PLOS ONE: microARN-149 inhibe la proliferación y la progresión del ciclo celular a través de la focalización de ZBTB2 en gástrico humano Cancer

Extracto

Un creciente cuerpo de evidencia indica que el miR-149 se puede suprimir tanto y promover el crecimiento del tumor en función de el tipo de tumor. Sin embargo, se desconoce la función de miR-149 en la progresión del cáncer gástrico (GC). Aquí mostramos que el miR-149 es un supresor tumoral en el cáncer gástrico humano. la expresión de miR-149 se reduce en las líneas celulares y muestras clínicas GC en comparación con las células epiteliales gástricas normales y tejidos, respectivamente. Los niveles de expresión de miR-149 también se correlacionan con el grado de diferenciación de las células de GC y tejidos. Por otra parte, la expresión ectópica de miR-149 en células de cáncer gástrico inhibe la proliferación y la progresión del ciclo celular mediante la regulación negativa de ZBTB2
, un potente represor de la vía de la FRA-HDM2-p53-p21, con un potencial sitio de unión para miR-149 en 3'UTR de su ARNm. También se encuentra que la expresión ZBTB2 aumentos en las células y tejidos de GC en comparación con las células normales gástrico tejidos epiteliales y, respectivamente. El silenciamiento de ZBTB2
conduce a la supresión del crecimiento celular y la detención del ciclo celular en la fase G0 /G1, lo que indica que ZBTB2 puede actuar como un oncogén en GC. Por otra parte, la transfección de miR-149 imita a las células de cáncer gástrico induce la baja regulación de ZBTB2 y HDM2, y sobre regulación de la IRA, p53, p21 y en comparación con los controles. En resumen, nuestros datos sugieren que el miR-149 funciona como un supresor tumoral en el cáncer gástrico humano por, al menos parcialmente, a través, de orientación ZBTB2

Visto:. Wang Y, X Zheng, Zhang Z, Zhou J, Zhao G, Yang J, et al. (2012) microARN-149 inhibe la proliferación y la progresión del ciclo celular a través de la focalización de los ZBTB2
en el cáncer gástrico humano. PLoS ONE 7 (10): e41693. doi: 10.1371 /journal.pone.0041693

Editor: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Estados Unidos de América

Recibido: 13 Marzo, 2012; Aceptado: 25 Junio ​​2012; Publicado: 29 de octubre 2012

Derechos de Autor © 2012 Wang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación de Ciencias Naturales Nacional de China (no. 30872966 y no. 31071135), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (n. ° 81.000.864, no. 81172290, no. 91129723, no. 81090270, y no. 81090273) y la Fundación de Ciencias de china Postdoctoral (n. ° 20100471776). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

el cáncer gástrico (CG) es uno de los cánceres más comunes y las principales causas de muerte por cáncer en todo el mundo, especialmente en Asia Oriental, según la última estimación mundial publicado en 2011 [1]. A pesar de una notable disminución en la incidencia de GC en la mayoría de las partes del mundo, todavía hay una gran carga de la gran cantidad de casos de CG y las muertes en todo el mundo. La carcinogénesis de GC es un proceso muy complicado [2] - [5] que implica la desregulación de múltiples genes [6] - [8], incluyendo oncogenes [9] - [14] y tumorales supresores de [15] - [18]. Sin embargo, los mecanismos moleculares necesarios para el desarrollo y la progresión de GC deben estudiarse con mayor detalle.

Los microARN (miRNA) son un grupo de forma endógena expresó, no codificante ARN pequeños (20-25 nucleótidos de longitud) que se sabe que forma negativa regular la expresión génica mediante la supresión de la traducción o la disminución de la estabilidad de los ARNm mediante la unión directamente a la región 3 'no traducida (3'-UTR) del ARNm diana [19], [20]. La acumulación de pruebas indica que miRNAs juegan un papel importante en el desarrollo, el metabolismo, la proliferación, diferenciación y apoptosis. Además, la regulación post-transcripcional aberrante de ARNm por miRNAs está relacionado con la tumorigénesis [21]. los perfiles de expresión anormales de miRNAs se han detectado en varios tipos de tumores humanos, incluyendo de pulmón [22], de mama [23], de próstata [24], el hígado [25], colon [26], y el cáncer gástrico [27]. Por otra parte, algunos miRNAs pueden funcionar como oncogenes o supresores de tumores mediante la regulación de la expresión de genes diana que desempeñan papeles importantes en la progresión del ciclo celular, apoptosis, o la proliferación. miR-22 [28], el miR-101 [29], y miR-7 [30], han demostrado ser downregulated en muestras de tumores y funcionan como supresores de tumores; miR-17 [31] y miR-21 [32] han demostrado ser upregulated en muestras de tumores y funcionan como oncogenes. Estos estudios indican que la desregulación de miRNAs participa con frecuencia en la carcinogénesis y la progresión del cáncer.

Estudios recientes han sugerido que miR-149 puede desempeñar un papel importante en varias enfermedades, incluyendo la progresión de tumores malignos. miR-149 se ha demostrado que funcionar como un supresor de tumores [33] y un oncogén [34] en el desarrollo de múltiples tipos de tumores sólidos. Por ejemplo, la pérdida de miR-149 conduce a la ganancia de función de algunos oncogenes y se correlacionan con el grado tumoral en carcinoma de células renales [35], astrocitomas [36], y el carcinoma de próstata [37]. La expresión ectópica de miR-149 induce la apoptosis de neuroblastoma y células HeLa [33]. La expresión elevada de miR-149 se ha informado que es importante en la progresión del carcinoma nasofaríngeo [38] y el melanoma metástasis [34]. Por otra parte, la desregulación de miR-149 también está implicado en algunas enfermedades no neoplásicas. Por ejemplo, la regulación por disminución de la expresión de miR-149 está implicado en el desarrollo de la mielofibrosis primaria, policitemia vera, trombocitemia esencial y [39], y la pérdida de miR-149 puede suprimir el virus de la hepatitis C (VHC) la abundancia de ARN [40]. Sin embargo, el patrón de expresión y el papel de miR-149 en el desarrollo de GC sigue siendo poco clara.

En el presente estudio, se encontró que el miR-149 es significativamente downregulated en líneas celulares y muestras clínicas GC en comparación con el normal de las células gástrico tejidos epiteliales y no tumorales adyacentes, respectivamente. La expresión ectópica de miR-149 inhibe la proliferación e induce la detención G0 /G1 del AGS y SGC7901 células in vitro fotos: por la orientación ZBTB2
. Por otra parte, el agotamiento de los ZBTB2 fotos: por siRNA resultados en la inhibición de la proliferación y la detención del ciclo celular. El patrón de expresión de miR-149 y ZBTB2 en líneas celulares y muestras clínicas de GC, se correlacionó inversamente, lo que sugiere, además, que ZBTB2
es un gen diana de miR-149. Introducción de miR-149 resulta en alteraciones en la expresión de p53, p21, ARF, y HDM2, miembros de la vía ARF-HDM2-p53-p21 que está regulada por ZBTB2. En resumen, estos resultados confirman que el miR-149 está regulado por disminución en las células de GC y muestras clínicas y sugieren que el miR-149 funciona como un supresor del crecimiento de células de cáncer gástrico mediante la inhibición de la proliferación y la progresión del ciclo celular.

la expresión de miR-149 es downregulated en líneas celulares de GC y muestras clínicas

para evaluar el papel de miR-149 en la carcinogénesis de GC, que utilizó por primera vez RT-PCR cuantitativa para medir la expresión de miR-149 en las líneas celulares GC humanos (MKN45, GC9811, AGS, SGC7901, y MKN28) y se encontró que el miR-149 se downregulated en líneas celulares de GC en comparación con una línea celular epitelial gástrica normal, GES-1 (fig. 1A). En particular, el nivel de expresión de miR-149 se correlacionó positivamente con el grado de diferenciación de las células de GC. Es decir, el nivel de expresión de las líneas celulares en pobremente diferenciados, tales como MKN45, GC9811, y AGS miR-149, es significativamente menor que en líneas celulares bien diferenciados moderadamente y. La expresión de miR-149 en células moderadamente diferenciados, SGC7901, es menor que en la línea celular bien diferenciado, MKN28 (fig. 1A).

Con el fin de determinar si los niveles de miR-149 también se correlacionan con el grado de diferenciación de los tumores se analizó la expresión de miR-149 en 44 muestras clínicas GC humanos, incluyendo 13 pobremente, moderadamente 16, y 15 muestras bien diferenciadas. Hemos encontrado que la expresión de miR-149 en tumores gástricos es notablemente menor que en los tejidos adyacentes normales de la misma (Fig. 1B). Por otra parte, la expresión de miR-149 en los tumores más diferenciados fue mayor que en los tumores menos diferenciados (Fig 1C, F = 65,391, p
. ≪ 0,001). Además, disminuyó la expresión de miR-149 se correlaciona con metástasis en los ganglios linfáticos (* p = 0,046
) y el estadio TNM (** p = 0,0011
) (Tabla 1).

la expresión ectópica de miR-149 inhibe la proliferación e induce la detención G0 /G1 en AGS y SGC7901 células

líneas celulares GC Para investigar el papel de miR-149 en células de GC, se utilizó poco diferenciados y moderadamente, AGS y SGC7901, respectivamente. AGS y SGC7901 células fueron transfectadas transitoriamente con eithermature miR-149 imita, inhibidor, falsamente transfectadas, o miR-NC. Como se muestra en la figura 2A, 2D, cuantitativos RT-PCR resultados muestran que la expresión de miR-149 imita o inhibidores upregulate significativamente o regular a la baja la expresión de miR-149, respectivamente, en AGS y SGC7901 células de la primera-quinta después de la transfección día (Fig . 2A, F = 8,429, p = 0,003
;. La Fig. 2D, F = 8,595, p
= 0,003) en comparación con NC y controles simulados

AGS y células SGC7901 transfectadas con miR-149 imita e inhibidores mostraron mayores niveles de proliferación celular significativamente menor y, respectivamente, que la NC o grupos simulados como se determina mediante el ensayo de MTT (Fig 2B, F = 27,47, p <. 0.001; Fig. 2E, F = 44,061, p < 0,001). La transfección de células AGS y SGC7901 con miR-149 imita los resultados en la fase de detención G1 significativa en comparación con NC y controles falsos ( p Hotel < 0,05). Por otra parte, el tratamiento con inhibidores de miR-149 dio lugar a un menor número de AGS y SGC7901 células en G1 detención respecto al CN y controles simulados ( p Hotel < 0,05) (Fig. 2C, F = 134.177, p
< 0,001;. la Fig. 2F, F = 58,792, p = 0,003
)

ZBTB2
es un objetivo de miR-149

los datos anteriores sugieren que miR-149 podría ser un supresor del crecimiento celular por la orientación GC genes que controlan la proliferación y la progresión del ciclo celular (33 a 34) (38). Por lo tanto, se realizaron búsquedas de posibles objetivos adicionales de miR-149 de la base de datos TargetScanHuman. Se identificaron numerosos genes diana potenciales miR-149, incluyendo ZBTB2
, un factor de transcripción de la familia POK y potente represor de la vía de ARF-HDM2-p53-p21 (41). ZBTB2
se encontró que tenía supuestos sitios de unión de miR-149 se encuentren en su 3'UTR (Fig. 3A). Se llevaron a cabo ensayos de reportero de luciferasa para verificar si ZBTB2
es un objetivo directo de miR-149 utilizando AGS y SGC7901 células. Nos co-transfectadas AGS y SGC7901 células, respectivamente, con un vector psiCHECK-2 que contiene ya sea 3'UTR de ZBTB2 o mutado 3'UTR de ZBTB2, e imita de miR-149 o inhibidores de miR-149. De tipo salvaje y mutante ZBTB2-3'UTR que contiene el supuesto sitio de unión de miR-149 se clonaron en psiCHECK-2 vector aguas abajo del gen de la luciferasa (Fig. S1). Introducción de miR-149 redujo significativamente la actividad de la luciferasa a partir del vector reportero ZBTB2 3'UTR (Fig 3B-3C, p
. ≪ 0,001), pero no afectó a la actividad de la luciferasa de la ZBTB2-3 mutante 'UTR vector indicador. Estos datos sugieren que el miR-149 regula directamente ZBTB2
niveles de expresión. Además, no hay una disminución significativa en la actividad luciferasa relativa en las células co-transfectadas con miR-149 inhibidor o 3'UTR-ZBTB2 /psiCHECK-2 vector (Fig. 3B-3C). Es tal vez debido a la falta de interacción entre 3'UTR de ZBTB2 y endógeno miR-149, por lo tanto, la disminución de la expresión de miR-149 no aumentó la actividad de luciferasa a partir del vector reportero ZBTB2-3'UTR. Estos resultados confirman además que el miR-149 suprime la expresión ZBTB2 apuntando a la 3'-UTR de ZBTB2
ARNm.

miR-149 y expresión ZBTB2 se correlaciona negativamente en las células de GC y muestras clínicas

Para investigar más a fondo la relación entre el miR-149 y ZBTB2, se analizó la expresión de ZBTB2 en las células de GC utilizando el Western Blot y en los tejidos de GC mediante inmunohistoquímica. Se encontró que las células GC tienen significativamente más alto nivel de expresión de ZBTB2 que la célula epitelial gástrica normal, GES-1 (Fig 4A a-b F = 167.843, p
. ≪ 0,001). expresión ZBTB2 negativamente correlacionada con el grado de diferenciación de las células de GC; pobremente diferenciados tejidos GC mostraron un nivel de expresión ZBTB2 significativamente mayor que los tejidos GC bien diferenciadas y emparejaron los tejidos gástricos normales (Figura S2A-B, F = 117.280, p
. < 0,001). ZBTB2
los niveles de expresión de ARNm son coincidentes con los niveles de proteína (Fig 4B a, F = 283.355, p
. ≪ 0,001). Por otra parte, la expresión de miR-149 y ZBTB2 se correlaciona inversamente (Fig. 4B b, p = 0,033
, R = -0,908). A continuación, medir los niveles de expresión de miR-149 y ZBTB2
mediante RT-PCR cuantitativa en 5 líneas de células GC (MKN45, GC9811, AGS, SGC7901, y MKN28) (Fig. 4C a) y 18 GC clínica muestras (6 pobremente, moderadamente 6, y 6 muestras bien diferenciadas) (Fig. 4C b). Los resultados confirman que el nivel de mRNA de ZBTB2
se correlaciona negativamente con la expresión de miR-149 (Figura 4C un p = 0,033
, R = -0,847;. La Fig. 4C b, p Hotel < 0,001, R = -0,908). Por otra parte, AGS (Fig. 4D) y SGC7901 células (Fig. 4E) transfectadas con miR-149 imita haber disminuido significativamente la expresión de ZBTB2 en los niveles de proteína (paneles A-B) y los niveles de mRNA (panel c) en comparación con mock o NC células ( p Hotel < 0,001). Nuestros hallazgos indican que el miR-149 se puede regular directamente la expresión de ZBTB2
.

miR-149 suprime GC proliferación celular y la progresión del ciclo celular por la orientación ZBTB2

a continuación se confirmó que el miR-149 mediada por la inhibición de la proliferación y la inducción de la detención del ciclo celular en las células GC requiere la orientación de ZBTB2
. ZBTB2
expresión fue derribado el uso de siRNAs en AGS y SGC7901 células. Western Blot (Fig. 5A, a-c) y análisis de PCR cuantitativo mostraron que el agotamiento de ZBTB2
por siRNA transfección podrían ser compensados ​​de manera significativa por el inhibidor de miR-149 y un aumento marcado de ZBTB2 se observó en las células transfectadas con inhibidores de miR-149 (figura 5B, p
. < 0,001). MTT ensayo muestra que la proliferación de las células transfectadas con siRNA-ZBTB2 fue suprimido y la proliferación de las células transfectadas con inhibidores de miR-149 aumentó significativamente en comparación con las células transfectadas con siRNA-NC (control) y siRNA-ZBTB2 + miR-149 (Fig. 5C ). Por otra parte, la inhibición de ZBTB2
expresión promueve G0 detención /G1 y suprime la detención del ciclo celular G0 /G1 inducida por el miR-149 en tratamiento con inhibidores de AGS y SGC7901 células en comparación con las células control NC (Fig. 5D-5E, p Hotel < 0,001). Nuestros hallazgos sugieren que el miR-149 inhibe la proliferación de células de GC y la progresión del ciclo celular mediante la inhibición de ZBTB2
expresión.

Introducción de miR-149 altera la expresión de ZBTB2 y las proteínas del ciclo celular relacionadas con el

ZBTB2 ha informado que es un potente represor de la vía de ARF-HDM2-p53-p21, que es importante en la regulación del ciclo celular (41). Para investigar la regulación de estas proteínas por el miR-149 en células GC, transfectadas las células AGS y SGC7901 con miR-149 imita o miR-NC y realizó RT-PCR y análisis de Western blot para ZBTB2 genes diana. Como se muestra en la Figura 6A-6B, la expresión ectópica de miR-149 regula a la baja la expresión de ZBTB y HDM2, y regula al alza la expresión de ARF, p53, y p21 ( p
< 0,001). Estos datos son consistentes con la función de ZBTB2 en la represión de la transcripción de ARF, p53, y p21 y la activación de la expresión de HDM2 (41). Por otra parte, la expresión ectópica de ZBTB2 por transfección invierte la reducción mediada por miR-149 en la expresión de HDM2 y el aumento de ARF, p53, p21 y la expresión en AGS y SGC7901 células (Fig. 6A-B). . ZBTB2 expresión ectópica se confirmó en AGS transfectadas y SGC7901 células (Figura S3, SGC7901 células, F = 806.365, p Hotel < 0,001; células AGS, F = 1436.300, p Hotel < 0,001). ARF, p53 y p21 promover la progresión del ciclo celular, por lo tanto, su regulación a la baja de la expresión de miR-149 imita explica la detención en la fase G0 /G1 en AGS y SGC7901 células.

Discusión

La evidencia creciente sugiere que miRNAs juegan un papel crítico en la carcinogénesis y la progresión del cáncer [21]. La alteración de los niveles de expresión de genes miARN han sido implicados en el inicio y desarrollo de tumores; modulación de miRNAs que funcionan como reguladores negativos de oncogenes o supresores tumorales resultados en la promoción de la proliferación de células de cáncer y el crecimiento [28] - [32]. Estudios anteriores han demostrado que el papel de miR-149 en la progresión de diversos tipos de tumores es controvertido [33] - [36], [38]. El patrón de expresión y los objetivos de miR-149 varían en los diferentes tipos de tumores. expresión de miR-149 es downregulated en algunos tumores, que funciona como un supresor de tumores por la orientación oncogenes en algunos tipos de cáncer. Por ejemplo, en el carcinoma renal de células claras de miR-149 es downregulated y sus posibles objetivos fueron identificados como KCNMA1 y LOX (35). Además, miR-149 también es downregulated en células de glioblastoma y se ha propuesto para actuar como un supresor de tumores por la orientación Rap1b, CD47, CCN1, y NXF1 [36]. Por el contrario, miR-149 también puede funcionar como un supresor de tumores por la orientación ciertos oncogenes. La detección de los perfiles de expresión de genes miARN en diferentes etapas clínicas de carcinoma nasofaríngeo (NPC) y NPC metástasis en ganglios linfáticos muestra que la expresión de miR-149 está regulada positivamente en la APN y la expresión de su gen diana, Smad2
, se reduce con el la progresión de la NPC [38]. Un papel oncogénico similar para el miR-149 también se observó en el melanoma en los que la regulación al alza de miR-149 provoca regulación a la baja de GSK3-α y la regulación al alza de MCL-1, lo que resulta en resistencia a la apoptosis [34]. Hasta el momento, se sabe poco sobre el papel de miR-149 en el cáncer gástrico. En este caso, nos informan de que la expresión de miR-149 se reduce notablemente en varias líneas celulares de cáncer gástrico y muestras clínicas en comparación con el normal de las células del epitelio gástrico y los tejidos normales adyacentes coincidentes, respectivamente. Es importante destacar que, el nivel de expresión de miR-149 se asocia con el grado de diferenciación de las células de GC y las muestras; pobremente diferenciadas o células GC muestras tienen una menor expresión de miR-149 en comparación con muestras bien diferenciadas. La expresión ectópica de miR-149 inhibe la proliferación de células y la progresión del ciclo celular mediante la orientación ZBTB2 Hoteles en AGS y SGC7901 células. miR-149 y expresión ZBTB2 están correlacionados negativamente en las células de GC y muestras clínicas, y la sobreexpresión de miR-149 hace que la regulación por disminución de ZBTB2
. El agotamiento de ZBTB2 como resultado la inhibición de AGS y células SGC7901 proliferación y la progresión del ciclo celular. En conjunto, estos resultados demuestran, por primera vez, que ZBTB2 puede funcionar como un oncogén en la tumorigénesis del cáncer gástrico.

Nuestros datos muestran que la introducción de miR-149 en células GC induce la detención del ciclo celular, lo que sugiere que objetivos de miR-149 pueden estar implicados en la regulación del ciclo celular. ZBTB2 es un factor de transcripción de la familia POK que puede suprimir la vía ARF-HDM2-p53-p21 [41]. ARF, un supresor de tumor [42], puede ser inducida por la estimulación mitogénica sostenido y juega un papel clave en la activación de p53 de forma independiente y el control de la estabilidad de p53 a través de la interacción con HDM2 [43], un regulador importante de p53. El supresor de tumores p53 desempeña un papel crítico en el mantenimiento de la homeostasis celular a través de la inducción de la detención del ciclo celular y la apoptosis cuando las células se someten a factores de estrés, tales como la hipoxia, el daño del ADN, y la disfunción de los telómeros [44]. p21, un gen diana p53, media la fase de detención G1 del ciclo celular a través de la unión y la inhibición de la actividad de los complejos de CDK1 [45] ciclina-CDK2 o. ZBTB2 puede reprimir la transcripción de ARF, p53, y p21, e inducir la expresión HDM2 [41]. Para validar si los efectos del ciclo celular inducida por la expresión de miR-149 es mediada por la pérdida ZBTB2, se analizó la expresión de HDM2, ARF, p53 y p21 de AGS y SGC7901 células transfectadas con el miR-149 imita. Se encontró que la expresión ectópica de miR-149 resulta en una mayor expresión de ARF, p53, y p21 y la disminución de la expresión de HDM2 y ZBTB2. Estos resultados apoyan la idea de que miR-149 ejerce su función de inhibición de la proliferación de células de GC y la progresión del ciclo celular por la orientación ZBTB2
modulando con ello la expresión de los reguladores aguas abajo de la progresión del ciclo celular.

En resumen , nuestros datos indican que miR-149 puede funcionar como un supresor de tumores en células de cáncer gástrico y desempeña un papel importante en la inhibición de ZBTB2
. Por lo tanto, la regulación negativa de miR-149 promueve la proliferación celular GC y la progresión del ciclo celular. Además, nuestros resultados muestran que ZBTB2 puede funcionar como un oncogén en el desarrollo de cáncer gástrico. Sin embargo, dado el hecho de que cada miARN puede regular muchos genes diana que pueden afectar a la carcinogénesis de diferentes maneras, se necesitan más estudios para investigar otros miR-149 objetivos que pueden tener un papel crítico en la tumorigénesis GC. El presente estudio también proporciona nuevos penetración en el papel de miR-149 en la progresión del cáncer gástrico humano e indica que el miR-149 puede servir como una diana terapéutica para el tratamiento del cáncer gástrico.

Materiales y Métodos

Declaración de Ética

Para obtener muestras de tejido, el consentimiento informado por escrito se obtuvo de los pacientes. Los procedimientos utilizados en este estudio fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional de la Cuarta Universidad Médica Militar y se ajustaban a la Declaración de Helsinki, y con la legislación local.

Líneas celulares y condiciones de cultivo

gástrico líneas de cáncer de AGS, MKN28, MKN45 fueron comprados de AGCC y, líneas celulares y GC9811 SGC7901 se obtuvieron del Instituto de Oncología de Beijing. Todas las líneas celulares se mantuvieron en nuestro instituto de acuerdo con los protocolos recomendados. Las células fueron cultivadas en medio RPMI-1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS) (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) a 37 ° C en un 5% de CO _{2 incubadora .}

muestras de seres humanos

Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional de la Cuarta Universidad médica Militar. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los especímenes de cáncer gástrico paciente samples.Human (n = 44) y las muestras no tumorales adyacentes emparejados fueron obtenidos de pacientes en el Hospital Xijing de Enfermedades Digestivas, la Cuarta Universidad Médica Militar, con el consentimiento informado de cada paciente.

purificación de ARN, síntesis de ADNc y la PCR cuantitativa (QRT-PCR) en tiempo real

El ARN total de las células cultivadas se extrajo con reactivo TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) de acuerdo con protocolo y los ARN del fabricante fueron almacenadas a -80 ° C antes de QRT-PCR análisis. expresión maduro miR-149 se detectó usando un qRT-PCR Kit mirVana TM miRNA detección (Ambion Inc. Austin, Texas), con U6 como control interno. expresión ZBTB2 se detectó con los cebadores F: 5'ACTCGGGCGAGATCCACGGC 3 ', R: 5' ACGCAGGCTGCTCATCGGAG 3 ', y GAPDH se utilizó como control interno. Los productos de PCR se separaron en un gel de agarosa 1,5% teñido con bromuro de etidio y se visualizaron con UV.

Transfección de células

El humano miR-149 duplex imitan y el inhibidor de control (miR-149) y negativo mímica oligonucleótido dúplex (miR-NC) se han diseñado y realizado por Ribobio (Guangzhou, Guangdong, china). El ARN pequeño de interferencia (siRNA) para ZBTB2 y el ARN control negativo (siRNA-NC) fueron sintetizados y purificados por Genepharma (Shanghai, China). miRNAs, siRNAs y ZBTB2 plásmido de ADNc (FulenGen Co. China) fueron transfectadas por el reactivo LipofectamineTM 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante. El ZBTB2 siRNA secuencia: F: 5 'GCUGGCUUCUUUCCAAGUU dTdT 3', R: 5 'AACUUGGAAAGAAGCCAGC 3'; La secuencia de siRNA NC: F: 5'-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT -3 ', R: 5'-ACGUGACACGUUCGGAGAATT -3'

miARN objetivo de predicción

Para encontrar posibles genes miARN, TargetScanHuman sitio web (. http://www.targetscan.org/) se utilizó, la energía libre de unión se calculó y sitios Biding se analizaron mediante http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid sitio web.

Vector construcciones y ensayo indicador de luciferasa

Para construir el plásmido ZBTB2-3'UTR, una de tipo salvaje fragmento de ARNm ZBTB2 humana 3'-UTR (1238-1244 nt, GenBank adhesión no NM_020861.1.) que contiene el putativo miR-7 secuencia de unión se amplificó por RT-PCR y se clonó en el sitio entre Xho I y Not I aguas abajo del gen indicador de luciferasa del vector psiCHECK ™ (Promega, EE.UU.). Un mutante del único sitio de unión de miR-7 (5'-GAGCCAG-3 'a 5' ACCGCGC-3 ') en el fue incluido por mutagénesis dirigida Kit (SBS Genetech, Beijing, China 3'-UTR de ZBTB2 ). Salvaje y mutantes tipos de vectores pmirGLO-ZBTB2-UTR se validaron mediante secuenciación de ADN

Las secuencias de nucleótidos de cebadores para ZBTB2-3'UTR (MT) clon: mutZBTB2F: 5'GGCCTCACAAGACAAAACAGACCGCGCAAGTAAGGACTGAAGGAGAA 3 'mutZBTB2R: 5'. TTCTCCTTCAGTCCTTACTTGCGCGGTCTGTTTTGTCTTGTGAGGCC 3 '

Las secuencias de nucleótidos de cebadores para ZBTB2-3'UTR clon (WT): ZBTB2XhoIF: 5'CCGCTCGAG ATGTCACTTATCTTTTTAAAAAACTCTCA 3' ZBTB2NotIR: 5'ATAAGAATGCGGCCGC TACTCATTTAATTAAACGTTTATTC 3 'ZBTB2XhoIF2: 5'CCGCTCGAGATGTCACTTATCTTTTTAAAAAACTCTCATTTTTACAAAGACTATC 3' ZBTB2F3: 5'CCGCTCGAG CTGTAGTTCTCCATGGCATGATAC 3 '.

las células fueron transfectadas con los imitadores de miR-149, CN y pmirGLO plásmido en placas de 24 pocillos utilizando Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones. 48 h más tarde, se recogieron las células y se analizaron para la actividad de luciferasa utilizando el Sistema Dual-Luciferase reportero de ensayo (Promega, EE.UU.) y se detectaron por el sistema de detección GloMaxTM 20/20 (E5331, Promega).

Western Blot

La proteína total a partir de células cultivadas se lisaron por tampón de lisis que contiene PMSF en hielo. A continuación, la proteína se sometieron a electroforesis a través de 12% en geles de SDS poliacrilamida y luego se transfirieron a una membrana de PVDF (Millipore). Las membranas se bloquearon con 5% de leche sin grasa en polvo a temperatura ambiente durante 1 h y se incubaron durante la noche con anticuerpos primarios. Las membranas se incubaron con anticuerpos secundarios marcados con HRP durante 1 h a temperatura ambiente después de tres lavados de 10 min en TBS-T (solución salina triethanolaminebuffered con Tween). Por último, las señales se detectaron utilizando el kit ECL (Pierce Biotech., Rockford, IL, EE.UU.) y las membranas fueron escaneados y analizados mediante un sistema de Bio-Rad ChemiDoc XRS + de imágenes con software de imágenes (versión cantidad 1). La expresión de la proteína se normalizó a una referencia endógena (actina) y en relación con el control. La escalera de la proteína de amplio espectro multicolor Spectra (Fermentas) se utilizó como marcador molecular. Todos los anticuerpos utilizados en el ensayo de western blot se enumeran en la Tabla S1.

La inmunohistoquímica y la inmunohistoquímica de puntuación

Secciones de parafina, de 4 m de espesor, se cocieron durante 2 horas a 65 ° C y deparaffinized . La recuperación del antígeno se llevó a cabo usando tampón de citrato de sodio (pH 7,2) a 95 ° C durante 15 minutos y luego portaobjetos se enfrió a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de ser tratado con peróxido de hidrógeno al 3% durante 15 minutos para bloquear la peroxidasa endógena, las secciones se trataron con suero normal de cabra confinar el líquido durante 30 minutos para reducir la unión no específica y luego policlonal de conejo anti-ZBTB2 (1:500, Bioss Co . china) se incubaron las secciones durante 12 horas a 4 ° C.Después de recalentamiento durante 1 h y se lavan por 5 veces, las secciones se incubaron con anticuerpo secundario durante 30 minutos a temperatura ambiente. Diaminobencidina (DAB) se utilizó para reacciones de color. tinción inmunohistoquímica subsiguiente se obtuvo tal como se describe anteriormente [46].

ensayo MTT

Las células fueron transfectadas con 100 nM de miR-149 inhibidor (Genepharma, Shanghai, China), imita (Ribobio, Guangzhou, Guangdong, china) o 100 nM siRNA-ZBTB2 (Genepharma) .Twenty y cuatro más tarde, las células se sembraron en placas de 96 pocillos (2 x 103 /pocillo). La viabilidad de las células se examinó mediante MTT (3-2, 5-difenil bromuro de tetrazolio) (Sigma, EE.UU.) al día durante 6 días.

ensayo del ciclo celular por citometría de flujo

El cáncer gástrico líneas celulares, AGS y SGC7901 se cultivaron en medio RPMI-1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) suplementado con 10% de SFB en placas de 6 pocillos. La transfección se lleva a cabo cuando las células alcanzaron 80 %% - 90% de confluencia. Posteriormente, se recogieron las células, se lavaron dos veces con PBS, y se fijaron en etanol al 70% a 4 ° C durante la noche. Luego, las células se incubaron con yoduro de propidio a temperatura ambiente durante 1 h y se analizaron por citometría de flujo utilizando un citómetro de flujo FACScan (BD Biosciences, Mountain View, CA). Estos datos fueron analizados mediante el uso FlowJo (FlowJo).

El análisis estadístico

Los datos se expresaron como media ± SEM de tres experimentos independientes. Para los tests estadísticos, SPSS paquete de software estadístico, version17.0 (SPSS, Chicago, IL, EE.UU.) se utilizó. La prueba t de estudiante, el ANOVA de dos vías y prueba de ANOVA de una sola vía se realizaron para ensayos de MTT, cuantitativa curva de PCR y el crecimiento del tumor. La correlación entre el miR-149 y se analizó con ZBTB2 correlación de Spearman. los valores < P 0,05 fueron considerados estadísticamente significativos

Apoyo a la Información
Figura S1.. sobre Wild-tipo y mutante ZBTB2
-3'UTR que contiene el supuesto sitio de unión de miR-149 se clonaron en el vector de psiCHECK-2. A. ZBTB2
-3'UTR se amplificó a partir de ADN genómico de la AGS. B. Carril 1,3, 5: plásmidos recombinantes de ZBTB2-1, ZBTB2-2, ZBTB2-3
respectivamente; carril 2,4,6: Resultados de la digestión enzimática de los plásmidos recombinantes de ZBTB2-1, ZBTB2-2, ZBTB2-3
respectivamente. Los resultados mostraron que ZBTB2
-1/2/3 se han insertado con éxito en los vectores (M1:. DL2000 ADN marcador; M2: DL1 kb marcador de ADN; ZTBT2-1 /2/3 bandas: 1.406 pb; Vectores bandas: 6.1 Kb). C. M1: 1 kb del marcador de ADN escalera. Carril 1: amplificación de mut ZBTB2
F1 /R1 (control negativo sin enzima Taq); Carril 2: amplificación de mut ZBTB2
F1 /R1. Una banda de mut ZBTB2 gratis (7,6 Kb) demostró el éxito de la amplificación por PCR mutante. D. Secuenciación resultados de WT ZBTB2
y MT - ZBTB2
doi:. 10.1371 /journal.pone.0041693.s001 gratis (TIF)
figura S2 . expresión ZBTB2 Hoteles en muestras de cáncer gástrico humano y los tejidos normales adyacentes emparejados. A. Las imágenes representativas se muestran en la tinción inmunohistoquímica positiva de ZBTB2 en muestras humanas de cáncer gástrico (b-c) y emparejaron los tejidos normales adyacentes (a) (magnificación × 200). B. Tinción inmunohistoquímica se obtuvo como se describe anteriormente [46]; El análisis estadístico de los datos sobre la diferencia entre la expresión ZBTB2 especímenes de cáncer gástrico humano y emparejaron los tejidos no cancerosos adyacentes (análisis de ANOVA de una vía, M = 117,280, *** p Hotel < 0,001).

• PLoS ONE: CYP2E1 RsaI /PstI polimorfismo y el cáncer gástrico Susceptibilidad: Meta-análisis basado en 24 estudios de casos y controles
• PLOS ONE: factores de susceptibilidad genética en genes implicados en la biosíntesis de hormonas esteroides Camino y del receptor de progesterona para el cáncer gástrico Riesgo