ZBTB2-UTR vektora je potvrđena sekvenciranjem DNA pregled

Nukleotidne sekvencije primera za ZBTB2-3'UTR (MT) klona. MutZBTB2F: 5'GGCCTCACAAGACAAAACAGACCGCGCAAGTAAGGACTGAAGGAGAA 3 'mutZBTB2R: 5' TTCTCCTTCAGTCCTTACTTGCGCGGTCTGTTTTGTCTTGTGAGGCC 3 'pregled

Nukleotidne sekvencije primera za ZBTB2-3'UTR (WT) klona: ZBTB2XhoIF: 5'CCGCTCGAG ATGTCACTTATCTTTTTAAAAAACTCTCA 3' ZBTB2NotIR: 5'ATAAGAATGCGGCCGC TACTCATTTAATTAAACGTTTATTC 3 'ZBTB2XhoIF2: 5'CCGCTCGAGATGTCACTTATCTTTTTAAAAAACTCTCATTTTTACAAAGACTATC 3' ZBTB2F3: 5'CCGCTCGAG CTGTAGTTCTCCATGGCATGATAC 3 '. pregled

Stanice su transficirane Mir-149 oponaša, NC i pmirGLO plazmida u 24 jažica pomoću lipofektamina ™ 2000 (Invitrogen) prema uputama. 48 sati kasnije, stanice su sakupljene i analizirane na aktivnost luciferaze korištenjem Dual-Luciferase reporter Assay System (Promega, SAD), te detektirati sustav GloMaxTM 20/20 detekcije (E5331, Promega). Pregled

Western blotting

Ukupni proteini iz stanica u kulturi su lizirane Lysis Pufer koji je sadržavao PMSF na ledu. Zatim protein se elektroforezi u 12% SDS poliakrilamidnim gelovima i zatim su prenesene na PVDF membranu (Millipore). Membrane su blokirane u 5% bezmasnim mlijekom u prahu, na sobnoj temperaturi 1 sat i inkubirano preko noći sa primarnim antitijelima. Membrane su inkubirane sa sekundarnim antitijelima obilježenim s HRP tijekom 1 sata na sobnoj temperaturi, tri puta po 10 min ispiranja u TBS-T (triethanolaminebuffered fiziološka otopina s Tween). Konačno, signali su detektirani pomoću ECL kita (Pierce Biotech., Rockford, IL, USA) i membrane su skenirani i analizirani pomoću Bio-Rad ChemiDoc XRS + Imaging sustav sa slike (verzija količina 1). Ekspresija proteina se normalizira na endogeni referenca (aktin) i u odnosu na kontrolu. Spektara višebojni širokog raspona protein ljestve (Fermentas) je korišten kao molekularni marker. Svi antitijela se koriste u Western blot analizi su navedeni u tablici S1. Pregled

imunohistokemija i Imunohistokemijska bodovanja pregled

Parafinski rezovi, 4 um debljine, su pečeni 2 sata na 65 ° C i deparafmizirani , Antigen dohvat je izvedena korištenjem citratnog natrij pufera (pH 7.2) na 95 ° C tijekom 15 minuta, a zatim su ohlađeni stakalca na sobnoj temperaturi 30 minuta. Poslije tretmana sa 3% -tnim vodikovim peroksidom na 15 minuta da se blokira endogene peroksidaze, sekcije su tretirani s normalnim kozjim serumom graničnim tekućina tijekom 30 minuta kako bi se smanjilo nespecifično vezanje i zečje poliklonalno anti-ZBTB2 (1:500, BIOS Co , Kina) se inkubira u odjeljcima 12 sata na 4 ° C.After rewarming tijekom 1 sata i pranje za 5 puta, sekcije su inkubirane s sekundarnih antitijela tijekom 30 minuta na sobnoj temperaturi. Diaminobenzidinu (DAB) se koriste za reakcije u boji. Naknadno imunohistokemijski bojanje je zabio kao što je ranije opisano [46]. Pregled

MTT test pregled

Stanice su transficirane s 100 nM Mir-149 inhibitora (Genepharma, Shanghai, Kina), oponaša (Ribobio, Guangzhou, Guangdong, Kina) i 100 nM siRNA ZBTB2 (Genepharma) .Twenty četiri dana kasnije, stanice su posađene u pločice s 96 jamica (2 x 103 /jamica). Vitalnost stanica je ispitana MTT (3-2, 5-difenil-tetrazolij-bromid) metodom (Sigma, SAD) na dan tijekom 6 dana. Pregled

staničnog ciklusa analiza protočnom citometrijom

rak želuca stanične linije AGS i SGC7901 su uzgojene u RPMI-1640 mediju (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) s dodatkom 10% FBS na ploče sa 6 jažica. Transfekcija je provedena kada stanice dosegla 80 %% - 90% pokrivenosti. Nakon toga, stanice su sakupljene, isprane dva puta sa PBS i fiksirane u 70% etanolu pri 4 ° C preko noći. Zatim su stanice inkubirane s propidij jodidom pri sobnoj temperaturi 1 h i analizirane su protočnom citometrijom pomoću FACScan protočnim citometrom (BD Biosciences, Mountain View, CA). Ti podaci su analizirani pomoću FlowJo (FlowJo). Pregled

Statistička analiza pregled

Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± SEM od tri neovisna pokusa. Za statističke testove, SPSS statistički softver paket, version17.0 (SPSS, Chicago, IL, SAD) je bio korišten. U t-test je jednosmjerna ANOVA i dvosmjerna ANOVA test je za MTT testom, kvantitativna PCR i rast tumora krivulje. Korelacija između Mir-149 i ZBTB2 analizirana s Spearmanov rang korelacije. P vrijednosti 0,05 smatrane su statistički značajne pregled

popratne podatke pregled Slika S1.. pregled divljeg tipa i mutirane ZBTB2 pregled -3'UTR sadrži pretpostavljenu vezno mjesto Mir-149 su bili klonirani u psiCHECK-2 vektora. A. ZBTB2 pregled -3'UTR se pojačava iz genomske DNA AGS. B. Lane 1,3, 5: rekombinantni plazmidi iz ZBTB2-1, ZBTB2-2, ZBTB2-3 pregled redom; lane 2.4.6: Rezultati enzimima rekombinantnih plazmida ZBTB2-1, ZBTB2-2, ZBTB2-3 Netlogu respektivno. Rezultati su pokazali da je ZBTB2 pregled -1/2/3 uspješno su umetnute u vektorima (M1. DL2000 DNA markera, M2: DL1 kb DNA markera; ZTBT2-1 /2/3 bendovi: 1406 bp; vektori bendovi: 6.1 kb). C. M1: 1 kb DNA Ladder Marker. Linija 1: pojačanje Mut ZBTB2 pregled F1 /R1 (negativna kontrola bez Taq enzima); Linija 2: pojačanje Mut ZBTB2 pregled F1 /R1. Jedan bend Mut ZBTB2 pregled (7,6 Kb) pokazao uspješnim PCR mutanta pojačanja. D. sekvenciranja rezultati tež ZBTB2
i MT - ZBTB2
doi:. 10,1371 /journal.pone.0041693.s001 pregled (TIF) pregled slika S2 , pregled ZBTB2 izraz u ljudskim uzorcima rak želuca i odgovarajuće susjedne normalnog tkiva. A. Reprezentativne slike prikazane su pozitivni Imunohistokemijsko bojenje ZBTB2 u humanim uzorcima rak želuca (b-c) i odgovarajuće susjedna normalnim tkivima (a) (povećanje 200 ×). B. Imunokemijsko bojenje je ocijenjen kao što je opisano [46]; Statistička analiza podataka o ZBTB2 izražavanja razlike između ljudskih jedinki rak želuca i odgovarajuće susjedne non-kancerogen tkiva (jednosmjerna ANOVA analize, F = 117,280, *** p izvoznici < 0,001). pregled